Artykuł metodologiczny

Izolacja i Walidacja Podpopulacji Komórek Macierzystych Mezenchymalnych Pozytywnych na Podoplaniny za Pomocą Pośredniej Strategii Używającej Magnesycznych Cząstek

DOI:

10.3791/71365

⸱

23 czerwca 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Joint Surgery and Sports Medicine, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, 2Biomedical Innovation Center, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę sortowania opartą na magnesowych kulkach z wykorzystaniem przeciwciał cytometrii przepływowej oznaczonych fykoerytryną (PE) i przeciwciał anty-PE w celu izolacji określonych subpopulacji komórek macierzystych mezenchymalnych o wysokiej dodatniości markera posortowania i zachowanej proliferacji/aktywności metabolicznej opartej na CCK-8 w badanych warunkach, bez konieczności stosowania drogich sorterów komórkowych lub specyficznych dla celu niestandardowych kulek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie różnorodności funkcjonalnej w komórkach mezenchymalnych opiera się na skutecznym izolowaniu określonych subpopulacji (np. komórek pozytywnych na podoplaninę (PDPN)). Jednak dla większości dostępnych komercyjnych cząstek magnetycznych do sortowania, dostępne są ograniczone bezpośrednie markery białek membranowych. Aby temu zaradzić, nasze laboratorium opracowało i przetestowało standaryzowany protokół sortowania cząstek magnetycznych oparty na zasadzie pośredniego łączenia "fluoroforem (PE) oznaczonych przeciwciał do cytometrii przepływowej/przeciwciał anty-PE do cząstek magnetycznych." Wykorzystując komórki PDPN-pozytywne jako modelową populację docelową, ten protokół wzbogaca frakcję docelową komórek bez konieczności korzystania z drogich sorterów do cytometrii przepływowej.

Badacze mogą używać zgodnych przeciwciał do cytometrii przepływowej oznaczonych fluoroforem PE, które celowają w dostępne białka powierzchni komórkowych, i łączyć je z dostępnymi komercyjnie przeciwciałami anty-PE, aby utworzyć proces sortowania dla wybranych celów po optymalizacji specyficznej dla celu. Takie podejście pozwala uniknąć długich czasów realizacji i wysokich kosztów związanych z dostosowywaniem lub zamawianiem specyficznych dla celu cząstek magnetycznych dla każdego nowego celu, co sprawia, że jest to szczególnie odpowiednie dla rzadkich lub słabo przebadanych markerów powierzchniowych. W przetestowanym tutaj systemie modelowym PDPN, protokół umożliwił wzbogacenie subpopulacji docelowej o wysokie pozytywne PDPN po posortowaniu oraz zachowanie proliferacji/aktywności metabolicznej opartej na CCK-8 w porównaniu z nieposortowanymi MSC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W dziedzinie ortopedii urazy, takie jak uszkodzenie chrząstki i zmiany w strefie bezkręgowca (strefa biała) łąkotki, często prowadzą do nieodwracalnej destrukcji stawu i utraty jego funkcji, ostatecznie prowadząc do artrozy. Jest to w dużej mierze spowodowane słabymi zdolnościami regeneracyjnymi tych tkanek, które wynikają z braku bezpośredniego unaczynienia krążenia krwi i limfy, a także obecności wysoce zróżnicowanych komórek o ograniczonych zdolnościach do proliferacji i migracji1,2,3,4. Aby zapanować nad tym wyzwaniem, zbadano różne strategiczne podejścia kliniczne, w tym stosowanie egzosomów5,6, autologiczna lub allogeniczna transplantacja chondrocytów7,8 oraz podejścia inżynierii tkankowej9,10,11,12. W ostatnich latach komórki macierzyste mezenchymalne (MSC) stały się obiecującym źródłem komórek dla regeneracyjnej naprawy, dzięki ich potencjałowi wielokierunkowego różnicowania i właściwościom immunomodulującym, oferując nowe nadzieje dla regeneracji chrząstki13,14,15,16.

Mimo swojego terapeutycznego potencjału, MSC wykazują znaczną heterogeniczność. Nawet w obrębie pojedynczego źródła tkankowego, takiego jak szpik kostny czy pępowina, odrębne subpopulacje MSC mogą wykazywać znaczne różnice w zdolnościach proliferacyjnych, potencjale wielokierunkowego różnicowania (szczególnie różnicowania chondrogenicznego) oraz funkcji regeneracyjnych in vivo17,18,19. Dlatego dokładna identyfikacja i izolacja funkcjonalnie zdefiniowanych subpopulacji MSC—takich jak te o zwiększonej zdolności chondrogenicznej—jest istotna dla poszerzenia naszego rozumienia ich biologicznych właściwości i poprawy skuteczności naprawy chrząstki. Stanowi to krytyczny krok w naszych badaniach.

W miarę postępu badań, coraz więcej nowych białek membranowych zostało zidentyfikowanych jako markery funkcjonalnie odrębnych subpopulacji MSC. Jednak przełożenie tych odkryć na skuteczne strategie sortowania komórek pozostaje technicznie trudne. Konwencjonalne sortowanie komórek oparte na aktywacji fluorescencji (FACS), choć potężne, wymaga specjalistycznego sprzętu i znajomości technik, co ogranicza dostępność w wielu laboratoriach. Z drugiej strony, sortowanie immunomagnetyczne komórek—choć częściej stosowane—jest ograniczone przez ograniczoną dostępność komercyjnych reagentów, które są przede wszystkim zaprojektowane dla kilku dobrze uznanych celów membranowych. W konsekwencji, dla wielu nowo odkrytych markerów o potencjalnym znaczeniu biologicznym, nie ma komercyjnie dostępnych magnetycznych perełek, co utrudnia specyficzne wzbogacanie tych cennych subpopulacji MSC.

Aby pokonać tę ograniczność, niniejsze badanie ma na celu ustanowienie i standaryzację elastycznego, niedrogiego i efektywnego protokołu pozytywnej selekcji komórek. Podejście to opiera się na pośrednim sprzęganiu komercyjnie dostępnych przeciwciał sprzężonych z fykoerytryną (PE) z immunomagnetycznymi perłami przeciwko PE. Poprzednie raporty wykazały, że MSC dodatnie na podopłaninę (PDPN+) posiadają lepsze utrzymanie właściwości macierzystych i zdolności różnicowania w porównaniu z ich odpowiednikami PDPN-20. Ponadto, zaangażowanie PDPN+ MSC w regeneracji chrząstki i progresję osteoartrozę (OA) zostało udokumentowane w literaturze21,22. Wykorzystując podopłaninę (PDPN)—niedawno zidentyfikowany kandydat do markera funkcjonalnych subpopulacji MSC—jako modelowy cel, przeprowadziliśmy sortowanie komórek dodatnich na PDPN z pochodzących z szpiku kostnego MSC. Przedstawiamy szczegółowy, krokowy protokół obejmujący przygotowanie pojedynczej suspensji komórkowej, oznaczanie przeciwciałami i perłami magnetycznymi oraz separację magnetyczną. Ponadto oceniamy wydajność, dodatniość PDPN po sortowaniu i proliferację/aktywność metaboliczną opartą na CCK-8 posortowanych komórek. Standaryzując ten protokół, dążymy do zapewnienia badaczom wszechstronnej, dostępnej metody izolacji subpopulacji docelowych komórek za pomocą zgodnych przeciwciał przeciwko dostępnym markerom powierzchni komórkowych, ułatwiając w ten sposób fundamentalne badania nad komórkami macierzystymi i przyszłe zastosowania translacyjne w medycynie regeneracyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozyskiwane komórki MSC pochodzenia ludzkiego z rdzenia kostnego były dostępne w sprzedaży komercyjnej (zobacz Tabela Materiałów). Dostawca potwierdził tożsamość MSC przez dodatnie występowanie CD73, CD90 i CD105; ujemne występowanie CD34, CD45 i HLA-DR; oraz potencjał różnicowania się w trzech liniach. Komórki były rozmnażane w hodowli i używane na przedziale przepływów 3–5. Wszystkie prace z komórkami pochodzenia ludzkiego były wykonywane w klasie II biosafety cabinet w sterylnych warunkach. Ponieważ komórki były pozyskane komercyjnie i nie były bezpośrednio rekrutowane ani pobrane od osób, nie wymagano bezpośredniej aprobaty IRB.

1. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek

UWAGA: Jakość zawiesiny pojedynczych komórek ma bezpośredni wpływ na wydajność sortowania. Upewnij się, że komórki są dobrze rozproszone, wysoce żywotne i wolne od skupień. Widoczne skupienia powinny być rozproszone przez wielokrotne łagodne pipetowanie, aż skupienia już nie będą widoczne.

  1. Wybierz MSC (przedziały przepływów 3–5), które osiągnęły 80–90% konfluencji. Odłóż medium kulturowe.
  2. Przepłucz komórki 2 razy po 10 mL przegrzanego PBS. Lekkie potrząśnij naczyniem i odłóż PBS.
  3. Dodaj 2 mL 0,25% Trypsyny-EDTA i inkubatoruj w 37 °C przez 3–5 min. Obserwuj komórki pod mikroskopem, aż zaokrąglą się i zaczynają się odczepiać.
  4. Dodaj 4 mL medium kulturowego zawierającego 16,5% FBS (zobacz Tabela Materiałów), aby zneutralizować trypsynę. Lekkie pipetowanie komórek, aby zapewnić całkowite oderwanie. Przenieś zawiesinę komórek do 15 mL rurkę do wirowania.
    UWAGA: Sprawdź pod mikroskopem, aby potwierdzić, że wszystkie komórki zostały zebrane.
  5. Wiruj przez 300 xg przez 3 min i odłóż nadstan.
  6. Zawieś ponownie pellet komórek w 1 mL Buforu (zobacz Tabela Materiałów). Przejdź do liczenia komórek.

2. Liczenie komórek i regulacja stężenia

UWAGA: Jeśli łączna liczba komórek jest mniejsza niż 1 x 107, nadal dodaj przeciwciała i reaktywów magnetycznych na podstawie standardowej objętości dla 1 x 107 komórek, aby zapewnić wydajność oznaczania.

  1. Wiruj zawiesinę komórek ponownie przez 300 xg przez 3 min i odłóż nadstan.
  2. Zawieś komórki w Buforze, aby osiągnąć gęstość 1 x 108 komórek/mL.
    UWAGA: Na przykład, aby przetworzyć 1 x 107 komórek, zawieś pellet w 100 μL buforu.
  3. Przenieś zawiesinę komórek do 5 mL rurkę z dnem zaokrąglonym z polistyrenu.

3. Oznakowanie przeciwciałami

  1. Dodaj 10 μL Blokującego Fc gamma RII (zobacz Tabela Materiałów) na 1 x 107 komórek. Lekkie mieszanie i inkubacja w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  2. Dodaj 5 μL PE-konjugowanego przeciwciała przeciwko ludzkiemu PDPN (zobacz Tabela Materiałów) na 1 x 107 komórek, zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi stężenia. Lekkie mieszanie i inkubacja w temperaturze pokojowej przez 15–20 min, chronione przed światłem.
    UWAGA: Objętość przeciwciała powinna być dostosowana zgodnie z kartą danych konkretnego przeciwciała cytometrii przepływowej, ponieważ stężenia mogą się różnić między produktami.

4. Oznakowanie kulkami magnetycznymi

UWAGA: Przed użyciem wszystkie reagenty powinny być trzymane na lodzie i natychmiast zwrócone na lód po każdym dodaniu, aby zachować aktywność i spójność.

  1. Dodaj 10 μL Koktajlu Selekcyjnego na 1 x 107 komórek (zobacz Tabela Materiałów). Lekkie mieszanie i inkubacja w temperaturze pokojowej przez 15 min.
  2. Dodaj 5 μL kulek magnetycznych na 1 x 107 komórek (zobacz Tabela Materiałów). Lekkie mieszanie i inkubacja w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    UWAGA: Silnie wstrząśnij fiolkę z kulkami magnetycznymi przez 30 s przed użyciem, aby zapewnić równomierne rozproszenie.

5. Separacja magnetyczna

  1. Umieść rurkę z 5 mL polistyrenowym dnem zaokrąglonym zawierającą próbkę oznakowaną komórką w stojaku do separacji magnetycznej (zobacz Tabela Materiałów).
  2. Dodaj bufor do rurki, aby uzyskać łączną objętość 2,5–3 mL. Inkubacja przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  3. Przeprowadź separację: Trzymaj magnes i rurkę razem jako jedną jednostkę, odwróć je, aby wylać nadstan do nowej rurki do zbioru. Ta odzyskana frakcja zawiera komórki PDPN-negatywne; trzymaj

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólna zasada i przebieg eksperymentu przedstawiono na Rysunku 1. Wszystkie kolejne dane eksperymentalne są oparte na komórkach przejścia 5. Po separacji magnetycznej, uzyskane komórki PDPN+ były kultywowane przez 24–48 h. Po wymianie pożywki kulturalnej w celu usunięcia nieadherentnych komórek i potencjalnych pozostałych kulek magnetycznych (Rysunek 2A), oceniliśmy efektywność sortowania i wydajność komórek. Rozpoczynając od początkowej populacji

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu opracowałeśmy protokół oparty na magnetycznych kulkach do izolowywania komórek PDPN+ z komórek mezenchymalnych pochodzenia rdzennego. Podejście to umożliwia efektywne wzbogacanie subpopulacji PDPN-dodatnich przy zachowaniu proliferacji/aktywności metabolicznej opartej na CCK-8 w badanych warunkach.

W porównaniu z konwencjonalnymi metodami bezpośredniego immunomagnetycznego sortowania, największą zaletą tej strategii jest jej wszechstronność. Tradycyjne podejścia wymagają o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konfliktów interesów do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność Profesorowi Bian Limowi i Profesorowi Zhang Kunyu z Wydziału Nauk i Inżynierii Biomedycznych, Międzynarodowego Kampusu, Południowego Uniwersytetu Nauki i Techniki w Chinach, za zapewnienie platformy eksperymentalnej i wskazówek. Praca ta była wspierana przez Chińską Fundację Nauki Postdoktoralnej (2023M734022), Fundację Badań Podstawowych i Stosowanej Badań Podstawowych GuangDong (2023A1515111162) oraz Narodową Fundację Nauki Przyrodniczej Chin (82502983).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
7-AAD Cell Viability Assay KitKeyGENKGD1202-50
Anti-human CD32 Blocker (Fc gamma RII Blocker)STEMCELL Technologies18520
BufferSTEMCELL Technologies20104Bufor
CCK-8MeilunbioMA0218-5
Dextran Magnetic ParticlesSTEMCELL Technologies50100Magnetyczne cząstki
Fetal Bovine SerumGibco16050-122
MagnetSTEMCELL Technologies18000Stojak do separacji magnetycznej
MEM Alpha MediumGibcoC12571500BTMEM Alpha Medium (82,5%) + FBS (16,5%) + Penicylina-Streptomycyna (1,0%)
MSCsKeyGENKGG5575-1Ludzkie komórki macierzyste mezenchymalne pochodzenia szpiku kostnego
PE-conjugated Anti-Human PDPN AntibodyABclonalA26770PDPN-PE
PE Selection CocktailSTEMCELL Technologies18151Koktajl do selekcji
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Trypsin-EDTAGibco25200-072

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mezenchymalne kom rki macierzystekom rki dodatnie podoplaninsortowanie za pomoc kulek magnetycznychpo rednie kulki magnetyczneizolacja subpopulacji kom rekprzeciwcia a do cytometrii przep ywowejmikroresztki anty PEwzbogacanie marker w powierzchniowychschemat sortowania kom rekheterogeniczno funkcjonalna

Powiązane artykuły