Ilościowe oznaczanie cytotoksyczności komórek NK potencjalizowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Komórki natural killer (NK) są wrodzonymi limfocytami, które odgrywają krytyczną rolę w ochronnej odporności przeciwko różnym patogenom wewnątrzkomórkowym i rakiem. Ich główną funkcją jest zabijanie komórek docelowych, które są zakażone, złośliwie przekształcone lub pokryte przeciwciałami poprzez cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC). Komórki NK mogą być również genetycznie modyfikowane tak, aby wyrażały chimeryczne receptory antygenowe (CAR), które umożliwiają selektywne rozpoznawanie określonych antygenów. Ilościowe pomiary cytotoksyczności komórek NK są niezbędne do oceny początkowej funkcjonalności oraz do przedklinicznej ewaluacji przeciwciał monoklonalnych i strategii inżynierii CAR. Jednak in vitro testy funkcjonalne nadal są bardzo różnorodne w różnych laboratoriach z powodu różnic w przygotowaniu komórek, komórkach docelowych, proporcjach efektor-cel oraz czasach współinkubacji i metodach pomiarów, co ogranicza powtarzalność i możliwość porównywania różnych badań. W tym artykule przedstawiono znormalizowany protokół ilościowej oceny cytotoksyczności komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej i obrazowania na żywo w czasie rzeczywistym. Pierwotne ludzkie komórki NK i komórki NK-92 wyrażające CAR były oceniane pod kątem ich zdolności do zabijania komórek nowotworowych i komórek pokrytych przeciwciałami w formacie 96-dołkowej płytki w celu zmierzenia naturalnej cytotoksyczności, zabijania za pośrednictwem CAR i ADCC. Przeżywalność komórek docelowych była mierzona ciągle za pomocą obrazowania na żywo lub w określonym punkcie czasowym za pomocą cytometrii przepływowej, co również umożliwiało charakteryzację fenotypową komórek NK i komórek docelowych. Te protokoły zapewniają solidną ramę za pomocą rutynowych metod hodowli tkankowej, obrazowania i cytometrii przepływowej, aby umożliwić powtarzalne ilościowe określenie funkcji efektorowych komórek NK w badaniach nad wrodzoną odpornością i immunoterapiami opartymi na komórkach NK.

Wprowadzenie

Komórki Natural Killer (NK) są wrodzonymi limfocytami, które odgrywają kluczową rolę w nadzorze immunologicznym przeciwko wirusowo zakażonym i złośliwym komórkom, wykazując szybką i silną cytotoksyczność¹. W przeciwieństwie do komórek B i T, komórki NK nie wykazują receptorów antygenowo-specyficznych i zamiast tego polegają na szeregiem receptorów aktywacyjnych i hamujących w celu wykrycia utraty ekspresji głównego zespołu zgodności tkankowej klasy I lub stresu komórkowego. Umożliwia im to mediację bezpośredniej cytotoksyczności poprzez uwolnienie granule cytotoksycznych zawierających perforację i granzymy lub, w niektórych przypadkach, poprzez aktywację receptorów śmierci^1,2,3,4. Oprócz naturalnej cytotoksyczności, komórki NK wykazują FcγRIII (CD16), receptor, który rozpoznaje fragment Fc immunoglobuliny G (IgG) i wpływa na cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) przeciwko komórkom docelowym pokrytym IgG^5,6.

Ze względu na swoje wrodzone mechanizmy cytotoksyczne i korzystny profil bezpieczeństwa, komórki NK stały się obiecującymi kandydatami do immunoterapii komórkowej. Dzięki potencjałowi zastosowania allogenicznego, komórki NK mogą funkcjonować jako terapia "pod ręką" z minimalnym ryzykiem choroby przeszczepu przeciw gospodarzowi, umożliwiając szersze zastosowanie kliniczne i obniżając koszty⁷. Ostatnie osiągnięcia dalece poszerzyły terapeutyczny potencjał komórek NK poprzez strategie inżynierii genetycznej, w tym wprowadzanie chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) które przekierowują komórki NK do rozpoznawania specyficznych antygenów nowotworowych. CAR-NK wykazały skuteczność przeciwnowotworową w in vivo modelach ksenograftu i badaniach klinicznych, z mniejszą toksycznością w porównaniu z komórkami CAR-T^8,9,10. Dlatego wzrasta zainteresowanie rozwijaniem inżynieryjnych platform dla komórek NK i strategii terapeutycznych opartych na przeciwciałach. W tym kontekście, dokładne i ilościowe pomiary zdolności do zabijania komórek NK są niezbędne do zrozumienia biologii komórek NK, oceny skuteczności CAR lub innych inżynieryjnych terapii komórek NK oraz oceny przeciwciał monoklonalnych, które polegają na ADCC.

Różnorodne in vitro metody były szeroko stosowane w laboratoriach w celu oceny cytotoksyczności komórek NK. Typowymi metodami są testy uwalniania radioaktywnego chromu-51, testy uwalniania dehydrogenazy mleczanowej oraz testy uwalniania kalceiny-acetoksymetylowej^11,12. Chociaż te tradycyjne metody były szeroko stosowane do pomiaru cytotoksyczności, opierają się na pośrednich wskaźnikach śmierci komórkowej, dostarczają pomiarów końcowych zamiast danych kinetycznych oraz oferują ograniczoną czułość i zakres dynamiczny. Nie dostarczają również informacji o fenotypie lub stanie aktywacji komórek efektorowych. Ostatnio, platformy obrazowania żywych komórek i cytometria przepływowa są coraz częściej stosowane, ponieważ umożliwiają bezpośrednie ilościowe pomiary przeżycia komórek docelowych, monitorowanie zabijania w czasie oraz jednoczesną analizę fenotypową komórek efektorowych i docelowych^13,14. Jednak nawet wśród tych nowszych podejść istnieje znaczna zmienność między laboratoriami i opublikowanymi badaniami, w tym różnice w przygotowaniu komórek docelowych, stosunkach efektor-do-cel (E:T) i czasach współinkubacji, co ogranicza powtarzalność i porównania między badaniami, szczególnie w ocenach przedklinicznych immunoterapii opartych na komórkach NK.

Niniejszy artykuł przedstawia standaryzowany proces ilościowej oceny cytotoksyczności komórek NK przy użyciu dwóch niezależnych, uzupełniających się platform: obrazowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym (IncuCyte SX5) oraz testy końcowe oparte na cytometrii przepływowej. Obrazowanie żywych komórek umożliwia ciągłe monitorowanie przeżycia komórek docelowych podczas współhodowli z komórkami efektorowymi, pozwalając na kinetyczną ocenę cytotoksyczności w wielu stosunkach E:T i warunkach eksperymentalnych przy minimalnym manipulowaniu testem¹⁵. W przeciwieństwie do cytometrii przepływowej, która dostarcza wysoce wrażliwej pomiaru końcowego śmierci komórek docelowych, wraz z jednoczesną charakterystyką fenotypową komórek NK i komórek docelowych przy użyciu panelu barwników wielomarkerowych.

Dodatkowo, ten protokół uwzględnia standaryzowane parametry eksperymentalne, w tym stosunki E:T, warunki inkubacji, format płytki i przepływy analityczne, aby poprawić powtarzalność i ułatwić porównanie pomiarów cytotoksyczności między laboratoriami i badaniami. Proces umożliwia ilościową ocenę wielu funkcji efektorowych NK, w tym naturalnej cytotoksyczności, zabijania z pośrednictwem CAR oraz ADCC, i jest kompatybilny z pierwotnymi ludzkimi komórkami NK i liniami komórek NK.

Protokół

Wykorzystanie próbek od ludzkich dawców do celów badawczych zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną i przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi (Zatwierdzenie nr 2022P000699).

1. Analiza zabijania z obrazowaniem żywych komórek w czasie rzeczywistym

1. Powlekanie płytek
   1. Do studzienek w układzie 6 × 10 na płaskodنnej płytce 96-dołkowej dodać 50 µL/studzienkę poli-D-lizyny (0,1 mg/mL w buforze fosforanowym [PBS]). Delikatnie potrząsnąć płytką, aby upewnić się, że dno każdej studzienki jest całkowicie pokryte.
   2. Inkubować płytkę przez 2 h w temperaturze pokojowej (RT; 18°C–26°C) z zamkniętą pokrywą.
   3. Przemyć studzienki 3× 200 µL/studzienkę PBS i odpić nadsącz.
      UWAGA: Powlekane płytki można uszczelnić parafilmem i przechowywać w temperaturze 4°C do 1 tygodnia, dodając do każdej studzienki 200 µL PBS. Przed użyciem należy upewnić się, że płytki pozostały sterylne, usunąć PBS i pozwolić im osiągnąć temperaturę RT.
2. Przygotowanie komórek docelowych
   1. Przygotować 10 mL 2× roztworu SYTOX Orange (200 nM) poprzez rozcieńczenie roztworu stokowego SYTOX Orange (250 µM w DMSO) w pożywce hodowlanej NK-92 (dodać 8 µL roztworu stokowego do całkowitej objętości 10 mL) w 15-ml probówce wirówkowej z dnem stożkowym.
      UWAGA: Pożywka hodowlana dla komórek NK-92 składa się z pożywki Advanced RPMI-1640, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-alanylo-L-glutaminy, 100 µg/mL primocyny oraz 500 U/mL ludzkiej IL-2.
      OSTRZEŻENIE: SYTOX Orange jest barwnikiem fluorescencyjnym i może stwarzać zagrożenie w przypadku kontaktu ze skórą lub oczami. Należy go używać z odpowiednimi środkami ochrony osobistej i zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa.
   2. Policzyć komórki docelowe, stosując metodę z wykluczeniem barwnika (np. błękit trypanu) lub równoważną zwalidowaną metodę (np. automatyczny licznik komórek).
      UWAGA: W tym badaniu komórkami docelowymi były komórki Ramos, linia komórkowa chłoniaka z komórek B wykazująca ekspresję antygenu dojrzewania komórek B (BCMA⁺), które zmodyfikowano tak, aby eksprimowały białko fluorescencyjne bliskiej podczerwieni (NIR) emiRFP670.
   3. Przenieść wymaganą ilość komórek do 15-ml probówki wirówkowej z dnem stożkowym.
   4. Wirować (5 min, 300 × g, RT, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [brake] = maksymalne).
   5. Odpić nadsącz.
   6. Resuspendować komórki docelowe do końcowego stężenia 2,5 × 10⁵ komórek/mL (2,5 × 10⁴ komórek/100 µL) w pożywce z 2× SYTOX Orange.
      UWAGA: Resuspendowane komórki docelowe można utrzymać w temperaturze 37°C z 5% CO₂ w probówce do 30 min podczas przygotowywania rozcieńczeń komórek efektorowych.
      UWAGA: Dla jednej pełnej płytki: 60 studzienek × 2,5 × 10⁴ komórek/studzienkę = 1,5 × 10⁶ całkowitej liczby komórek docelowych. Przygotować 2,0 × 10⁶ komórek, aby uwzględnić straty. Dostosować liczbę komórek w zależności od wielkości testu i pożądanej gęstości wysiewu.
3. Przygotowanie komórek efektorowych
   1. Ocenić stężenie i żywotność komórek NK-92 za pomocą metody z wykluczeniem barwnika (np. błękit trypanu) lub równoważnej zwalidowanej metody. Kontynuować procedurę tylko jeśli żywotność wynosi ≥80%, ponieważ niższa żywotność może wpłynąć na wyniki testu.
      UWAGA: Jako komórki efektorowe zastosowano komórki NK-92 zmodyfikowane do stabilnej ekspresji białka fluorescencyjnego ZsGreen, albo samodzielnie (kontrola), albo wraz z konstruktami CAR skierowanymi przeciwko BCMA.
   2. Policzyć i przenieść wymaganą liczbę komórek do oddzielnych 15-ml probówek wirówkowych z dnem stożkowym.
      UWAGA: Obliczyć całkowitą liczbę wymaganych komórek efektorowych, sumując liczbę komórek potrzebnych dla wszystkich stosunków E:T dla jednej repliki, mnożąc przez liczbę replik i dodając 50% nadwyżki na poczet strat komórek. Zaokrąglić liczby w celu ułatwienia przygotowania. Na przykład dla stosunków E:T od 2:1 do 0,25:1 użyć 1,5 × 10⁵ komórek NK na replikę. Dla powtórzeń trzykrotnych przygotować 4,5 × 10⁵ komórek na warunek, zgodnie z układem płytki opisanym na Supplemental Figure 1A.
   3. Wirować komórki (5 min, 300 × g, RT, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [brake] = maksymalne).
   4. Odpić nadsącz.
   5. Resuspendować komórki do końcowego stężenia 5,0 × 10⁵ komórek/mL (5,0 × 10⁴ komórek/100 µL).
4. Przygotowanie rozcieńczeń komórek efektorowych
   1. Przygotować rozcieńczenia komórek efektorowych, w tym kontrolę z samymi komórkami docelowymi, na okrągłodniennej płytce 96-dołkowej (reprezentatywny układ płytki z czterema warunkami w trzech powtórzeniach znajduje się na Supplemental Figure 1A). Każdy warunek przygotowuje się w trzech powtórzeniach.
   2. Dodać 240 µL/studzienkę komórek efektorowych (5,0 × 10⁵ komórek/mL) do studzienek odpowiadających stosunkowi E:T wynoszącemu 2:1.
   3. Dodać 120 µL/studzienkę pożywki do wszystkich pozostałych studzienek.
   4. Wykonać 2-krotne rozcieńczenia seryjne od studzienek E:T = 2:1 do studzienek E:T = 0,25:1. Wymieszać dokładnie poprzez pipetowanie ≥5 razy i zmieniać końcówki między przeniesieniami.
      UWAGA: Jeśli sesje obrazowania nie zostały jeszcze zaplanowane w systemie obrazowania, należy to zrobić przed przygotowaniem ko-kultury. Przygotowane rozcieńczenia komórek efektorowych można utrzymać w temperaturze 37°C z 5% CO₂ na okrągłodniennej płytce 96-dołkowej do 30 min podczas konfiguracji systemu obrazowania żywych komórek.
5. Przygotowanie ko-kultury
   1. Pobrać powlekaną poli-D-lizyną płaskodnną płytkę 96-dołkową.
   2. Do wszystkich studzienek dodać 100 µL/studzienkę zawiesiny komórek docelowych. Komórki docelowe należy dokładnie resuspendować bezpośrednio przed dozowaniem poprzez pipetowanie w górę i w dół ≥5 razy za pomocą odpowiedniej pipety (np. 200 µL) i unikać powstawania pęcherzyków powietrza podczas przenoszenia.
   3. Do odpowiednich studzienek dodać 100 µL/studzienkę zawiesiny komórek efektorowych. Komórki efektorowe należy dokładnie resuspendować bezpośrednio przed dozowaniem poprzez pipetowanie w górę i w dół ≥5 razy za pomocą odpowiedniej pipety (np. 200 µL) i unikać powstawania pęcherzyków powietrza podczas przenoszenia.
   4. Do otaczających, niewykorzystanych studzienek dodać 200 µL/studzienkę PBS.
   5. Wirować płytkę (2 min, 100 × g, RT, przyspieszenie = niskie [np. 2]; hamowanie [brake] = niskie [np. 2]).
      UWAGA: To łagodne wirowanie jest kluczowe dla szybkiego i równomiernego osadzenia komórek na dnie studzienek w celu dokładnego obrazowania w systemie IncuCyte SX5. Stosujemy laboratoryjną wirówkę Eppendorf 5810R kompatybilną z rotorem z koszykami wahadłowymi, z ustawieniami przyspieszenia i hamowania na poziomie 2 (z 9).
   6. Umieścić płytkę w systemie obrazowania żywych komórek i pozyskiwać obrazy co 1 h przez 24 h (możliwość przedłużenia do 72 h, jeśli jest to wymagane). Upewnić się, że obrazowanie odbywa się w standardowych warunkach inkubacji (37°C/5% CO₂).
      UWAGA: Aby obrazowanie w czasie t = 0 h dokładnie odzwierciedlało bazową liczbę komórek docelowych, należy rozpocząć akwizycję obrazów w ciągu 10–15 min po przygotowaniu ko-kultury i wirowaniu. Dla pełnej płytki z trzema kanałami obrazowania (tj. zielonym, pomarańczowym i NIR), czas skanowania wynosi około 10 min na godzinę dla 3 obrazów/studzienkę przy powiększeniu 20×.
   7. Zweryfikować jakość obrazu po pierwszym skanowaniu i w razie potrzeby skorygować ustawienia.
6. Ustawienia instrumentu
   1. Ustawić rozdzielanie spektralne (spectral unmixing), aby skorygować przenikanie fluorescencji SYTOX Orange do kanału zielonego. Dostosować wartość rozdzielania w oprogramowaniu, porównując kanał zielony i pomarańczowy i potwierdzając, że martwe komórki Orange⁺ nie są błędnie wykrywane jako Green⁺. Dla reprezentatywnego eksperymentu (Rycina 1) wkład kanału pomarańczowego do kanału zielonego ustawiono na 8,5%. Wartości te są specyficzne dla zestawu danych i powinny być optymalizowane dla każdego eksperymentu.
   2. Skonfigurować analizę Cell-by-Cell dla komórek nieprzylegających, aby zapewnić dokładną segmentację i maskowanie wszystkich komórek w każdym polu widzenia (reprezentatywna konfiguracja znajduje się na Supplemental Figure 1B). Dla systemu obrazowania żywych komórek z wykorzystaniem modeli linii komórek efektorowych i docelowych w zawiesinie zaleca się następujące parametry:
      1. Ustawić oczekiwaną średnicę obiektu na 15 µm (przybliżona średnica komórki).
      2. Ustawić czułość progu (threshold sensitivity) i czułość tekstury (texture sensitivity) na 5.
      3. Ustawić czułość krawędzi (edge sensitivity) na 10, aby ułatwić rozdzielanie skupisk komórek.
      4. Ustawić zakres filtra powierzchni zaakceptowanego obiektu na 50–2000 µm², aby wykluczyć zanieczyszczenia i duże obiekty.
      5. Ustawić maksymalną ekscentryczność na 0,95, aby wykluczyć obiekty niekomórkowe.
   3. Skonfigurować progi klasyfikacji (reprezentatywne bramkowanie znajduje się na Supplemental Figure 1C). Użyć studzienek kontrolnych z samymi komórkami docelowymi do zdefiniowania bazowej populacji żywych komórek docelowych NIR⁺/Orange⁻. Następnie użyć studzienek ko-kultury w późniejszych punktach czasowych (np. t = 4 h), aby potwierdzić wyraźne oddzielenie z minimalnym nakładaniem się populacji NIR⁺/⁻ i Orange⁺/⁻. Przykładowe progi klasyfikacji i parametry analizy przedstawiono na Supplemental Figure 1C.
      1. Ustawić próg intensywności Orange na około 15.
      2. Ustawić próg intensywności NIR na około 0,1.
         UWAGA: Wartości parametrów i progów mogą się różnić w zależności od instrumentu, oprogramowania, modelu linii komórkowej oraz intensywności sygnału fluorescencyjnego.
         UWAGA: Niniejszy protokół można dostosować do testów cytotoksyczności lub ADCC pierwotnych ludzkich komórek NK, jeśli komórki docelowe stabilnie eksprimują fluorescencję NIR (np. emiRFP670). Można go również dostosować do testów zabijania opartych na cytometrii przepływowej, pomijając powlekanie poli-D-lizyną i stosując płaskodenne lub okrągłodnienne płytki 96-dołkowe.

Rycina 1. Ilościowe określanie kinetyki i siły cytotoksyczności komórek NK-92 z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym. (A) Schematyczny przegląd testu obrazowania żywych komórek w systemie IncuCyte do monitorowania cytotoksyczności pośredniczonej przez komórki NK. Komórki docelowe Ramos BCMA⁺ wykazujące ekspresję emiRFP670 (kanał bliskiej podczerwieni [NIR]) są współhodowane z komórkami efektorowymi NK-92 wykazującymi ekspresję ZsGreen (kanał zielony), a śmierć komórek jest wykrywana przy użyciu SYTOX Orange (kanał pomarańczowy). (B) Reprezentatywny obraz fluorescencyjny dołka z współhodowlą przy stosunku efektorów do komórek docelowych (E:T) 1:1 po 12 h. Żywe komórki docelowe (emiRFP670⁺) są pokazane na niebiesko, komórki efektorowe NK-92 (ZsGreen⁺) na zielono, a martwe komórki (SYTOX Orange⁺) na czerwono. Obrazy pozyskano za pomocą modułu analizy Cell-by-Cell dla komórek nieadherentnych przy powiększeniu 20×. Pasek skali = 100 µm. (C) Ilościowe określenie wzrostu i przeżywalności komórek docelowych w czasie przy różnych stosunkach E:T dla komórek NK-92 kontrolnych oraz wykazujących ekspresję CAR. (D) Ilościowe określenie przeżywalności komórek docelowych w funkcji stosunku E:T w wielu punktach czasowych (4, 8, 16 i 24 h). Liczbę komórek docelowych znormalizowano względem dołków zawierających tylko komórki docelowe (E:T = 0:1) w każdym punkcie czasowym. (E) Schematyczne przedstawienie wskaźników ilościowych użytych do oceny cytotoksyczności: KR₅₀ – stosunek efektorów do komórek docelowych wymagany do osiągnięcia 50% zabicia po 12 h; KT₅₀ – czas wymagany do osiągnięcia 50% zabicia przy stosunku E:T 1:1; oraz IKI₅₀ – zintegrowany indeks zabijania, zdefiniowany jako pole powierzchni mapy ciepła poniżej izokliny 50% przeżywalności. (F) Mapy ciepła przedstawiające wzrost i przeżywalność komórek docelowych w funkcji stosunku E:T i czasu dla każdego stanu efektora. Wartości ilościowe dla KR₅₀, KT₅₀ i IKI₅₀ są wskazane dla każdego stanu. Surowe liczby żywych komórek docelowych uzyskano z bramkowanej populacji NIR⁺/SYTOX Orange^– przy użyciu analizy klasyfikacji Cell-by-Cell w oprogramowaniu IncuCyte 2021C. Wszystkie warunki przeprowadzono w trzech powtórzeniach (n = 3). Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe. Do modelowania trendów cytotoksyczności na panelach D i F zastosowano nieliniową analizę regresji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Ilościowe oznaczenie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał metodą cytometrii przepływowej

1. Przygotowanie pierwotnych ludzkich komórek NK
   UWAGA: Pierwotne ludzkie komórki NK izolowano z krwi obwodowej wzbogaconej w leukocyty, pobranej od zdrowych dorosłych dawców, stosując metodę wzbogacania w komórki NK, a następnie wirowanie w gradiencie gęstości, zgodnie z wcześniejszym opisem³. Oczyszczone komórki NK kriokonserwowano w stężeniu 5 × 10⁶ komórek/mL w roztworze do mrożenia (90% FBS i 10% dimetylosulfotlenku [DMSO]) w alikwotach 0,5 mL w krioprobówkach i przechowywano w temperaturze poniżej −150°C do momentu użycia³.
   1. Rozmrozić jedną probówkę zawierającą 5 × 10⁶ pierwotnych ludzkich komórek NK, delikatnie potrząsając krioprobówką w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez około 1 min, aż pozostanie tylko mały kryształek lodu.
      OSTRZEŻENIE: Wszystkie próbki pochodzenia ludzkiego należy traktować zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa biologicznego i stosować osobiste środki ochrony indywidualnej zgodnie z wytycznymi instytucji.
      OSTRZEŻENIE: DMSO ułatwia wchłanianie chemikaliów przez skórę. Należy stosować odpowiedni sprzęt ochronny i unikać bezpośredniego kontaktu.
   2. Przenieść rozmrożone komórki do 15-ml probówki wirówkowej z dnem stożkowym zawierającej 10 mL podgrzanej (37°C) pożywki do hodowli komórek NK i wymieszać poprzez delikatne wirowanie.
      UWAGA: Pożywka do hodowli komórek NK składa się z Advanced RPMI-1640 uzupełnionej o 10% FBS, 10% ludzką surowicę AB, 2 mM L-alanylo-L-glutaminy, 100 µg/mL primocinu oraz 50 U/mL ludzkiej IL-2.
   3. Odwirować komórki (5 min, 300 × g, RT, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [brake] = maksymalne).
   4. Usunąć nadsącz.
   5. Resuspendować osad w 5 mL podgrzanej (37°C) pożywki do hodowli komórek NK.
   6. Odwirować komórki (5 min, 300 × g, RT, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [brake] = maksymalne).
   7. Usunąć nadsącz.
   8. Resuspendować osad w 1 mL podgrzanej pożywki do hodowli komórek NK.
   9. Przenieść zawiesinę do jednej dołki 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek.
   10. Dodać 1 mL sterylnego PBS do sąsiednich dołek, aby zminimalizować parowanie.
   11. Inkubować płytkę 24-dołkową pod kątem 45° (używając statywu do płytek lub podpór w celu utrzymania kąta) w temperaturze 37°C przy 5% CO₂ przez 16–24 h, aby umożliwić regenerację komórek NK.
       UWAGA: Pierwotne ludzkie komórki NK wymagają bliskiego kontaktu komórka-komórka dla maksymalnego przeżycia i regeneracji, co można osiągnąć poprzez przechylenie płytki 24-dołkowej i umożliwienie gromadzenia się komórek przy krawędziach dołek. Należy zachować spójny czas inkubacji we wszystkich eksperymentach.
       UWAGA: Po okresie regeneracji przejść bezpośrednio do przygotowania komórek docelowych i ustawienia kokultury.
2. Barwienie komórek docelowych estrem karboksyfluoresceiny sukcynimidylowym (CFSE).
   1. Odmierzyć 5 × 10⁵ komórek docelowych i przenieść je do 15-ml probówki wirówkowej z dnem stożkowym.
      UWAGA: Jako komórki docelowe wykorzystano linię komórkową chłoniaka pochodzącą od pacjenta CD38⁺¹⁶.
   2. Przemyć komórki raz 10 mL PBS.
   3. Odwirować komórki (5 min, 300 × g, RT, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [brake] = maksymalne).
   4. Przygotować 0,5 µM roztwór roboczy CFSE w PBS z 5 mM roztworu zapasowego poprzez rozcieńczenie 1 µL 5 mM zapasu CFSE w 10 mL PBS w 15-ml probówce wirówkowej z dnem stożkowym.
      OSTRZEŻENIE: CFSE jest reaktywnym fluorescencyjnym barwnikiem wiążącym grupy aminowe i może stwarzać zagrożenie w przypadku kontaktu ze skórą lub oczami. Należy go używać w odpowiednich osobistych środkach ochrony indywidualnej i utylizować niewykorzystany odczynnik zgodnie z lokalnymi wytycznymi bezpieczeństwa biologicznego.
   5. Usunąć nadsącz.
   6. Resuspendować osad w roztworze CFSE do stężenia około 1 × 10⁶ komórek/mL.
   7. Inkubować przez 15 min w 37°C, owijając probówkę folią aluminiową lub umieszczając ją w nieprzezroczystym pojemniku w celu ochrony przed światłem.
   8. Zatrzymać reakcję, dodając 5–10 objętości pożywki hodowlanej.
   9. Inkubować przez 5 min w 37°C.
   10. Odwirować komórki (5 min, 300 × g, RT, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [brake] = maksymalne).
   11. Usunąć nadsącz.
   12. Resuspendować komórki do stężenia 2,5 × 10⁵ komórek/mL, tak aby 100 µL zawierało 2,5 × 10⁴ komórek.
       UWAGA: Przejść bezpośrednio do wysiewania, aby zachować spójną intensywność sygnału CFSE i żywotność komórek docelowych.
3. Wysiewanie komórek docelowych
   1. Przygotować 96-dołkową płytkę z dnem okrągłym.
   2. Dodać 100 µL/dołkę komórek docelowych (2,5 × 10⁵ komórek/mL) do wyznaczonych dołek za pomocą pipety wielokanałowej (patrz Supplemental Figure 2). Każdy wariant wysiewa się w trzech powtórzeniach.
      UWAGA: Przed wysiewaniem upewnić się, że zawiesina komórkowa jest homogeniczna.
4. Przygotowanie i dodanie przeciwciał
   1. Przygotować 200 µL 4× roztworu przeciwciał (100 µg/mL) w pożywce do hodowli komórek NK dla każdego testowanego przeciwciała i dopasowanej kontroli izotypowej.
      UWAGA: Krok ten jest modułowy i może zostać dostosowany do każdego przeciwciała pośredniczącego w ADCC przeciwko wybranej linii komórek docelowych. Stężenia zapasów i formulacje przeciwciał mogą się różnić; należy odpowiednio dostosować rozcieńczenia. Konserwanty, takie jak azydki, mogą wpływać na przeżywalność komórek docelowych i funkcjonalność komórek NK. Choć można przetestować różne stężenia przeciwciał, w niniejszym protokole zastosowano stężenie końcowe 25 µg/mL.
   2. Przenieść roztwory przeciwciał do płytki głębokodołkowej.
   3. Dodać 50 µL/dołkę roztworu przeciwciał do komórek docelowych i wymieszać dokładnie poprzez pipetowanie ≥5 razy.
   4. Dodać 50 µL/dołkę pożywki do hodowli komórek NK do dołek kontrolnych bez przeciwciał i wymieszać dokładnie poprzez pipetowanie ≥5 razy.
   5. Inkubować przez 25–30 min w 37°C przy 5% CO₂.
5. Przygotowanie i dodanie komórek NK
   1. Policzyć i odmierzyć 2 × 10⁵ komórek NK, stosując metodę zliczania komórek opartą na wykluczeniu barwnika (np. błękit trypanowy) lub równoważną zwalidowaną metodę. Liczba ta jest wystarczająca dla trzech wariantów zawierających komórki NK wysiewanych w trzech powtórzeniach, z nadwyżką uwzględniającą straty podczas pipetowania (patrz Supplemental Figure 2). Kontynuować, jeśli żywotność wynosi ≥75%, ponieważ niższa żywotność może wpłynąć na wyniki testu.
   2. Resuspendować komórki do stężenia 2,5 × 10⁵ komórek/mL w 800 µL pierwotnej ludzkiej pożywki do hodowli komórek NK (stężenie końcowe = 1,25 × 10⁴ komórek/50 µL).
   3. Dodać 50 µL/dołkę komórek NK do odpowiednich dołek i wymieszać dokładnie poprzez pipetowanie ≥5 razy.
      UWAGA: Przed wysiewaniem upewnić się, że zawiesina komórkowa jest homogeniczna.
   4. Dodać 50 µL/dołkę pożywki hodowlanej do dołek kontrolnych i wymieszać dokładnie poprzez pipetowanie ≥5 razy.
6. Ustawienie końcowej kokultury
   1. Dokładnie sprawdzić 96-dołkową płytkę z dnem okrągłym, aby potwierdzić, że wszystkie dołki zawierają 200 µL z jednolitym poziomem menisku i bez pęcherzyków powietrza.
   2. Odwirować płytkę (2 min, 100 × g, przyspieszenie = niskie [np. 2]; hamowanie [brake] = niskie [np. 2]).
      UWAGA: To delikatne wirowanie jest ważne dla szybkiego osadzenia komórek i zwiększenia kontaktu komórka-komórka. Używamy laboratoryjnej wirówki stołowej Eppendorf 5810R kompatybilnej z rotorem z koszyczkami wahadłowymi z ustawieniami przyspieszenia i hamowania na poziomie 2 (z 9).
   3. Inkubować przez 16–18 h (całą noc) w 37°C przy 5% CO₂.
      UWAGA: Czas inkubacji został zoptymalizowany pod kątem odczytu cytotoksyczności, a nie degranulacji, którą najlepiej ocenia się mierząc ekspresję CD107a we wcześniejszych punktach czasowych (2–6 h). W związku z tym maksymalne odpowiedzi degranulacyjne mogą być niedoszacowane.
      UWAGA: Nie przedłużać inkubacji powyżej 18 h, ponieważ przedłużona kokultura może prowadzić do nadmiernej śmierci komórek docelowych w dołkach kontrolnych i zmniejszenia zakresu dynamicznego między wariantami eksperymentalnymi.
7. Wykonanie cytometrii przepływowej
   1. Odwirować (5 min, 300 × g, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [brake] = maksymalne).
   2. Usunąć nadsącz.
   3. Przemyć wszystkie dołki 200 µL/dołkę buforu FACS (2% FBS, 2 mM EDTA w PBS).
   4. Przygotować master mix przeciwciał powierzchniowych w buforze FACS, dodając CD56-BV421 w rozcieńczeniu 1:50, CD16-BV785 w rozcieńczeniu 1:50 oraz CD107a-PE-Cy7 w rozcieńczeniu 1:25.
      UWAGA: Obliczyć całkowitą objętość master mixu na podstawie projektu płytki eksperymentalnej (liczba dołek × 50 µL/dołkę + 20% nadmiaru). Klony przeciwciał mogą różnić się intensywnością barwienia i dostępnością epitopu. Klony użyte w reprezentatywnych danych są wymienione w Tabeli Materiałów; alternatywne klony mogą wymagać miareczkowania. Dodatkowo można dołączyć przeciwciała do fenotypowania subpopulacji komórek NK (np. KIR, NKG2A/C/D i CD57) oraz markerów aktywacji (np. CD69 i HLA-DR).
   5. Resuspendować komórki w 50 µL/dołkę master mixu przeciwciał i wymieszać dokładnie poprzez pipetowanie ≥5 razy.
   6. Inkubować przez 15 min w 4°C, owijając płytkę folią aluminiową lub umieszczając ją w nieprzezroczystym pojemniku w celu ochrony przed światłem.
   7. Dodać 150 µL/dołkę buforu FACS.
   8. Odwirować (5 min, 300 × g, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [brake] = maksymalne).
   9. Usunąć nadsącz.
   10. Resuspendować komórki w 100 µL/dołkę 5 µM 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w buforze FACS i niezwłocznie przystąpić do akwizycji danych cytometrem przepływowym. Inkubacja przed akwizycją nie jest wymagana.
   11. Pozyskać dane za pomocą cytometrii przepływowej i zarejestrować kanały fluorescencji dla CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI oraz wszelkich dodatkowych fluoroforów.
       UWAGA: Ustawienia akwizycji (np. napięcia detektorów, kompensacja i bramkowanie) mogą wymagać optymalizacji. Do ustawienia kompensacji i bramkowania należy użyć kontroli niebarwionych i barwionych pojedynczo, z wykorzystaniem kulek kompensacyjnych lub reprezentatywnych komórek, zależnie od potrzeb. W przypadku markerów o ciągłej lub słabej ekspresji (np. CD107a) należy rozważyć zastosowanie kontroli Fluorescence-minus-one (FMO). Należy zachować spójne ustawienia i strategię bramkowania, w tym bramkowanie live/dead oraz identyfikację populacji docelowych i efektorowych, we wszystkich eksperymentach.
       UWAGA: Zarówno Krok 1, jak i Krok 2 można dostosować do przylegających komórek docelowych. Wysiać komórki docelowe (z ich odpowiednimi pożywkami) na 96-dołkowej płytce z dnem płaskim na jeden dzień przed kokulturą, z gęstością pozwalającą na osiągnięcie około 70% konfluencji w dniu testu. Po potwierdzeniu przylegania usunąć pożywkę komórek docelowych i zastąpić ją 100 µL świeżej pożywki dla komórek NK, a następnie dodać komórki efektorowe, aby rozpocząć kokulturę. Ze względu na różnice w wielkości i morfologii komórek, parametry analizy IncuCyte Cell-by-Cell powinny być zoptymalizowane dla każdej linii komórek przylegających.
       UWAGA: W przypadku testów opartych na cytometrii przepływowej z komórkami przylegającymi, po kokulturze odwirować płytkę (300 × g, 5 min) i usunąć nadsącz. Dodać 100 µL/dołkę TrypLE i inkubować w 37°C przy 5% CO₂ przez około 5–15 min (zależnie od linii komórkowej), aby odkleić komórki. Dodać 100 µL/dołkę buforu FACS, wymieszać pipetując w górę i w dół okrężnym ruchem i przenieść wszystkie komórki do 96-dołkowej płytki z dnem okrągłym. Sprawdzić dołki mikroskopowo, aby potwierdzić całkowite odklejenie przed przystąpieniem do barwienia (Krok 2, podkrok 7). Zoptymalizować czas inkubacji z TrypLE w razie potrzeby, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.

Wyniki

Aby ilościowo określić cytotoksyczność komórek NK w czasie rzeczywistym, efektorowe komórki NK-92 zmodyfikowane w celu ekspresji przeciwciał CAR anty-BCMA współhodowano z komórkami docelowymi Ramos BCMA⁺ w czarnej, przezroczystej 96-dołkowej płytce z płaskim dnem i monitorowano za pomocą obrazowania żywych komórek (Rysunek 1A oraz Rysunek dodatkowy 1A). Komórki efektorowe dodawano w stosunkach E:T wynoszących 0:1 (same komórki docelowe), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 oraz 2:1, przy czym każdą próbę przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Oceniono trzy różne konstrukty CAR NK-92: CAR1 bez domeny kostymulującej, CAR2 z domeną kostymulującą 4-1BB (CD137) oraz CAR3 z domeną kostymulującą DAP10, wraz z kontrolnymi komórkami NK-92 wykazującymi ekspresję samego wektora ZsGreen. Wszystkie komórki efektorowe wygenerowano poprzez transdukcję lentiwirusem, zgodnie z wcześniejszym opisem⁴, stosując kasety transgenowe ZsGreen-P2A-CAR. Komórki docelowe Ramos poddano analogicznej transdukcji wektorem lentiwirusem kodującym emiRFP670. Wzrost i przeżywalność komórek docelowych śledzono co godzinę przez okres 24 h przy użyciu instrumentu do obrazowania żywych komórek, mierząc fluorescencję zieloną dla komórek NK-92 ZsGreen⁺, fluorescencję pomarańczową dla martwych komórek SYTOX Orange⁺ oraz fluorescencję NIR dla komórek docelowych emiRFP670⁺ (Rysunek 1A oraz Rysunek dodatkowy 1B i 1C).

Obrazy mikroskopowe pozyskiwano w określonych odstępach czasu, aby zwizualizować komórki efektorowe, żywe komórki docelowe oraz komórki martwe podczas kokultury (Ryc. 1B). Ilościowa analiza wzrostu i przeżywalności komórek docelowych wykazała, że komórki NK-92 CAR2 i CAR3 charakteryzowały się szybszą kinetyką zabijania niż komórki NK-92 CAR1, szczególnie we wcześniejszych punktach czasowych przy stosunku E:T wynoszącym 1:1. Zabijanie komórek docelowych wzrastało wraz z wyższymi stosunkami E:T, również w przypadku kontrolnych komórek NK-92, które wykazały naturalną cytotoksyczność (Ryc. 1C). Pomiary te podkreślają zdolność obrazowania żywych komórek do rejestrowania dynamicznych zmian w aktywności cytotoksycznej. Przeżywalność komórek docelowych analizowano również jako funkcję stosunku E:T w określonych punktach czasowych, aby porównać potencjał komórek CAR NK-92. Komórki NK-92 CAR2 i CAR3 wykazały większy potencjał przy niższych stosunkach E:T w późniejszych punktach czasowych (np. E:T = 0,25:1 po 24 h) oraz przy pośrednich stosunkach E:T we wcześniejszych punktach czasowych (np. E:T = 1:1 po 4 h) (Ryc. 1D). W przeprowadzonych analizach nie zaobserwowano istotnych różnic w zabijaniu między komórkami efektorowymi NK-92 CAR2 i CAR3.

Mapa ciepła integrująca stosunek E:T, czas współinkubacji oraz przeżywalność komórek docelowych zapewnia kompleksową wizualizację cytotoksyczności naturalnej i CAR-zależnej we wszystkich populacjach efektorowych i umożliwia ocenę ilościową. Zdefiniowano trzy parametry do określenia siły i kinetyki działania: KR₅₀, czyli stosunek komórek zabójczych do docelowych, przy którym uzyskuje się 50% zabicia (po 12 h); KT₅₀, czyli czas współinkubacji niezbędny do osiągnięcia 50% zabicia (przy stosunku E:T 1:1); oraz IKI₅₀, zintegrowany indeks komórek zabójczych reprezentujący obszar mapy ciepła poniżej 50% przeżywalności, wyznaczony przez izoklinę 50% przeżywalności (Rycina 1E). Metryki te umożliwiają porównanie siły działania komórek CAR NK-92 (KR₅₀), kinetyki zabijania (KT₅₀) oraz zintegrowanej wydajności cytotoksycznej (IKI₅₀) (Rycina 1F). Analiza ta pokazuje, w jaki sposób test ten pozwala na ilościowe porównanie zmodyfikowanych platform komórek NK w oparciu o wiele parametrów w ramach jednego eksperymentu.

Do pomiaru ADCC wykorzystano cytometrię przepływową z liczeniem komórek poprzez współhodowlę znakowanych fluorescencyjnie komórek docelowych z pierwotnymi ludzkimi komórkami NK w obecności lub przy braku przeciwciał terapeutycznych, a następnie ilościowe określenie pozostałej populacji żywych komórek docelowych po 16–18 h inkubacji (Rysunek 2A). Można zastosować cytometry przepływowe takie jak Cytek Aurora, BD Symphony lub BD Fortessa z samplerem wysokoprzepustowym. W reprezentacyjnym układzie (Rysunek dodatkowy 2) CD38⁺ komórki docelowe chłoniaka pochodzące od pacjenta wysiano na płytkę 96-dołkową z dnem okrągłym, a do odpowiednich dołków dodano daratumumab (lub przeciwciało izotypowe). Następnie przeprowadzono współhodowlę z komórkami NK w stosunku E:T wynoszącym 0,5:1, który został zoptymalizowany dla tych komórek docelowych w celu zminimalizowania naturalnej cytotoksyczności przy jednoczesnym umożliwieniu detekcji ADCC. Po inkubacji przeprowadzono cytometrię przepływową w celu rozdzielenia populacji komórek na podstawie rozproszenia przedniego i bocznego, wykluczenia zdarzeń nieżywotnych za pomocą DAPI oraz oddzielenia komórek docelowych CFSE⁺ od komórek NK CD56⁺CD16⁺ do analizy równoległej (Rysunek 2B). Taki schemat umożliwia jednoczesny pomiar cytotoksyczności i charakterystykę fenotypową.

Rysunek 2. Test cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) oparty na cytometrii przepływowej umożliwia jednoczesną kwantyfikację przeżywalności komórek docelowych i aktywacji komórek NK. (A) Schematyczny przegląd testu ADCC. Komórki docelowe chłoniaka CD38⁺ znakowane CFSE wysiano w zagęszczeniu 2,5 × 10⁴ komórek na dołek i hodowano w pięciu warunkach: same komórki docelowe; komórki docelowe z daratumumabem (25 µg/mL); komórki docelowe z komórkami NK (E:T = 0,5:1); komórki docelowe z komórkami NK i daratumumabem; oraz komórki docelowe z komórkami NK i przeciwciałem kontrolnym izotypowym (25 µg/mL). (B) Reprezentatywna strategia bramkowania w cytometrii przepływowej. Zdarzenia najpierw bramkowano według rozproszenia w przód (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC), a następnie wykluczono komórki nieżywe za pomocą DAPI. Komórki docelowe zidentyfikowano jako zdarzenia CFSE⁺, a komórki NK jako zdarzenia CD56⁺ i CD16⁺. Degranulację komórek NK oceniano na podstawie ekspresji CD107a. (C) Kwantyfikacja przeżywalności komórek docelowych, wyrażona jako procent w stosunku do warunku kontrolnego z samymi komórkami docelowymi (ustalono na 100%). (D) Kwantyfikacja degranulacji komórek NK, przedstawiona jako procent komórek CD107a⁺ w populacji komórek NK. Słupki reprezentują średnią ± odchylenie standardowe, a nałożone punkty reprezentują pojedyncze dołki powtórzeń (n = 3). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji z testem post hoc Tukeya dla porównań wielokrotnych. Istotność statystyczną oznaczono w następujący sposób: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Głównym punktem końcowym jest przeżywalność komórek docelowych, obliczana w bramce dla żywych komórek CFSE⁺ i znormalizowana względem warunku z samymi komórkami docelowymi, dla którego przyjęto 100% przeżywalności. Normalizacja ta pozwala skorygować spontaniczną utratę komórek docelowych i umożliwia bezpośrednie porównanie między warunkami. Na reprezentatywnych danych (Rycina 2C) dodanie samego daratumumabu nie zmniejszyło przeżywalności komórek docelowych, co potwierdza, że przeciwciało nie wywiera bezpośredniego wpływu na żywotność komórek docelowych w przypadku braku komórek efektorowych. Współhodowla z samymi komórkami NK zmniejszyła przeżywalność komórek docelowych do około 70%, co wskazuje na podstawową cytotoksyczność naturalną. Dodatek daratumumabu dodatkowo zmniejszył przeżywalność do około 37%, co jest zgodne ze zwiększoną cytotoksycznością zależną od przeciwciał, podczas gdy w warunku z kontrolą izotypową przeżywalność wyniosła około 62%, co jest wartością porównywalną z warunkiem z samymi komórkami NK. Prawidłowo przeprowadzone eksperymenty wykazują wyraźne rozdzielenie między warunkami z zastosowaniem przeciwciała a grupami kontrolnymi, przy wysokiej powtarzalności między powtórzeniami.

Wtórne fenotypowanie komórek NK zapewnia uzupełniające potwierdzenie związku między zabijaniem komórek docelowych a aktywacją efektorową. Degranulacja komórek NK, mierzona jako procent komórek NK CD107a⁺, była najniższa w ko-kulturze komórek NK i komórek docelowych bez przeciwciał, a najwyższa w warunkach traktowania daratumumabem (około 31%), przy czym kontrola izotypowa wykazała pośrednią degranulację (około 19%), co potwierdza aktywację zapośredniczoną przez przeciwciała (Rysunek 2D). Wyniki te demonstrują, że test pozwala odróżnić zabijanie komórek docelowych od aktywacji efektorowej. Chociaż trendy dotyczące degranulacji i przeżywalności są zazwyczaj zbieżne, nie pokrywają się one w pełni, co wskazuje, że reprezentują one powiązane, lecz odrębne procesy biologiczne.

Suboptymalne eksperymenty zazwyczaj wykazują zmniejszony rozdział między warunkami, zmienność w liczbie komórek w poszczególnych studzienkach, wysoką śmiertelność komórek docelowych w studzienkach kontrolnych, słabe barwienie CFSE lub podwyższoną tła degranulacji. Wyniki te mogą wynikać ze słabej żywotności komórek docelowych, niespójnego odzysku komórek NK, niewystarczającego mieszania lub zmienności w procesie barwienia i akwizycji. Ponieważ test ten niezależnie identyfikuje komponenty docelowe i efektorowe, można go rozszerzyć o dodatkowe fenotypowanie komórek docelowych (np. gęstość antygenu lub ekspresję ligandów) oraz szerszą charakterystykę komórek NK. Wprowadzenie warunku „tylko NK” pozwala na dalszą kwantyfikację bazowej degranulacji i żywotności komórek NK. Ta wieloparametryczna konstrukcja jest kluczową zaletą, umożliwiając interpretację funkcjonalnej cytotoksyczności wraz z mechanicznymi fenotypami immunologicznymi.

Rysunek dodatkowy 1. Reprezentatywny układ płytki i schemat analizy dla testu cytotoksyczności z obrazowaniem żywych komórek. (A) Reprezentatywny układ płytki 96-dołkowej dla testu zabijania przez komórki CAR NK. Cztery warunki komórek efektorowych są rozmieszczone w kwadrantach, z czego każdy jest testowany przy stosunkach E:T wynoszących 0:1 (kontrola z samymi komórkami docelowymi), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 oraz 2:1, przy czym każdy warunek jest wykonywany w trzech powtórzeniach (łącznie 60 dołków testowych). (B) Reprezentatywna konfiguracja analizy Cell-by-Cell dla komórek nieadherentnych w oprogramowaniu IncuCyte 2021C, ilustrująca parametry rozdzielania spektralnego, segmentacji i maskowania używane do identyfikacji poszczególnych komórek efektorowych i docelowych przy jednoczesnym wykluczeniu debris i agregatów. (C) Reprezentatywna strategia bramkowania klasyfikacji Cell-by-Cell z wykorzystaniem fluorescencji NIR względem SYTOX Orange w celu zdefiniowania populacji żywych komórek docelowych. Do potwierdzenia separacji między populacjami komórek żywych i martwych wykorzystuje się dołki z samymi komórkami docelowymi oraz dołki z kokulturą w przykładowym punkcie czasowym (t = 4 h). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek dodatkowy 2. Reprezentatywny układ płytki dla testu ADCC opartego na cytometrii przepływowej. Reprezentatywny układ płytki 96-dołkowej ilustrujący pięć warunków eksperymentalnych wysianych w trzech powtórzeniach w rzędach B–D i kolumnach 2–6 (łączna liczba dołków testowych = 15): (1) kontrola z samymi komórkami docelowymi, (2) komórki docelowe z daratumumabem, (3) komórki docelowe z komórkami NK, (4) komórki docelowe z komórkami NK i daratumumabem oraz (5) komórki docelowe z komórkami NK i przeciwciałem kontrolnym izotypowym. Komórki docelowe wysiano w zagęszczeniu 2,5 × 10⁴ komórek na dołek, a komórki NK dodano w ilości 1,25 × 10⁴ komórek na dołek, aby uzyskać stosunek E:T wynoszący 0,5:1. Przeciwciała zastosowano w końcowym stężeniu 25 µg/mL. Sąsiednie dołki wypełniono PBS w celu zminimalizowania parowania. Warunek z samymi komórkami docelowymi posłużył do normalizacji przeżywalności komórek docelowych, a kontrola izotypowa uwzględniła efekty formuły przeciwciał niezależne od specyficzności antygenowej. W zależności od podatności linii komórek docelowych może być wymagana optymalizacja stosunku E:T. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Te protokoły zapewniają dwa uzupełniające się podejścia do ilościowego określania cytotoksyczności komórek NK w standaryzowanym formacie 96-dołkowej płytki. Krok 1 wykorzystuje obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym do ciągłego monitorowania utraty komórek docelowych i nadaje się do oceny kinetyki naturalnego oraz pośredniczonego CAR zabijania dla wielu stosunków E:T. Krok 2 wykorzystuje cytometrię przepływową do ilościowego określania ADCC po określonym czasie współinkubacji, jednocześnie rozdzielając komponenty docelowe i efektorowe do analizy fenotypu¹⁷. Te metody, prezentowane jako uzupełniające się platformy assay, które mogą być wykorzystywane do modelowania odrębnych procesów biologicznych, są również łatwo zamieniane. Pierwotne ludzkie komórki NK mogą być używane do assayów ADCC opartych na obrazowaniu na żywo, a także mogą być przeprojektowane do zabijania pośredniczonego CAR w assayach cytometrii przepływowej. Ponadto, chociaż dzikobieżne komórki NK-92 nie wykazują ekspresji CD16¹⁸, wdrożenie CD16 (np. poprzez transdukcję lentiwirusową) pozwala komórkom NK-92 na pośredniczenie silnej ADCC. W związku z tym, oba assaye mogą być dostosowane do indywidualnych potrzeb naukowych i translacyjnych.

Istnieje kilka kroków, które są szczególnie ważne dla reprodukowalności w obu assayach. Drobne zmiany w liczbie i fenotypie komórek efektorowych mogą drastycznie zmienić przeżywalność komórek docelowych. Dokładne liczenie komórek i dokładne zawieszenie podczas nakładania na płytkę są niezbędne, aby zminimalizować odchylenia w liczbie komórek i niekompletne mieszanie. Podobnie, przygotowanie komórek musi być spójne między eksperymentami, w tym żywotność, czas odzyskania i poprzednie narażenie na cytokiny, aby zapewnić jednolite funkcjonowanie efektorów. Geometria płytki jest kolejnym kluczowym czynnikiem wpływającym na wydajność assayu. W przepływie obrazowania na żywo płytki z płaskim dnem i powłoką wspierają stabilne nabywanie obrazów i spójną analizę pola, podczas gdy w przepływie cytometrii przepływowej płytki z zaokrąglonym dnem sprzyjają kontaktowi komórka-komórka i ułatwiają odzyskiwanie nieadhezyjnych kultur współistniejących w punkcie końcowym. Ponadto, jakość fluorescencyjnego znaczenia musi być potwierdzona przed assayem, ponieważ słaba dyskryminacja komórek docelowych przez obrazowanie lub słabe rozdzielenie CFSE przez cytometrię przepływową kompromitują ilościową ocenę i interpretację.

Te dwa przepływy pracy prezentują odrębne uwagi techniczne. W assayu obrazowania na żywo, typowe przyczyny złej jakości danych obejmują nierównomierne nakładanie komórek, gęste skupienia komórek lub skupiska oraz nieoptymalne progi analizy obrazu, które wszystkie są łatwo korektowalne. Te problemy mogą zniekształcić liczenie komórek i prowadzić do niekonsekwentnego śledzenia w czasie. W assayu opartym na cytometrii przepływowej, nieoptymalne wyniki są częściej spowodowane wysokim tłem śmierci komórek docelowych, słabym rozdzieleniem populacji docelowych i efektorowych, słabym barwieniem przeciwciał lub niespójnym pipetowaniem między powtórzonymi dołkami. Ponieważ te assaye są zaprojektowane do analizy porównawczej, włączenie odpowiednich kontroli wewnętrznych jest niezbędne do interpretacji, w tym kontroli tylko docelowych do normalizacji i dopasowanych kontroli negatywnych dla warunków specyficznych dla przeciwciał lub CAR.

Kilka wspólnych i specyficznych dla assayu ograniczeń musi być brane pod uwagę przy tych metodach. Assay obrazowania na żywo zapewnia rozdzielczość czasową, ale zależy od dokładnego fluorescencyjnego znaczenia i parametrów analizy obrazu, które mogą być wpłynięte przez skupienia komórek, nakładanie spektralne lub zmiany w morfologii podczas współkultury¹⁵. W niektórych przypadkach, szczególnie gdy assaye obejmują pierwotne komórki efektorowe, osiągnięcie odpowiedniego fluorescencyjnego znaczenia bez zmiany dynamiki zabijania jest trudne lub niemożliwe. Assay oparty na cytometrii przepływowej zapewnia wyższą rozdzielczość fenotypową w określonym punkcie końcowym, ale nie rozróżnia niezależnie wczesnego od późnego zabijania, chyba że zebrane są wielokrotne dopasowane punkty czasowe, co może być kosztowne i czasochłonne¹⁷. Ponadto, pomiary końcowe mogą odzwierciedlać nie tylko śmierć komórek docelowych, ale także różnice w proliferacji komórek docelowych, zużyciu efektorów lub odzyskiwaniu podczas obsługi próbki. W związku z tym, odczyty mechanistyczne takie jak CD107a są najlepiej interpretowane jako uzupełniające wskaźniki aktywacji komórek efektorowych, a nie bezpośrednie zamienniki dla eliminacji komórek docelowych¹⁹. Bardziej ogólnie, żadna z platform nie odzwierciedla w pełni architektury przestrzennej, interakcji z stromą, gradientów cytokin czy ograniczeń ruchu, które kształtują funkcję komórek NK in vivo.

Kilka czynników biologicznych musi również być brane pod uwagę przy interpretacji assayów zabijania komórek NK. Zmienność między dawcami jest właściwa eksperymentom z pierwotnymi ludzkimi komórkami NK, które

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Advanced RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	12633020	Podstawowe medium dla kultur NK-92 i pierwotnych ludzkich komórek NK (patrz protokół dla pełnej formuły)
Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)	BioLegend	328618	Marker degranulacji do cytometrii przepływowej
Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)	BioLegend	302046	Cytometria przepływowa
Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)	BioLegend	318328	Cytometria przepływowa
Centryfuga stołowa z obrotowym rotorem do pojemników 15-mL i płytek 96-dołkowych (Eppendorf Centrifuge 5810R)	Eppendorf	5811000015	Używany do pelletowania komórek i wirowania płytek (100–300 × g)
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Thermo Fisher Scientific	C34554	Barwnik proliferacji komórkowej do oznaczania komórek docelowanych
Cytek Aurora spectral flow cytometer (lub odpowiednik)	Cytek Biosciences	N7-00003	Używany do akwizycji i analizy cytometrii przepływowej
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol)	BioLegend	422801	Barwnik jądrza do różnicowania żywych i martwych komórek
Głębokodołkowa płytka 96-dołkowa	USA Scientific	1896-2110	Używany do przygotowania przeciwciał
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Środek do krioprezerwacji
Fetal bovine serum (FBS)	Avantor	76419-584	Dodatek do podstawowego medium; używany w buforze FACS (2% FBS)
General Purpose Water Bath, 10 L (37 °C)	PolyScience	WBE10	Do odmrażania komórek
GlutaMAX (suplement L-alanyl-L-glutamina)	Thermo Fisher Scientific	35050061	Stabilne źródło glutaminy
Human AB serum	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	Dodatek do kultur medium pierwotnych ludzkich komórek NK
IncuCyte SX5 live-cell imaging system	Sartorius	4816	Obrazy na żywo w czasie rzeczywistym i analiza komórka po komórce
LUNA-FL dual fluorescence cell counter (lub odpowiednik)	Logos Biosystems	L20001	Automatyczne liczenie komórek
Parafilm M (4 in × 250 ft roll)	Genesee	16-101	Uszczelnianie i przechowywanie płytek
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile (pH 7.2–7.4)	Corning	21-020-CV	Używany do płukania i przygotowania bufora FACS
Poly-D-lysine (0.1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A3890401	Środek do powlekania płytek
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	Antybiotyk
Recombinant human interleukin-2 (IL-2)	R&D Systems	202-IL-500	Cytokine
RosetteSep Human NK-cell enrichment kit	STEMCELL Technologies	15065	Kompleks wzbogacania ludzkich komórek NK
SYTOX Orange dead cell stain	Thermo Fisher Scientific	S34861	Barwnik do obrazów na żywo martwych komórek
Trypan Blue 0.4%	Gibco	15250-061	Barwnik do liczenia komórek
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604039	Do odczepiania komórek przylegających
UltraPure EDTA (0.5 M, pH 8.0)	Thermo Fisher Scientific	15575020	Używany do przygotowania bufora FACS
15-mL stożkowe pojemniki z dnem do wirowania	Corning	352097	Sterylne
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej (płytki przeznaczone do hodowli tkankowej)	Corning	3524	Używany do odzyskiwania komórek NK
96-dołkowa płytka z okrągłym dnem (płytki przeznaczone do hodowli tkankowej)	Corning	3799	Używany do kokultur i badań cytometrii przepływowej
96-dołkowa płaska płytka z czarnym, przezroczystym dnem z polistyrenu (płytki przeznaczone do hodowli tkankowej)	Corning	3603	Kompatybilny z systemami obrazu na żywo