Artykuł metodologiczny

Analiza optogenetyczna zachowania komara Aedes aegypti

248 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71394

⸱

21 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Yale University, 2Kavli Institute for Neuroscience, Yale University, 3Howard Hughes Medical Institute, 4Wu Tsai Institute, Yale University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje wykorzystanie optogenetyki do zrozumienia zachowania komara Aedes aegypti. Przedstawiono metody hodowli, przygotowania, testy oraz analizy w celu oceny funkcji neuronalnych podczas przyciągania do zwierząt żywicieli i żerowania na krwi. Te podstawowe techniki umożliwią badania obwodów neuronalnych i behawioralnych tego istotnego wektora chorób ludzkich.

Streszczenie

Komar Aedes aegypti jest istotnym wektorem patogenów wirusowych i służy jako model dla innych gatunków wektorów. Patogeny są przenoszone, gdy komar ugryzie zwierzę-gospodarza, jednak obwody neuronalne kontrolujące zachowania poszukiwawcze i kąsanie pozostają nieznane. Niniejsza praca szczegółowo opisuje metody manipulowania aktywnością neuronalną u komara z wykorzystaniem optogenetyki, która jest kluczową techniką służącą do ustalenia związku przyczynowego między obwodami neuronalnymi a zachowaniem. Metody te obejmują hodowlę komarów do celów optogenetycznych oraz trzy testy zaprojektowane do pomiaru różnych etapów sekwencji obejmującej pobudzenie, przyciąganie, sondowanie trąbą oraz nasycanie krwią gospodarza. Zachowania te występują w różnych skalach przestrzennych i w odpowiedzi na różne bodźce sensoryczne. Każdy test behawioralny jest wyposażony w czerwone (~625 nm) diody LED do aktywacji optogenetycznej. Aby wykryć pobudzenie w odpowiedzi na bodźce węchowe, kwantyfikuje się lot i chodzenie. W celu oceny przyciągania lub lądowania komary są wystawiane na podgrzany posiłek krwi w dużej arenie. Sondowanie trąbą i nasycanie badane są za pomocą wideo o wyższej rozdzielczości, co umożliwia pomiar wyrostków oraz rozmiaru odwłoka. Protokół opisuje modele wizji komputerowej umożliwiające wysokorozdzielczą kwantyfikację czasową zachowań oraz pomiary punktowe końcowe karmienia. Metody te mogą być wykorzystane do badania roli dowolnej genetycznie dostępnej populacji neuronów w zachowaniu kąsania komarów i mogą zostać rozszerzone o dodatkowe zachowania.

Wprowadzenie

Komar jest jednym z najniebezpieczniejszych zwierząt na świecie, nie ze względu na swoją agresywność czy siłę, lecz z powodu swojej wydajności jako wektor chorób. Pasożyty wywołujące malarię, przenoszone przez komary z rodzaju Anopheles, odpowiadają za setki tysięcy zgonów rocznie, natomiast Aedes aegypti oraz Aedes albopictus odpowiadają za rozprzestrzenianie żółtej febry, dengi, chikungunya, gorączki Zika i wielu innych zagrażających życiu chorób1. Komary występują na każdym kontynencie z wyjątkiem Antarktydy i stanowią poważny problem dla zdrowia publicznego2. Zachowanie polegające na pobieraniu krwi bezpośrednio przenosi patogeny, ale jest ono również niezbędnym etapem w cyklu życiowym komara , ponieważ do zniesienia jaj konieczne jest spożycie krwi kręgowca. Ograniczenie rozprzestrzeniania się chorób przenoszonych przez komary wymaga zatem zrozumienia mechanizmów poszukiwania żywiciela.

Jest dobrze udokumentowane, że samice komarów wykorzystują sygnały z dalekiego i bliskiego zasięgu do lokalizowania żywicieli3,4. Dwutlenek węgla (CO2) jest wysoce lotnym gazem obecnym w wydychanym przez ludzi powietrzu i często stanowi pierwszy sygnał wyczuwalny dla komara. Jest on wykrywany w neuronach sensorycznych węchu Aedes aegypti przez białka Gr1, Gr2 i Gr3, które tworzą receptor CO2 5. Ekspozycja na CO2 wywołuje start i zachowania lotne, znane również jako aktywacja6,7, która może utrzymywać się do 10–15 min, nawet w przypadku braku dalszych bodźców8. CO2 działa synergistycznie z zapachem skóry, wzmacniając aktywację i atrakcyjność5,9. Po wykryciu CO2 i zapachu skóry komar jest przygotowany do wyczuwania dodatkowych, bardziej proksymalnych sygnałów żywiciela, takich jak ciepło, kontrast wizualny i wilgotność, które prowadzą go do lądowania na odpowiednim żywicielu w celu pobrania krwi5,10,11,12,13. Integracja wielu sygnałów sensorycznych pozwala komarom na efektywne poszukiwanie i lokalizowanie swojego żywiciela.

Kiedy samica komara ląduje na potencjalnym żywicielu, wbija swój aparat gębowy w powierzchnię ciała, aż do zlokalizowania odpowiedniego fragmentu skóry, co jest procesem znanym jako sondowanie14,15. Po sondowaniu stylet przebija skórę, odnajduje naczynie krwionośne i jednocześnie pobiera krew, wstrzykując ślinę, co pozwala komarowi podwoić masę ciała w ciągu kilku minut16. Krew jest kierowana do jelita środkowego, gdzie białka są trawione w celu produkcji jaj. Co ciekawe, nasycenie się krwią żywiciela nie jest konieczne do rozprzestrzeniania się patogenów, ponieważ samo sondowanie może przenosić chorobę16,17. Dlatego zrozumienie każdego etapu zachowania podczas kąsania mogłoby pozwolić na opracowanie strategii przerywających poszukiwanie żywiciela i kąsanie przez samice komarów, a w konsekwencji na kontrolę rozprzestrzeniania się chorób przenoszonych przez komary.

W organizmach modelowych opracowano liczne narzędzia do manipulowania aktywnością neuronów. Wczesne narzędzia działały konstytutywnie lub poprzez aktywację termiczną18,19,20,21. Mimo swojej użyteczności, te odczynniki genetyczne wiążą się z pewnymi wadami. Narzędzia konstytutywne mogą wpływać na rozwój, prowadząc do powstawania fenotypów, które nie wynikają wyłącznie z funkcji obwodowej neuronów. Komary wykorzystują ciepło ciała do identyfikacji kręgowców-gospodarzy, co sprawia, że kanały aktywowane termicznie są wyjątkowo nieprzydatne w badaniach nad ich zachowaniem22,23. W badaniach nad zachowaniem optogenetyka odnosi się do stosowania narzędzi genetycznych reagujących na określone długości fal świetlnych w celu kontrolowania aktywacji interesujących nas neuronów . Technika ta została już zastosowana w wielu systemach: od badania walencji pragnienia u myszy, przez analizę zachowań godowych u Drosophila, aż po przywracanie wzroku po zapaleniu nabłonkowym siatkówki w badaniach klinicznych u ludzi24,25,26. Kanały optogenetyczne działają poprzez absorbcję fotonów i umożliwienie przenikania przez błonę plazmatyczną specyficznych typów jonów, co aktywuje lub hamuje neuron. Poprzez wprowadzenie do organizmu transgenicznych genów kodujących białka światłoczułe, technikę tę można wykorzystać do aktywacji lub hamowania konkretnych neuronów, których manipulacja byłaby w przeciwnym razie niemożliwa. Optogenetyka zapewnia zalety w zakresie kontroli czasowej i przestrzennej oraz szereg mechanizmów kontrolnych umożliwiających wnioskowanie eksperymentalne.

Autorzy opisali niedawno pierwsze zastosowanie narzędzi optogenetycznych do badania zachowania komarów8. Narzędzia te opierają się na aktywowanym czerwonym światłem kanale kationowym CsChrimson, będącym przesuniętą w stronę czerwieni channelrhodopsyną27. Opsyny mikrobialne, w tym CsChrimson, wymagają kofaktora chemicznego, all-trans retinalu, aby absorbować fotony28. CsChrimson jest połączony z fluorescencyjnym reporterem tdTomato i znajduje się pod kontrolą binarnego systemu ekspresji QF2/QUAS, co umożliwia jego elastyczne łączenie z różnymi liniami sterującymi29. W celu ukierunkowania na neurony sensoryczne CO2 , zastosowano linię sterującą, która wykazuje ekspresję czynnika transkrypcyjnego QF2 w neuronach eksponujących podjednostkę Gr3 receptora CO2 30. Komary wykazały minimalną odpowiedź behawioralną po samej ekspozycji na czerwone światło8; ponadto czerwone światło najskuteczniej przenika przez tkanki biologiczne, co czyni opsynę aktywowaną czerwonym światłem idealną do optogenetyki25.

Niniejsza publikacja opisuje protokoły trzech testów mierzących różne aspekty zachowań poszukiwania gospodarza i żerowania na krwi w połączeniu ze stymulacją optogenetyczną (Rysunek 1A). W pierwszej kolejności przedstawiono protokół hodowli optogenetycznych linii komarów. Druga sekcja opisuje opto-termocykler – zmodyfikowany termocykler PCR, który może być wykorzystany do śledzenia pobudzenia i sondowania, gdy komary są poddane bodźcom temperaturowym i świetlnym. Test z użyciem opto-termocyklera został zaprojektowany w celu pomiaru tych zachowań poszukiwawczych w dłuższych przedziałach czasowych, z wykorzystaniem szczepów sterujących do kontrolowania aktywności neuronalnej za pomocą optogenetyki. Trzecia sekcja opisuje test z warstwą krwi (blood blanket assay), w którym komary mają stały dostęp do cienkiego, sztucznego posiłku krwiowego na podstawie zmodyfikowanego termocyklera, co umożliwia śledzenie lotu, sondowania i nasycania w zmiennych warunkach oświetlenia i temperatury. Test z warstwą krwi, oparty na opto-termocyklerze, stanowi narzędzie do ilościowego określenia stopnia nasycenia sztucznym posiłkiem krwiowym, umożliwiając badanie zachowań żywieniowych komarów przy precyzyjnie zsynchronizowanych bodźcach optogenetycznych i cieplnych. Ostatnia sekcja opisuje opto-karmienie membranowe (opto-membrane feeder), w którym komarom udostępniono ciepły posiłek krwiowy w kanistrze, co pozwala na śledzenie zarówno przyciągania do źródła krwi, jak i nasycania podczas ekspozycji na bodźce świetlne. Test z opto-karmieniem membranowym służy do badania pełnej sekwencji behawioralnej poszukiwania gospodarza i żerowania na krwi w systemie swobodnego lotu. Oprócz oczekiwanych wyników dla każdego testu opisano modele wizji komputerowej służące do śledzenia części ciała komarów i identyfikacji zachowań podczas testów. Testy z użyciem opto-termocyklera, warstwy krwi oraz opto-karmienia membranowego umożliwiają pomiar odrębnych etapów zachowania komarów podczas żerowania na krwi przy jednoczesnej manipulacji aktywnością neuronalną za pomocą światła. Te innowacyjne techniki pozwalają badać, w jaki sposób obwody neuronalne komarów kontrolują zachowania stanowiące zagrożenie dla zdrowia publicznego.

Protokół

Komary użyte w niniejszym protokole zawierają transgeny i zgodnie z regulacjami Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych muszą być hodowane w obiektach o stopniu zabezpieczenia stawonogów Arthropod Containment Level II32. Komary są utrzymywane w warunkach ograniczających ich ucieczkę, a po zakończeniu badań utylizowane jako odpady biologiczne. Protokoły bezpieczeństwa biologicznego i zabezpieczenia stawonogów zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Yale Environmental Health & Safety. Niniejsza praca nie wykorzystuje ludzi ani zwierząt jako obiektów badawczych. Genotyp komarów można potwierdzić za pomocą markerów fluorescencyjnych (3xP3-dsRed dla Gr3-QF2 oraz 3xP3-CFP dla QUAS-CsChrimson) lub poprzez PCR w celu wykrycia wstawionej konstrukcji8. Wszystkie materiały wykorzystane w badaniu wymieniono w Tabeli materiałów.

1. Hodowla optogenetyczna

  1. Hodować komary zgodnie ze standardowym protokołem31, z następującymi wyjątkami w celu zmaksymalizowania odpowiedzi linii optogenetycznych podczas eksperymentów.
  2. Przeprowadzić krzyżówki z wykorzystaniem szczepów homozygotycznych Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson oraz szczepów dzikich z Liverpool, aby uzyskać heterozygotyczne linie eksperymentalne Gr3-QF2/+, QUAS-CsChrimson/+ oraz Gr3>CsChrimson.
  3. Hodować komary w szczelnym przed światłem inkubatorze ustawionym na 28 °C i 80% wilgotności, w cyklu 14 h światła niebieskiego (450 nm) i 10 h ciemności (Rysunek 1B).
    UWAGA: Stosowanie światła niebieskiego minimalizuje aktywację kanałów aktywowanych światłem czerwonym, takich jak CsChrimson. Wszystkie etapy hodowli wykonywane poza inkubatorem powinny być przeprowadzane w warunkach słabego oświetlenia.
  4. Rozpocząć eksperymenty na dorosłych komarach najwcześniej 1 tydzień po wyjściu z poczwarki.
    UWAGA: Chociaż idealny wiek do eksperymentów behawioralnych to 2–3 tygodnie, można wykorzystać komary do 4 tygodni po wyjściu z poczwarki. Genotypy kontrolne i eksperymentalne powinny być w tym samym wieku, zapisywanym jako liczba dni po wyjściu z poczwarki. Aby ustandaryzować wiek zwierząt, wszystkie jaja powinny wykluć się tego samego dnia.
  5. Na dwa dni przed eksperymentem delikatnie odessać sparowane, nienasycone krwią samice komarów z klatek i zanieczulić w temperaturze 4 °C. Używając piórka lub aspiratora, ostrożnie przenieść je do naczyń eksperymentalnych, zgodnie z zastosowanym testem.
  6. Przygotować alikwot 0,2 M all-trans-retinalu (ATR) w dimetylosulfotlenku (DMSO), przechowywany w -20 °C. Podać 10% sacharozy i 400 µM ATR za pomocą nasączonych knotów bawełnianych na siatce naczynia. Zwierzęta mogą żywić się tym posiłkiem w ciemności przez 1–3 dni.
    UWAGA: Karmienie w ciemności, w przeciwieństwie do karmienia pod światłem niebieskim, zapobiega blaknięciu ATR (Rysunek 1B). Dodatkowo, na wszystkich etapach protokołu komary były znieczulane poprzez wystawienie na temperaturę 4 °C przez 5–10 min, aż do momentu zaprzestania ruchu. Na koniec każdego eksperymentu komary były uśmiercane poprzez wystawienie na -20 °C przez 24 h.
    OSTROŻE: All-trans-retinal może powodować silne podrażnienia w przypadku kontaktu ze skórą i oczami. Podczas pracy należy stosować odpowiednie Środki Ochrony Indywidualnej (PPE), takie jak fartuch laboratoryjny, rękawice i ochrona oczu. Dimetylosulfotlenek jest cieczą łatwopalną, która może zostać wchłonięta przez skórę podczas kontaktu i musi być obsługiwany w suchym środowisku przy użyciu odpowiednich PPE i ochrony oczu. DMSO należy również przechowywać w ognioodpornych pojemnikach do przechowywania chemikaliów.
  7. Na jeden dzień (20–24 h) przed eksperymentem zastąpić karmidła z sacharozą nowymi karmidłami zawierającymi wodę destylowaną i 400 µM ATR. Zwierzęta pozostają w ciemności do czasu rozpoczęcia eksperymentu (Rysunek 1B). Przejść do sekcji 2, 3 lub 4.
    UWAGA: Eksperymenty powinny być przeprowadzane podczas dziennego fotoperiodu komarów, aby zmaksymalizować wskaźnik odpowiedzi.

2. Opto-termocykler

  1. Montaż komponentów testu
    1. Przygotuj płytki akrylowe do utrzymania komarów (Rysunek 2). Należy odnieść się do Rycina 2A do schematu, Rycina 2B dla komponentów elektronicznych, i Rycina 2C dla obrazu płyta akrylowa Szablony znajdują się w plikach pod adresem (https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0).
      1. Aby stworzyć ścianki, należy wyciąć laserowo z 3-milimetrowej płyty akrylowej cztery prostokąty o wymiarach 10 cm na 1 cm oraz sześć prostokątów o wymiarach 7 cm na 1 cm. Następnie należy przykleić prostokąty za pomocą kleju do akrylu, tworząc macierz o wymiarach pięć na trzy, w której każda jednostka stanowi komorę o wymiarach 17 mm na 17 mm na 10 mm. Szablon tych elementów znajduje się w pliku „14_zwierzęce_grube_v3.ai”.
        ​OSTRZEŻENIE: Klej akrylowy jest łatwopalny i może powodować podrażnienia dróg oddechowych oraz oczu. Podczas pracy z klejem akrylowym należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawice, fartuch laboratoryjny i gogle. Rozpuszczalnika tego należy używać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, z dala od otwartego ognia.
      2. W celu przygotowania dna komory wyciąć z arkusza akrylowego o grubości 1,5 mm element o wymiarach 6,985 cm na 10,16 cm z usuniętym prawym dolnym otworem. Na pokrywę wyciąć z arkusza akrylowego o grubości 1,5 mm prostokąt o wymiarach 6,985 cm na 10,16 cm. Szablon tych elementów to „14_zwierzęcy_cienki_v3.ai”.
    2. Dotnij czarną siatkę odporną na promieniowanie UV do tego samego rozmiaru co dolny element akrylowy (Rysunek 2C). Umieść siatkę pomiędzy ściankami płytki a elementem dolnym, a następnie przyklej je za pomocą kleju akrylowego. Usuń siatkę z prawego dolnego otworu, aby otwór pozostał drożny.
  2. Zbuduj ramę, w której zostaną zamocowane kamera oraz diody LED (Rysunek 2A).
    1. Zbuduj ramę z czterema filarami w każdym narożniku termocyklera, wykorzystując kwadratowe szyny konstrukcyjne do optyki o wymiarach 60,96 cm i 25 mm. Użyj dwóch szyn konstrukcyjnych o długości 22,86 cm i szerokości 25 mm, aby połączyć filar przedni prawy z tylnym prawym oraz filar przedni lewy z tylnym lewym, w odległości 30 cm od blatu.
    2. Połącz przednie filary prawy i lewy szyną konstrukcyjną o długości 30,48 cm i średnicy 25 mm, umieszczoną 24 cm nad blatem, a tylne filary szyną konstrukcyjną o długości 30,48 cm i średnicy 25 mm, umieszczoną 42 cm nad blatem.
    3. Przymocuj 30-centymetrowe (1 stopa) słupki optyczne do szyny konstrukcyjnej po lewej i prawej stronie ramy. Do każdego słupka przymocuj sześć diod LED o długości fali 627 nm (czerwonych), połączonych szeregowo, w odległości 24 cm nad blokiem PCR termocyklera.
      UWAGA: Chociaż długość fali światła zapewniająca szczytową aktywność CsChrimson wynosi ok. 590 nm, długości fal w okolicy 625 nm pozwalają zrównoważyć potrzebę aktywacji CsChrimson z koniecznością uniknięcia reakcji behawioralnych na światło w kontrolach genetycznych27Przytwierdź za pomocą taśmy radiator i soczewkę do każdej diody LED, aby skupić światło w stronę bloku termocyklera.
    4. Przymocuj pręt optyczny o długości 30,48 cm do górnej części dwóch przednich filarów szyn konstrukcyjnych. Używając zacisku kątnego w połowie pręta optycznego, zamocuj pręt optyczny o długości 15,24 cm, skierowany do wewnątrz nad blokiem termocyklera. Na jego końcu, w odległości 40 cm nad blokiem, przymocuj skierowaną w dół kamerę z filtrem długoprzepustowym dla podczerwieni.
    5. Za pomocą prętów optycznych należy stworzyć ramę w kształcie prostokąta, która rozciąga się od szyny konstrukcyjnej wokół bloku PCR i jest uniesiona tuż nad jego powierzchnią. Do ramy należy przymocować pasek diod LED na podczerwień, skierowany w stronę bloku PCR, aby oświetlić komary pod kątem prostym względem kamery.
      UWAGA: Oświetlenie podczerwone stosowane do obrazowania wideo nie powoduje mierzalnego nagrzania areny, ponieważ powierzchnia termocyklera jest utrzymywana w temperaturze 24°C. °C przez cały okres trwania eksperymentu.
    6. Przykryj konstrukcję zasłoną zaciemniającą, aby zapobiec zakłóceniom wywołanym przez światło otoczenia.
    7. Przykryć powierzchnię oraz boki bloku PCR pojedynczą warstwą taśmy zaciemniającej, aby uzyskać płaską, równą powierzchnię z ciemnym tłem.
    8. Umieść czujnik termopary w prawym dolnym rogu bloku PCR i zabezpiecz go czarną taśmą izolacyjną. Za pomocą watometru potwierdź równomierny rozkład światła na bloku PCR. Dostosuj napięcie lub natężenie prądu zasilania, aby dostarczyć światło o natężeniu 12 µW/mm2.
    9. Na krawędzi bloku PCR należy umieścić diodę LED emitującą światło podczerwone, aby zsynchronizować nagranie wideo z wyjściem podawania bodźca (Rycina 2C). Powierzchnię należy zakryć czarną taśmą, aby umożliwić wykrycie światła bez powstawania odblasków w kamerze.
    10. Podłącz termoparę, diodę LED synchronizacji oraz czerwone diody LED zgodnie ze schematem w Rycina 2BPobierz wymagane oprogramowanie (SpinView (wersja 1.27.0.48), CoolTerm (wersja 2.0.1), Arduino IDE (wersja 1.8.12)). Pobierz kod Arduino oraz program termocyklera z repozytorium GitHub.
      ​UWAGA: Kod Arduino został zaprogramowany tak, aby dostarczać światło czerwone, ciepło o temperaturze ciała oraz kombinację obu tych bodźców. Jako materiały pomocnicze udostępniono siedem programów stymulacji, w których kolejność bodźców jest randomizowana. Można je modyfikować w celu dostarczenia innych bodźców. W każdym eksperymencie występuje dziewięć bodźców: trzy tylko cieplne, trzy tylko świetlne oraz trzy jednoczesne bodźce cieplne i świetlne. Podawanie bodźców odbywa się poprzez wykrywanie przez Arduino zmian temperatury powierzchni bloku PCR za pomocą termopary, a następnie dostarczanie bodźców świetlnych w określonych czasach. Dodatkowe szczegóły znajdują się w komentarzach w programach stymulacji.
  3. Przygotowanie do próby
    1. Hodować komary zgodnie z optogenetycznym protokołem hodowli; patrz sekcja 1 i Rysunek 1B.
    2. Na dwa dni przed eksperymentem przenieś 14 samic komarów do oddzielnego pojemnika za pomocą aspiratora. Dostarcz komarom ATR zgodnie z krokiem 1.6. W przypadku porównywania wielu genotypów, zastosuj ślepą próbę względem eksperymentatora.
      ​UWAGA: Po podaniu komarom ATR należy trzymać je w przyćmionym świetle.
    3. Na jeden dzień przed eksperymentem (20–24 h) należy przenieść do każdej płyty akrylowej po 14 samic komarów i znieczulić je w temperaturze 4 °C. Ostrożnie umieść po jednym komarze w każdej z dolek, używając do tego pióra lub aspiratora.
    4. Przyklej taśmę Scotch do boku płyty akrylowej, aby utrzymać pokrywę na miejscu. Nie zaklejaj górnej ani dolnej krawędzi płyty akrylowej, ponieważ mogłoby to zasłonić widok kamery.
    5. Umieść płytkę akrylową na trzech knotach bawełnianych nasączonych 400 µM ATR w wodzie destylowanej (patrz krok 1.6), ustawione równolegle. Wyrównaj każdą z trzech do knota, aby wszystkie komary miały dostęp do roztworu wody i ATR. Płytkę akrylową umieść w ciemnym inkubatorze na noc.
  4. Przeprowadzenie badania
    1. Podłącz kamerę, diody LED oraz Arduino do komputera. Włącz zasilacz. Przetrzyj powierzchnię opto-termocyklera 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.
      ​OSTRZEŻENIE: Etanol jest łatwopalny i może powodować poważne podrażnienie oczu. Podczas pracy z etanolem należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej. Należy również unikać otwartego ognia.
    2. Używając ciemnego pojemnika, przenieś płytkę akrylową z komarami do środkowej części bloku PCR. Przykryj opto-termocykler zasłoną zaciemniającą.
    3. Uruchom program SpinView na komputerze. Kliknij nazwę kamery, aby otworzyć widok z kamery. Podłącz lampy podczerwone i upewnij się, że blok PCR oraz płyta akrylowa są widoczne w widoku z kamery.
    4. W razie potrzeby należy skorygować położenie płyty akrylowej tak, aby była wyrównana, wycentrowana, a termopara była widoczna w prawym dolnym rogu płyty. Upewnij się, że światło synchronizujące znajduje się w kadrze (Rycina 2C).
    5. Dostosuj ustawienia kamery oraz programu SpinView, aby uzyskać wyraźne, przycięte nagranie wideo przedstawiające płytkę akrylową. W Format obrazu zakładkę, dostosuj Szerokość, Wzrost, Przesunięcie Xoraz Przesunięcie Y opcje zapewniające widoczność płytki akrylowej i światła synchronizacyjnego. W Ustawienia zakładka, zestaw Częstotliwość klatek akwizycji Włącz Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. prawda i Częstotliwość klatek akwizycji Proszę podać tekst źródłowy w języku angielskim, który należy przetłumaczyć na język polski. 30 klatki na sekundę
    6. Obrót Autoekspozycja i Automatyczny dobór wzmocnienia wyłącz. Wyreguluj Czas ekspozycji i Wzmocnienie wartości, aby uzyskać wyraźny kontrast między czarnym tłem a komarami. Kliknij czerwony przycisk nagrywania w prawym górnym rogu, aby otworzyć osobne okno w celu zapisania pliku wideo.
    7. W oknie wyskakującym ustaw ścieżkę do pliku na górze: kliknij Przeglądajprzejdź do folderu eksperymentalnego, kliknij Nowy folderi należy go oznaczyć nazwą próby. Ustaw liczbę ramek do zarejestrowania na odpowiednią dla danego eksperymentu wartość (np. 43 500) lub na 0, aby zatrzymać nagrywanie ręcznie.
    8. W karcie Filmy ustaw następujące polaTyp nagrywania wideo: MJPG, rozmiar dzielenia pliku wideo: 1000 MB, Jakość kompresji JPEG: 65. Otwórz „optotermia_światło-ciepło_losowy1program w termocyklerze i uruchomić go. Termocykler powinien rozpocząć pracę od etapu inkubacji w temperaturze 25°C. °C.
    9. Otwórz odpowiedni program, „TC_optothermo_lightheat_random1.ino”, w środowisku Arduino IDE, a następnie wgraj go do płytki. Otwórz monitor szeregowy i upewnij się, że temperatura wynosi około 25 °C.
    10. Zamknij monitor szeregowy w środowisku Arduino IDE. Otwórz program CoolTerm, aby rozpocząć przechwytywanie danych z monitora szeregowego Arduino. Upewnij się, że port szeregowy i kanał są zgodne z tymi ustawionymi w Arduino IDE. Dane zaczną pojawiać się w oknie programu CoolTerm.
    11. Rozpocznij zapisywanie danych wyjściowych z Arduino do pliku tekstowego/binarnego. Uruchom nagrywanie wideo w programie Spinview. Kliknij Podsumowanie aby zakończyć fazę utrzymania temperatury w termocyklerze. Należy obserwować dane wyjściowe z Arduino w programie CoolTerm, aby sprawdzić, czy temperatura spada do 18 °C, a licznik bodźców zwiększa się do 1, rozpoczynając próbę. Należy pozostawić analizę do czasu zakończenia próby.
  5. Oczyścić
    1. Zatrzymaj nagrywanie wideo i akwizycję danych z programu CoolTerm. Zamknij oba programy. Zakończ program termocyklera. Wyjmij z termocyklera akrylową płytkę z komarami i umieść ją w temperaturze -20°C. °Umieścić w zamrażarce na noc w celu uśmiercenia komarów.
      ​UWAGA: Podczas uśmiercania komór transgenicznymi należy upewnić się, że pozostają one w temperaturze -20 °w środowisku C przez co najmniej 24 h przed wyrzuceniem ich do pojemnika na odpady biologiczne w celu zapewnienia ich unicestwienia.
    2. W przypadku rozpoczęcia kolejnej próby należy powtórzyć sekcję 2.3. Odłączyć kable kamery i Arduino. Wyłączyć zasilacz. Odłączyć diody LED na podczerwień. Oczyścić płyty akrylowe, usuwając taśmę klejącą i utylizując martwe komary.
    3. Spryskaj pokrywkę oraz płytkę akrylową 70% etanolem, a następnie ostrożnie przetrzyj palcem w rękawiczce wszystkie ścianki studni i siatkę. Dokładnie wypłucz wodą dejonizowaną, po czym ułóż płytki akrylowe w stosie do przechowywania, oddzielając pokrywki ręcznikiem papierowym, aby uniknąć zarysowań.

3. Test kocu krwi

  1. Montaż komponentów testu (Rysunek 3)
    1. Zmontować układ opto-termocyklera zgodnie z opisem w sekcji 2.1. Należy odnieść się do rysunków przedstawiających układ testowy (Rysunek 3A), bodziec termiczny (Rysunek 3B) oraz płytkę aluminiową (Rysunek 3C).
    2. Przygotować aluminiową płytkę do podawania posiłku krwiowego, zgodnie z Rysunkiem 3C.
      1. Za pomocą wycinarki laserowej lub strumieniem wody wyciąć górną i dolną część płytki. Część dolną wykonać z arkusza aluminium o grubości 0.8 mm, dociętego do wymiarów 90 mm na 134 mm. Część górną wykonać z arkusza aluminium o grubości 1.6 mm, dociętego do wymiarów 90 mm na 134 mm. W górnej płytce wyciąć 15 prostokątnych otworów (17,2 mm na 18,6 mm). Pliki szablonów znajdują się w repozytorium GitHub projektu blood blanket (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket) w sekcji „Aluminum plate templates”.
      2. Między aluminiowe elementy włożyć cienką uszczelkę silikonową (grubości 0.5 mm), aby zapobiec wyciekom. Wyciąć ją laserowo tak, aby pasowała do kształtu górnej części aluminiowej.
      3. Połączyć warstwy za pomocą ośmiu standardowych śrub imbusowych 4–40 z półokrągłym łbem o długości 0.47625 cm. Użyć gwintownika do wykonania gwintów w elementach metalowych. Śruby należy połączyć z podkładkami okrągłymi i typu „W” na spodzie płytki, aby zapewnić stabilność po umieszczeniu na bloku termocyklera.
    3. Pobrać kod Arduino i program termocyklera dla testu blood blanket z repozytorium GitHub (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket).
    4. Przygotować alikwoty 20 mM ATP w 25 mM NaHCO3 i przechowywać w temperaturze -20 ˚C do momentu użycia.
      ​UWAGA: Świeży roztwór ATP należy przygotowywać co sześć miesięcy. Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Przygotować 1 M NaHCO3 oraz 5 M NaCl (przechowywać oba w temperaturze pokojowej). NaHCO3 jest stabilny w roztworze jedynie przez 7 dni.
  2. Przygotowanie eksperymentu
    1. Przenieść komary do płyt akrylowych zgodnie z opisem w sekcjach 1 i 2.2. W przypadku prowadzenia porównań między różnymi genotypami, należy zastosować metodę ślepej próby względem eksperymentatora.
    2. W dniu eksperymentu przygotować 10 mL minimalnego sztucznego posiłku krwiowego (110 mM NaCl, 20 mM NaHCO3 oraz 1,5 mM ATP), dodając 750 µL roztworu 20 mM ATP, 220 µL roztworu 5 M NaCl oraz 200 µL roztworu 1 M NaHCO3 do 8,83 mL wody dejonizowanej. Wymieszać dokładnie poprzez odwracanie naczynia.
      UWAGA: Sztuczny posiłek krwiowy należy przygotować na świeżo przed każdym eksperymentem.
    3. Skonfigurować rejestrację w programie SpinView zgodnie z krokami od 2.3.4 do 2.3.8.
    4. Otworzyć plik Arduino „Red-light-Only__BB_.ino” (lub wybrany plik bodźca) dla danego eksperymentu.
  3. Przeprowadzenie prób
    1. Napipetować 650 µL minimalnego sztucznego posiłku krwiowego do każdego dołka płytki, upewniając się, że posiłek całkowicie wypełnia dołek, ale nie przelewa się.
    2. Naciągnąć kwadrat z parafilmu o wymiarach 10,2 cm na 10,2 cm na pierścieniu o średnicy 20,3 cm. Położyć parafilm na płytce, dociskając krawędzie aż do przylegnięcia. Za pomocą skalpela odciąć margines o szerokości 1,3 cm wokół płytki i podwinąć nadmiar parafilmu pod spód, aby uszczelnić posiłek.
    3. Umieścić płytkę bezpośrednio na bloku PCR, aby zapewnić maksymalny transfer ciepła (Rysunek 3A).
      UWAGA: W przypadku opto-termocyklera na powierzchni bloku PCR stosuje się czarną taśmę zasłaniającą, jednak nie jest ona wymagana dla układu blood blanket.
    4. Umieścić termoparę na powierzchni parafilmu w prawym dolnym rogu aluminiowej płytki. Podłączyć kamerę, diody LED oraz Arduino do komputera. Włączyć zasilanie. Uruchomić program „BB_thermocycler_program.x50prog” w termocyklerze.
      UWAGA: Szybkość zmian temperatury odpowiada maksymalnej prędkości rampy termocyklera, dobrana tak, aby jak najlepiej naśladować lądowanie komara na gospodarzu w celu żerowania.
    5. Przenieść płytkę akrylową z komarami na płytkę aluminiową, używając ciemnego pojemnika i przy przyciemnionym świetle w pomieszczeniu, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Należy upewnić się, że każdy dołek jest dopasowany do pozycji komarów. Sprawdzić, czy termopara znajduje się w prawym dolnym rogu płytki i styka się z parafimem, aby mierzyć temperaturę sztucznego posiłku krwiowego.
    6. Uruchomić program, ponownie przesyłając kod „Red-light-Only__BB_.ino” w środowisku Arduino IDE. Zamknąć monitor szeregowy. W programie CoolTerm nacisnąć Connect, aby zobaczyć aktualną temperaturę. Na podstawie tej temperatury początkowej dostosować temperaturę wyzwalającą (trigger temperature) w skrypcie Arduino na ok. 0,6 °C poniżej niej.
    7. W oknie CoolTerm wybrać Capture to Text/Binary File i rozpocząć zbieranie danych. Rozpocząć nagrywanie wideo w oknie zapisu w SpinView. Kliknąć Resume, aby zakończyć pauzę (hold) termocyklera. Monitorować wyjście Arduino w CoolTerm, aby upewnić się, że spadek temperatury został wykryty i próba się rozpoczęła.
    8. Po zakończeniu czasu trwania próby kliknąć Stop Recording. W CoolTerm, w zakładce Capture to Text/Binary File, wybrać Stop, aby zakończyć zapisywanie wyjścia szeregowego.
    9. Zdjąć płytkę z komarami z płytki blood blanket i przenieść je do chłodni w celu znieczulenia. Policzyć liczbę komarów z powiększonym odwłokiem zawierającym sztuczny posiłek krwiowy i zakwalifikować je jako nasycone, wliczając w to osobniki, które żerowały częściowo.
    10. Między próbami oczyścić powierzchnię bloku PCR, przecierając ją chusteczką Kimwipe zwilżoną 70% etanolem. Usunąć parafilm i opłukać aluminiową płytkę wodą dejonizowaną. Powtórzyć sekcję 3.3 dla kolejnych prób. Zmieniać kolejność prób między dniami, aby zminimalizować wpływ cyklów aktywności okołodobowej.
  4. Sprzątanie
    1. Zatrzymać wszystkie nagrywane programy i wyjść z nich. Odłączyć kable USB kamery, Arduino i lamp infrared. Wyłączyć komputer. Zatrzymać program „thermocycler_program.x50prog” działający w termocyklerze.
    2. Umieścić płytki z komarami w zamrażarce o temperaturze -20 °C na noc, aby uśmiercić owady. Umyć aluminiową płytkę wodą dejonizowaną. Zalać płytkę akrylową 70% etanolem, następnie opłukać wodą dejonizowaną i pozostawić do wyschnięcia na noc przed kolejnym załadunkiem komarów.
      UWAGA: Płytki powinny schnąć przez noc po myciu, aby upewnić się, że nie pozostała w nich wilgoć. Obecność wilgoci spowoduje skraplanie się wody na pokrywce, co zakłóci nagranie wideo.

4. Test opto-membranowej warstwy pożywkowej

  1. Montaż komponentów testu (Rycina 4)
    1. Zmontuj ramę, korzystając z komponentów optomechanicznych oraz elementu o wymiarach 30,48 cm na czarna platforma akrylowa o wymiarach 30,48 cm i grubości 0,635 cm. Za pomocą wycinarki laserowej wykonaj w centrum akrylu otwór o średnicy 11,43 cm. W każdym rogu wytnij otwory w odległości 2,54 cm, aby akryl mógł oprzeć się na wspornikach ramy, około 23,495 cm nad podstawą.
    2. W centrum przymocuj czarny pierścień akrylowy o średnicy wewnętrznej 19,05 cm i średnicy zewnętrznej 20,32 cm (Rysunek 4A). Szablony wszystkich komponentów akrylowych wraz z programami Arduino znajdują się w repozytorium GitHub opto-membrane feeder (https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0). Ogólny schemat układu przedstawiono na rysunku (Rysunek 4A), bodziec (Rycina 4B), schemat obwodu (Rycina 4C), oraz nieruchomy obraz z wideo (Rysunek 4D).
      ​UWAGA: Materiały wykorzystane do budowy tej platformy nie są krytyczne, zatem mogą być dostępne bardziej ekonomiczne rozwiązania.
    3. Zamocuj kamerę z filtrem długoprzepustowym dla podczerwieni pod otworem centralnym, skierowaną w górę w stronę pojemnika z komarami. Ustaw przysłonę w pozycji całkowicie otwartej, aby uzyskać selektywne ostrzenie na siatce znajdującej się na górze pojemnika (Rysunek 4A).
    4. Aby przygotować kanistry, należy pociąć przezroczystą rurkę poliwęglanową o średnicy 11,43 cm na cylindryczne segmenty o długości 12,7 cm.
      1. Wykonaj dna kanistrów, wycinając laserowo koła o średnicy 11,43 cm z akrylu o grubości 0,3175 cm. Krawędzie kół zostają wytrawione laserowo tak, aby można było je wsunąć do wnętrza rurki. Przymocuj je do rurek za pomocą epoksydowego kleju do tworzyw sztucznych.
      2. Wykonaj wkładkę pokrywy, używając czarnego akrylu o grubości 0,635 cm i 0,3175 cm oraz odpornej na promieniowanie UV czarnej siatki. Pierścień wewnętrzny ma średnicę 10,795 cm, natomiast pierścień zewnętrzny ma średnicę 12,065 cm, a czarna siatka jest rozciągnięta na mniejszym pierścieniu. Siatkę należy przyszyć w otworach wyciętych laserowo, używając woskowanej nici.
        ​UWAGA: Pojemniki należy zawsze stawiać na ręcznikach papierowych, aby uniknąć zarysowania akrylowych podstaw, przez które rejestrowany jest obraz wideo.
    5. Konstrukcja pojemników akrylowych do podawania posiłków krwi (Rycina 4A).
      1. Wytnij pierścień o średnicy wewnętrznej 5,08 cm i średnicy zewnętrznej 6,6 cm z przezroczystego akrylu o grubości 0,15875 cm. Przymocuj go do drugiego przezroczystego pierścienia o średnicy wewnętrznej 5,842 cm i średnicy zewnętrznej 6,604 cm, używając kleju do akryli.
      2. Umieść metalowy cylinder z siatki o wysokości 13,97 cm i średnicy 19,05 cm wewnątrz czarnego pierścienia akrylowego w centrum platformy.
      3. Wewnątrz metalowej siatki zamocuj zwoje diod LED RGB rozmieszczonych w odległości 3,81 cm od zewnętrznej ścianki pojemnika, sterowanych za pomocą płytki Arduino Uno umieszczonej na czarnej platformie akrylowej (Rysunek 4C).
      4. Za pomocą watomierza zmierz intensywność światła wewnątrz cylindra i dostosuj rozmieszczenie lamp tak, aby arena była oświetlona w zakresie od 3,5 do 6. µW/mm2Na zewnątrz metalnej siatki przymocuj do ramy za pomocą opasek zaciskowych pierścień diod LED emitujących podczerwień o długości fali 850 nm, skierowany do wewnątrz.
    6. Podłącz kabel USB do płytki Arduino Uno i połącz ją z komputerem. Podłącz kabel USB z kamery do komputera. Wyłącz połączenie z internetem.
    7. Umieść strukturę opto-membranową w ciemnym inkubatorze lub pomieszczeniu klimatycznym w temperaturze 26°C. °°C i 80% wilgotności względnej przez cały czas trwania eksperymentów.
  2. Przygotowanie pojemników z komarami
    1. Przed rozpoczęciem eksperymentu opłukać pojemniki na komary, spryskując je 70% etanolem i delikatnie wycierając miękką gąbką. Przepłukać pojemniki wodą dejonizowaną i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez noc.
    2. Na dwa dni przed eksperymentem, pod narkozą chłodniczą, posegreguj komary na samce i samice, a następnie umieść po 20 samic w każdym kanistrze. Zapewnij dostęp do ATR zgodnie z krokiem 1.6.
    3. Na tym etapie genotypy powinny być utajnione przed osobą przeprowadzającą eksperyment. Kolejność prób należy zmieniać każdego dnia, aby zminimalizować różnice w wynikach behawioralnych wynikające z czasu trwania eksperymentu.
  3. Przeprowadzanie prób
    1. Aby przygotować posiłek krwisty, należy umieścić butelki z wodą o pojemności 119 ml w 45 °łaźnia wodna, jedna dla każdej próby. Taka objętość i temperatura pozwalają utrzymać posiłek krwisty w temperaturze zbliżonej do temperatury ciała przez cały czas trwania eksperymentu.
    2. Przygotować aliquoty po 5 ml defibrynowanej krwi owczej. Przechowywać w temperaturze 4°C. °i odwrócić przed użyciem, aby zapobiec rozwarstwieniu. Posiłek krwi należy przygotować na świeżo przed każdym eksperymentem.
      OSTRZEŻENIE: Odczynniki w postaci defibrynowanej krwi owczej należy obsługiwać w odpowiednich środkach ochrony indywidualnej (PPE), aby zminimalizować ryzyko ekspozycji na patogeny. Materiały wielorazowe, które miały kontakt z krwią, należy namoczyć w 10% roztworze wybielacza, a następnie opłukać wodą dejonizowaną (DI). Ze względu na to, że wybielacz może powodować silne podrażnienie skóry i oczu, podczas pracy z nim należy przez cały czas stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej.
    3. Umieść pierwszą alikwotę krwi w 45 °kąpiel wodna o temperaturze C przez co najmniej 20 min przed próbą. Odmrozić ATP na lodzie. Rozciągnąć fragment o wymiarach 5,08 cm na kwadrat Parafilmu o boku 5,08 cm na pokrywie akrylowej po stronie z większym, płaskim okręgiem, tworząc wgłębienie na posiłek krwi (Rycina 4A).
    4. Przetrzyj komputer 70% etanolem w celu usunięcia zapachów ludzkich. Podłącz komputer do zewnętrznego dysku twardego. Podłącz kamerę oraz Arduino. Podłącz lampy RGB i podczerwone do źródła zasilania.
    5. Otwórz oprogramowanie SpinView oraz plik Arduino dla odpowiedniego bodźca. Utwórz na zewnętrznym dysku twardym folder na dane eksperymentalne. Prześlij „blue_only.ioPlik Arduino służący do dostarczania słabego niebieskiego światła o długości fali 471 nm z diod LED RGB do areny (zgodnie z Rysunek 4B).
    6. Bez wystawiania komarów na nadmiar CO22 po oddechu należy sprawdzić pojemnik pod kątem liczby osobników w próbie i odnotować wszelkie zgony przed rozpoczęciem eksperymentu. Pojemnik należy umieścić w centrum i pozostawić na 10 do 20 min w celu aklimatyzacji pod przygaszonym niebieskim światłem przed wystawieniem na bodziec.
      ​UWAGA: Etap aklimatyzacji oraz eksperyment są przeprowadzane przy przyćmionym niebieskim świetle, ponieważ całkowita ciemność hamuje lot komarów.
    7. Włącz przechwytywanie wideo
      1. W programie SpinView należy wybrać kamerę. W Ustawienia zakładka, dostosuj ekspozycję i wzmocnienie w razie potrzeby, aby zachować wysoki kontrast między jasnymi owadami a ciemnym tłem (Rycina 4D).
      2. Kliknij czerwony przycisk nagrywania na górnym pasku, aby dostosować ustawienia przechwytywania wideo. Ustaw ścieżkę pliku, klikając Przeglądajnastępnie przejdź do zewnętrznego dysku twardego. Utwórz nowy folder o opisowej nazwie dla każdej próby. W nazwie folderu nie należy używać spacji.
      3. W Opcje zapisu zakładka, wybierz Nagraj 0 klatek, co pozwoli na nagrywanie wideo aż do momentu ręcznego zatrzymania. Pod Tryb rejestracjiwybierz BuforowanyW karcie Filmy ustaw następujące pola: Typ nagrywania wideo: MJPG, Rozmiar podziału pliku wideo: 1000 MB, oraz jakość kompresji JPEG: 65.
    8. Bezpośrednio przed ekspozycją na bodziec nanieść pipetą 500 µL 20 mM ATP, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM ATP, do przygotowanej 5 ml alikwoty krwi. Odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać zawartość.
    9. Wlej roztwór ATP i krwi do pojemnika na posiłek krwawy. Na powierzchni posiłku krwawego umieść odwróconą butelkę o pojemności 119 ml wypełnioną w 45 °Woda o temperaturze C, aby utrzymać temperaturę krwi blisko temperatury ludzkiego ciała przez cały czas trwania eksperymentu.
    10. W oprogramowaniu SpinView wybierz opcję Start Recording. Bez stymulowania komarów oddechem, umieść posiłek krwiowy na górnej części siatkowej pokrywy kanistra, tak aby komary mogły przebić membranę z parafilmu przez siatkę.
    11. Prześlij the Arduino program dla „1sON_10sOFF.io” (Rysunek 4B), lub pożądany bodziec. Pozwoli to na podawanie czerwonego światła o długości fali 624 nm przez 1 s co 10 s, aż do „blue_only.ioPlik jest przesyłany ręcznie. Długość fali 624 nm jest wystarczająca do optogenetycznej aktywacji CsChrimson.
    12. Umieść alikwot krwi w łaźni wodnej w celu przeprowadzenia następnej próby. Po 15 minutach trwania próby wybierz Zatrzymaj nagrywaniePrześlij „blue_only.io” pliku, aby zatrzymać stymulację czerwonym światłem.
    13. Zdejmij uchwyt do posiłku z krwi oraz butelkę z wodą. Wyjmij kanister i znieczul komary w temperaturze 4 °C. Aby przeprowadzić dodatkowe próby, należy wrócić do sekcji 4.3. Zanieczulone komary należy poddać ocenie wizualnej w celu ustalenia i odnotowania liczby osobników, które żerowały na krwi, identyfikując brzuchy wypełnione krwią.
  4. Oczyszczanie
    1. Zamknij wszystkie programy. Usuń zewnętrzny dysk twardy i odłącz go od komputera. Wyłącz komputer.
    2. Oczyścić pojemniki na komary zgodnie z opisem w kroku 4.2.1. Oczyścić akrylowe uchwyty do posiłków krwi. Napełnić połowiczną kuwetę poliwęglanową w 2/3 objętości wodą, a następnie dodać 100 ml wybielacza.
    3. Do kuwety włóż akrylowe uchwyty na posiłek krwiowe oraz plastikowe butelki. Przykryj pokrywką i pozostaw do namoczenia na 10 min. Wypłucz podług podchlorynu sodu i usuń Parafilm. Delikatnie wyszoruj i wypłucz, aby usunąć wszelkie pozostałości krwi.

5. Analiza zachowania

  1. Przygotuj filmy do analizy, kompresując je do plików .mp4 za pomocą ffmpeg (wersja 8.0.1). Jeśli pliki wideo są podzielone, połącz je w jeden film, korzystając z dowolnego oprogramowania do edycji wideo. Otwórz filmy treningowe w programie SLEAP (wersja 1.4.1) w skali szarości.
    ​UWAGA: Jeśli ustawienia nagrywania wideo są odpowiednie, wszystko powinno znajdować się w kadrze, a poruszające się komary nie powinny być rozmyte. Można użyć innego oprogramowania do śledzenia części ciała. Wersja SLEAP użyta w niniejszej pracy to 1.4.1. Aktualne protokoły znajdują się w dokumentacji SLEAP.
  2. Stwórz szkielet etykietujący odpowiednie części ciała zwierząt zgodnie z ocenianymi zachowaniami (Rysunek 2D, Rysunek 3D oraz Rysunek 4E).
  3. Korzystając z opcji „Random frame” w zakładce Suggested frame, wybierz losowo 10 klatek i oznacz każdego komara jako osobny obiekt (instance). Jeśli niektóre części komara są zasłonięte (np. końcówka ssawki jest włożona w siatkę podczas sondowania), zaznacz przybliżoną lokalizację danej części ciała. Wytrenuj model na oznaczonych klatkach z następującymi ustawieniami:
    1. Dla modelu wieloosobniczego Top-Down (stosowanego dla opto-termocyklera i modelu kocyka krwi): w zakładce Training Pipeline ustaw Max Instances na 14. W zakładce Centroid Model Configuration ustaw Crop Size na Auto, a Plateau Min. Delta na 1e-04, Plateau Patience na 10, Stride na 8 oraz Anchor Part jako thorax.
    2. Dla modelu wieloosobniczego Bottom-Up (stosowanego dla opto-karmiarki membranowej): w zakładce Training Pipeline ustaw Max Instances na no max. W zakładce Bottom-Up Model Configuration ustaw Crop Size na Auto, a Plateau Min. Delta na 1e-04, Plateau Patience na 10 oraz Stride na 16.
  4. Wykonaj predykcję dla określonej liczby klatek z następującymi ustawieniami: w zakładce Inference Pipeline, dla opto-termocyklera i kocyka krwi, ustaw Max Instances na 14, Tracker na Simple, Max number of tracks na 14 oraz Connect Single Track Breaks na True.
  5. Dla opto-karmiarki membranowej ustaw No Max dla Max Instances oraz Max number of tracks, Tracker na Simple oraz Connect Single Track Breaks na True. Popraw przewidziane klatki i przeprowadź ponowne trenowanie. Powtarzaj cykle predykcji, etykietowania i trenowania na zbiorze danych treningowych.
    UWAGA: Walidację przeprowadzono poprzez losową kontrolną weryfikację oznaczonych klatek i identyfikację powtarzających się błędów (np. fałszywe detekcje komarów, zdublowane predykcje, nieprawidłowa orientacja lub błędne przypisanie części ciała), koncentrując się na klatkach zawierających takie przypadki szczególne. Może być wymagane do 150 oznaczonych klatek, w zależności od częstotliwości błędów. Program SLEAP oferuje również wbudowane w GUI metryki oceny do dodatkowej walidacji modelu. Po potwierdzeniu wystarczającej dokładności i precyzji w inspekcji wizualnej, zastosuj model do filmów eksperymentalnych i wyeksportuj wyniki do plików .csv lub .h5 w celu analizy zachowań. Następnie można wytrenować klasyfikatory zachowań, wykorzystując wyniki estymacji pozy, zgodnie z wcześniejszym opisem8. Zachowania definiuje się następująco: chodzenie – translacyjne ruchy ciała z ruchem odnóży; latanie – szybki ruch translacyjny z rozpostartymi skrzydłami; pielęgnacja (grooming) – powtarzalne ruchy odnóży po częściach ciała (czułki, ssawka, skrzydła lub odnóża); oraz sondowanie – wkładanie ssawki przez siatkę u dna naczynia. Klasyfikatory zachowań powinny osiągać dokładność >90% w porównaniu z adnotacjami ludzkimi.
  6. Przeprowadź analizę statystyczną, wybierając testy nieparametryczne, ponieważ dane zazwyczaj nie mają rozkładu normalnego. Wykonaj odpowiednie testy post-hoc z korektą na wielokrotne porównania. W przypadku danych dotyczących nasycenia krwią powielenia eksperymentalne stanowią grupy komarów, natomiast w przypadku danych o zachowaniu powieleniami są poszczególne komary.

Wyniki

Do obserwacji zachowań poszukiwania gospodarza i żerowania na krwi u komarów wykorzystano trzy testy behawioralne, co przedstawiono na Rysunku 1A. Komary hodowano w cyklu światła niebieskiego i ciemności (14:10 LD; Rysunek 1B), aby zsynchronizować rytmy okołodobowe i umożliwić przeprowadzenie eksperymentów w okresach aktywności. Na dwa dni przed eksperymentami komary przeniesiono do całkowitej ciemności i podano im kofaktor opsyny ATR. W przypadku komarów niesynchronizowanych lub nieotrzymujących ATR odnotowano niską aktywność w testach behawioralnych. Genotypy wykorzystane w każdym teście to Gr3>CsChrimson oraz dwie kontrole genetyczne: linia sterująca Gr3-QF2 i linia efektorowa QUAS-CsChrimson.

Analiza z użyciem opto-termocyklera (Sekcja 2) pozwala na ocenę pobudzenia i zachowań sondujących komarów przez długie okresy w odpowiedzi na bodźce cieplne i świetlne. Dostarczanie ciepła naśladuje zbliżanie się komara do ciepłokrwistego gospodarza, natomiast 5-sekundowy impuls świetlny naśladuje długi wydech powietrza3. Użycie termocyklera umożliwia szybkie nagrzewanie i chłodzenie powierzchni zsynchronizowane z aktywacją optogenetyczną za pomocą termopary i mikrokontrolera (Rysunek 2A, B). Trzy genotypy komarów umieszczono w płytkach akrylowych z izolowanymi studzienkami o dnach z siatki, w których wykazują one zachowania związane z chodzeniem, lataniem i sondowaniem (Rysunek 2C). Pozycję części ciała komarów wykrywano za pomocą algorytmów śledzenia pozy, takich jak SLEAP34 oraz DeepLabCUT35 (Rysunek 2D, E). Algorytmy klasyfikacji zachowań mogą być stosowane w oparciu o dane z śledzenia pozy (np. SimBA36, A-SOiD37) lub wideo (np. FERAL38). Rysunek 2E przedstawia etykiety SLEAP podczas lotu, chodzenia i sondowania, które są kluczowymi zachowaniami podczas poszukiwania gospodarza i żerowania. Zachowania te można sklasyfikować na podstawie prędkości poruszania się klatki piersiowej oraz odległości między nasadą a końcem trąbki. Tutaj pokazano wynik śledzenia zachowań z wykorzystaniem APT i JAABA39. Komary poddawano działaniu wzrostu temperatury, bodźca świetlnego lub jednocześnie obu bodźców, po czym następowała 20 min przerwy przed kolejnym bodźcem8 (Rysunek 2F). Po wystawieniu na ciepło wszystkie trzy genotypy wykazują krótki okres sondowania (Rysunek 2G). Co istotne, po wystawieniu na 5-sekundowy bodziec świetlny komary Gr3>CsChrimson zostają pobudzone lub „aktywowane”, wykazując zwiększoną aktywność w postaci chodzenia i latania, która trwa do 10–15 min. Komary wykazują również sondowanie, definiowane jako powtarzalne wkładanie trąbki w siatkę na dnie płytek. Dane przedstawiono jako zachowanie poszczególnych komarów (Rysunek 2G) oraz proporcję wszystkich komarów wykazujących dane zachowanie w czasie (Rysunek 2H). Opto-termocykler umożliwia powtarzalną, precyzyjną stymulację optogenetyczną i cieplną wielu osobników, co czyni go użytecznym narzędziem do badania pobudzenia i zachowań sondujących.

Test „krwawego koca” (blood blanket assay, sekcja 3) opiera się na teście z wykorzystaniem opto-termocyklera, ale dostarcza atrakcyjny sztuczny minimalny posiłek krwawy, dzięki czemu można określić stopień nasycenia się komarów (Rysunek 3A). W celu optogenetycznej aktywacji neuronów sensorycznych CO2 zastosowano 5-sekundowy impuls czerwonego światła (~627 nm), a cienką warstwę sztucznego posiłku krwawego podgrzano od 25 °C do ~35 °C (pomiar wykonano na powierzchni za pomocą termopary; Rysunek 3B). Trzem genotypom zaprezentowano sztuczny posiłek krwawy w aluminiowej płytce do karmienia (Rysunek 3C). Komary linii Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson oraz Gr3>CsChrimson (n = 10 prób na grupę genetyczną, po 14 komarów w każdej) otrzymały sztuczny posiłek krwawy w aluminiowej płytce do karmienia (Rysunek 3C). Aby zmierzyć stopień nasycenia komarów w czasie trwania eksperymentu, wykorzystano program SLEAP do śledzenia punktów na ciele komara. Osiągnięto to poprzez stworzenie szkieletu obejmującego 5 węzłów na odwłoku komara (Rysunek 3D). Na koniec każdej próby ręcznie policzono liczbę nasyconych komarów. Kontrolne linie komarów, Gr3-QF2 oraz QUAS-CsChrimson, wykazały podobny średni stopień nasycenia (Rysunek 3E, p = 0,401). W przeciwieństwie do nich, linia Gr3>CsChrimson wykazała znacznie wyższy wskaźnik żerowania, przy średnim stopniu nasycenia wynoszącym 53% (Rysunek 3E, p = 0,078 w stosunku do Gr3-QF2 oraz p = 0,0097 w stosunku do QUAS-CsChrimson). Dane przedstawiono na wykresach skrzynkowych i skrzypcowych (mediana, rozstęp międzykwartylowy i zakres) i przeanalizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa oraz testu Dunna z korektą Holma przy progu istotności p < 0,05. Nasycenie poszczególnych osobników w czasie zdefiniowano jako zmianę powierzchni odwłoka wyznaczonej przez 5 węzłów (Rysunek 3F). Wyniki te pokazują, że test „krwawego koca” może być wykorzystany do oceny wpływu optogenetycznej aktywacji populacji neuronów reagujących na CO2 na zachowanie żerowania komarów na sztucznym posiłku krwawym.

Test z karmnikiem opto-membranowym (Sekcja 4), w którym komary otrzymują dostęp do ciepłego posiłku z krwi w cylindrycznej arenie, pozwala na badanie atrakcyjności źródła krwi dla komarów oraz stopnia ich nasycenia. Aby ustalić, czy optogenetyczna aktywacja neuronów sensorycznych CO2 jest wystarczająca, aby wywołać przyciąganie do źródła krwi i żerowanie na nim, komary Gr3>CsChrimson oraz kontrolne (n = 10 dla każdego genotypu, gdzie n oznacza liczbę przeprowadzonych prób, przy 20 komarach na pojemnik w każdej próbie) poddano działaniu ciepłego posiłku z krwi w karmniku opto-membranowym podczas ekspozycji na powtarzające się 1-sekundowe impulsy jasnego czerwonego światła co 10 s przez okres 15 min (Rycina 4B). Aby zmierzyć przyciąganie do karmnika membranowego, użyto modelu SLEAP z trzema punktami do śledzenia głowy, klatki piersiowej i odwłoka wylądowanych komarów, licząc te, które znajdowały się w obszarze zainteresowania (Rycina 4D, Rycina 4E). Komary Gr3>CsChrimson wykazały zwiększone przyciąganie do obszaru posiłku z krwi w czasie w porównaniu z kontrolą Gr3-QF2 (Rycina 4F, p = 0,027). Komary Gr3>CsChrimson nie wykazały statystycznie wyższego przyciągania niż grupa QUAS-CsChrimson (Rycina 4F, p = 0,310). Grupy istotności określono za pomocą testu Kruskala-Wallisa, a następnie testu Dunna z korektą Holma. Próg istotności ustalono na poziomie p < 0,05. Dane przedstawiono jako średni procent komarów przyciągniętych do posiłku z krwi, gdzie obszar zacieniony oznacza błąd standardowy. Genotypy kontrolne Gr3-QF2 oraz QUAS-CsChrimson wykazały podobny stopień nasycenia, odpowiednio 26% i 29%, oceniany ręcznie zgodnie z opisem (Rycina 4G, p = 0,351). W przeciwieństwie do nich, komary Gr3>CsChrimson wykazały znacznie wyższy wskaźnik nasycenia niż obie grupy kontrolne, średnio 61% (Rycina 4G, p < 0,01 względem Gr3-QF2 oraz p = 0,002 względem QUAS-CsChrimson). Dane przedstawiono za pomocą wykresów skrzypcowych i pudełkowych (mediana, rozstęp międzykwartylny i zakres) i przeanalizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa oraz testu Dunna z korektą Holma przy progu istotności p < 0,05. Wyniki te wskazują, że test z karmnikiem opto-membranowym jest skuteczną metodą oceny wpływu optogenetycznej aktywacji neuronów CO2 na przyciąganie komarów i ich nasycenie posiłkiem z krwi.

Wykres badania zachowania komarów; metody: opto-termocykler, koc krwi; bodźce: ciepło, CO2.
Rysunek 1Analizy i hodowla w optogenetyce komarów. (A) Schemat zachowań komarów podczas poszukiwania żywiciela wraz z charakterystyką przedstawionych testów behawioralnych. Etapy poszukiwania żywiciela mierzone w każdym teście behawioralnym zaznaczono szarymi paskami. (BHarmonogram hodowli komarów do eksperymentów optogenetycznych. Rycina 1 została stworzona przez autorów na potrzeby niniejszej publikacji przy użyciu programu Adobe Illustrator i nie wymaga licencji do użytkowania. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Zachowanie komarów, termocykler podczerwieni, układ z czerwonym światłem LED, analiza wykresów, odpowiedź na bodziec.
Rycina 2Opto-termocykler służy do ilościowego określania zachowań pobudzenia i poszukiwania podczas aktywacji optogenetycznej. (ASchemat badania z użyciem opto-termocyklera, składającego się z płytki z komarami umieszczonej w bloku termocyklera PCR z diodami LED i kamerą nad głowicą.B) Schemat obwodu mikrokontrolera, który wykrywa temperaturę termocyklera i steruje diodami LED. Schemat obwodu stworzony w programie Fritzing na licencji CC-BY-SA 3.0 (https://github.com/fritzing/fritzing-app/blob/develop/README.md). Licencja ta zezwala również na pełne ponowne wykorzystanie obrazu, pod warunkiem właściwego przypisania autorstwa. (CZdjęcie z analizy przedstawiające płytkę akrylową, w której umieszczono do 14 komarów. Termopara znajduje się w prawym dolnym otworze.D) Szkielet komara użyty w modelu SLEAP do szacowania póz. Punkty zaznaczone na ciele obejmują: wierzchołek i nasadę trąbki, używane do wykrywania zachowań sondowania (zaznaczone na czerwono); przednie odnóża w miejscach ich połączenia z tułowiem, połączenia uda z golenią oraz połączenia goleni z stopą (zaznaczone na niebiesko) oraz koniec odwłoka (zaznaczone na żółto). Zastosowano model wieloorganizmowy z widokiem z góry. Do ilościowej oceny pobudzenia i zachowań sondowania komarów wykorzystano estymatory póz oraz klasyfikatory behawioralne. (E) Przykłady chodzenia, lotu i sondowania komarów z nałożonymi predykcjami SLEAP. Chodzenie i lot są wykorzystywane jako wskaźniki behawioralne pobudzenia. (F) Wyjście systemu dostarczania bodźców. Żółte faliste linie oznaczają bodźce termiczne w postaci ciepła, a czerwone diody LED oznaczają bodźce w postaci czerwonego światła. (G) Etogramy zachowań związanych z chodzeniem, lataniem i sondowaniem u Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson, i Gr3>CsChrimson komary (n = 2–23 pojedyncze komary na genotyp) po podaniu bodźca. (H) Długotrwałe zachowanie po aktywacji optogenetycznej w Gr3>CsChrimson komary (n = 68–70 pojedynczych komarów). Panele A–E na rysunku zostały stworzone przez autorów na potrzeby niniejszej publikacji przy użyciu programu Adobe Illustrator i nie wymagają licencji autorskiej do użytkowania. Dane w panelach (F–H) zostały przedrukowane z pracy Sorrells et al, 202, na podstawie licencji CC BY 4.08. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ eksperymentu żywienia komarów, wykresy analizy danych, schemat sztucznego posiłku krwi, wykres temperatury.
Rycina 3Test krwawego płaszcza (blood blanket assay) pozwala na ilościowe określenie stopnia wypełnienia krwi w odpowiedzi na aktywację optogenetyczną. (A) Schemat testu z kocem krwi. Komar znajduje się w akrylowej klatce, w której dostępna sztuczna krew jest podana pod siatką. (B) Odczyt temperatury i bodźca w postaci czerwonego światła z analizy. (C) Schemat zespołu płytki doprowadzającej alumianową warstwę krwi. (DSzkielet SLEAP wykorzystany do estymacji pozy obejmował punkty opisane na rysunku 2D, a także cztery punkty wzdłuż boków odwłoka w miejscach jego styku z klatką piersiową oraz krawędzie najgrubszej części odwłoka. Stopień wypełnienia mierzono jako pole powierzchni wyznaczone przez pięć punktów wzdłuż obwodu odwłoka, wykorzystując predykcje z modelu wielo-zwierzęcego typu top-down.E) Wykres skrzypcowy przedstawiający średnią procentową wartość nasycenia sztucznym pokarmem krwiowym w zależności od genotypu (n = 10 prób po 14 komarów na próbę dla każdego genotypu). Istotność określono za pomocą testu Kruskala-Wallisa, a następnie testu Dunna z korektą Holma. Różne litery oznaczają istotność na poziomie p < 0,05 między grupami, gdzie grupy oznaczone tą samą literą nie różnią się od siebie istotnie statystycznie. (Fstopień obrzęku w czasie w Gr3>CsChrimson zwierzęcia, mierzone w obszarze jamy brzusznej. Czerwona linia trendu przedstawia 30-sekundowe okno przesuwne w trakcie ośmiominutowego okresu próby, gdzie x = 0 oznacza czas rozpoczęcia pęcznienia. Wszystkie schematy na Rysunku 3 zostały przygotowane przez autorów na potrzeby niniejszej publikacji w programie Adobe Illustrator; ich wykorzystanie nie wymagało licencji autorskiej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Układ optogenetyczny dla komarów; sterowanie światłem RGB; Arduino; posiłek krwi; wykres procentowej atrakcyjności; wyniki.
Rysunek 4Test z opto-membranowym karmnikiem służy do pomiaru atrakcyjności oraz żerowania na krwi. (A) Schemat podajnika z opto-membraną z poszczególnymi komponentami. (B) Oś czasu prób eksperymentalnych. Niebieska linia reprezentuje słabe niebieskie światło przez cały okres aklimatyzacji i eksperymentu. Przedstawiono fragment bodźca eksperymentalnego, reprezentujący 1-sekundowe impulsy czerwonego światła w odstępach 10 s. (C) Schemat przedstawiający okablowanie podajnika z opto-membraną. Schemat obwodu stworzony w programie Fritzing przez autorów na licencji CC-BY. (D) Przykładowa klatka z filmu przedstawiającego karmidło z opto-membraną. Komary w czerwonym okręgu są liczone w celu określenia procentu przyciągania. (EPrzykłady komara nienasyconego i komara nasyconego, z głową, tułowiem i odwłokiem oznaczonymi przez model śledzenia SLEAP dla opto-membranowego karmnika. Do pomiaru atrakcyjności obszaru zainteresowania, w którym umieszczono posiłek krwi, wykorzystano model SLEAP typu bottom-up dla wielu zwierząt.F) Wykres liniowy przedstawiający średni procentowy czas przebywania w obszarze posiłku krwi (wykorzystywany jako wskaźnik behawioralny lądowania) w czasie, z podziałem na genotyp (n = 10 prób po 20 komarów na genotyp). Średnie wykreślono co 30 s. Obszary zacieniowane przedstawiają błąd standardowy. Istotność określono za pomocą testu Kruskala-Wallisa, a następnie testu Dunna z korektą Holma. Różne litery reprezentują grupy istotnie różniące się od siebie; próg określono jako p < 0.05. (G) Wykres skrzypcowy przedstawiający średni procent nasycenia posiłkiem krwi w zależności od genotypu. W (F, G), istotność określono za pomocą testu Kruskala-Wallisa, a następnie testu Dunna z poprawką Holma. Genotypy oznaczone tą samą literą nie różnią się od siebie istotnie. Próg istotności określono jako p < 0.05. Rysunek 4 został stworzony przy użyciu programu Adobe Illustrator, dane do niego zostały zebrane przez autorów na potrzeby niniejszej publikacji i nie było wymagane uzyskanie licencji autorskiej do jego wykorzystania. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Niniejszy artykuł opisuje szczegółowe protokoły badania wystarczalności poszczególnych typów komórek neuronalnych w sterowaniu etapami przyciągania gospodarza i kąsania. Zachowanie związane z kąsaniem składa się z serii kroków behawioralnych: od detekcji z dalekiej odległości, przez przyciąganie z bliskiej odległości, aż po przebicie skóry i wyssanie krwi. W teorii typy neuronów mogą kontrolować konkretne działania lub etapy, kierować zachowaniem w stronę określonych sekwencji, wydłużać czas trwania całego procesu lub pełnić wiele innych funkcji. W związku z tym przedstawione wielokrotne testy są niezbędne do przeanalizowania funkcji neuronalnej w tym procesie.

Kilka powszechnych błędów może prowadzić do słabej odpowiedzi komarów w tych testach. Niską aktywność i brak żerowania można uniknąć, przeprowadzając eksperymenty w czasie szczytowej aktywności komarów, blisko czasu przejścia między cyklami światła i ciemności w ich komorach inkubacyjnych. Niska efektywność żerowania w przypadku koców krwi (blood blanket) oraz karmników z opto-membraną może wynikać z niskiej jakości sztucznego pokarmu krwi lub niewłaściwej temperatury. Należy upewnić się, że wszystkie odczynniki (NaHCO3, ATP, defibrynowana krew owcza) nie są przeterminowane i są przechowywane prawidłowo. Zaleca się przygotowanie wszystkich roztworów w dniu eksperymentu, aby zapewnić ich maksymalną świeżość. Należy upewnić się, że płytka z kocem krwi bezpośrednio styka się z powierzchnią bloku termocyklera PCR. Na płytkach opto-termocyklera i koców krwi może skraplać się woda, jeśli występuje resztkowa wilgoć. Przed eksperymentami należy położyć płytki na ręcznikach papierowych, aby wchłonęły wszelką wilgoć. W przypadku słabej odpowiedzi optogenetycznej należy upewnić się, że komary mają co najmniej tydzień i mają wystarczająco dużo czasu na pobieranie ATR, ponieważ jest on niezbędnym kofaktorem chemicznym dla kanałów CsChrimson.

Stworzono narzędzia optogenetyczne czułe na długości fal od niebieskiej (~450 nm) do czerwonej (~650 nm), obejmujące widmo widzialne. Światło czerwone jest szczególnie użyteczne u owadów, ponieważ zazwyczaj wykazują one niską wrażliwość i/lub brak odpowiedzi behawioralnych na te długości fal40. Co ciekawe, komary podczas lotu wykazują przyciąganie do obszarów bodźców wizualnych o długich falach obecnych w odcieniach ludzkiej skóry41. Zatem stosowanie światła czerwonego mogłoby być ograniczeniem zaburzającym interpretację aktywacji optogenetycznej w testach przyciągania gospodarza u komarów. Jednakże, genetyczne kontrolne komary wykazały minimalne reakcje na szeroko stosowane światło czerwone, nawet przy dużym natężeniu (Ryciny 2–4). Aby zapewnić dokładną interpretację efektów behawioralnych, zaleca się stosowanie kontroli genetycznych pozbawionych konstruktu sterującego lub efektorowego, a także kontroli bez naświetlania. W eksperymentach optogenetycznych u innych gatunków często stosuje się kontrolę pozbawioną kofaktora rodopsyny ATR; jednakże pokarm dla ryb używany do karmienia larw komarów zawiera witaminę A, będącą prekursorem ATR, co czyni tę metodę mniej skuteczną kontrolą w tym systemie.

Przedstawione tutaj bodźce optogenetyczne ograniczają się do stymulacji ciągłej o regulowanej intensywności światła. Bodźce optogenetyczne, które ściśle odwzorowują naturalne wzorce aktywności neuronalnej, z największym prawdopodobieństwem wywołają interesujące nas zachowanie. Dlatego, w przypadku dostępności zapisów neuronalnych, bodziec może zostać zaprojektowany tak, aby odpowiadał zaobserwowanej intensywności i dynamice czasowej. Gdy nie są one znane, funkcję neuronów można badać za pomocą różnych bodźców i kontekstów behawioralnych, z zastrzeżeniem, że wyniki mogą nie odzwierciedlać funkcji neuronów w zachowaniu naturalnym. Niemniej jednak, wymuszanie aktywności neuronów poza naturalnym zakresem może być wykorzystane do badania obwodów lub właściwości behawioralnych w unikalny sposób, podobnie jak elektrofizjologia może być wykorzystana do badania właściwości komórkowych. Obecnie narzędzia optogenetyczne były stosowane jedynie w neuronach sensorycznych komara, co w porównaniu z dostarczaniem bodźców naturalnych daje pewne korzyści. Tradycyjne strategie pomiaru poszukiwania żywiciela przez komary opierają się na dostarczaniu prawdziwego gazu CO2. Użycie prawdziwego CO2 wymaga przepływu powietrza, które zostało przefiltrowane i nawilżone, co wymaga złożonych układów eksperymentalnych, aby móc precyzyjnie dostarczać i usuwać gaz w krótkich odstępach czasu9,10,42,43. Zarówno przepływ powietrza, jak i wilgotność są sygnałami przyciągającymi komary i pomagającymi w nawigacji, co sprawia, że stymulacja optogenetyczna jest atrakcyjną metodą badania wpływu bodźców węchowych oddzielnie od tych innych czynników. Narzędzia optogenetyczne były wcześniej wykorzystywane również do badania wpływu płci i stanu fizjologicznego na zachowanie8, dostarczając wglądu w te istotne kwestie w biologii komarów.

Poza optogenetyką, protokoły te wykorzystują standardowe testy stosowane do oceny zachowania komarów, które wiążą się z pewnymi ograniczeniami. W celu ułatwienia oczyszczania, w tzw. „kocyku z krwi” (blood blanket) wykorzystuje się sztuczny pokarm zawierający jedynie substancje smakowe niezbędne do pobudzenia komarów do żerowania. Ograniczenie to można byłoby wyeliminować poprzez zastosowanie krwi (podobnie jak w karmniku z opto-membraną) lub materiałów biomimetycznych, które odwzorowują aspekty tkanki gospodarza. Ciepło w opto-termocyklerze oraz „kocyku z krwi” jest dostarczane do komarów chodzących lub stojących, a nie latających, i jest ograniczone prędkością zmian temperatury termocyklera PCR. W związku z tym testy te pozwalają wykryć zachowania związane z nakłuwaniem i żerowaniem, ale nie z atrakcyjnością. Innym ograniczeniem testów laboratoryjnych jest fakt, że aby zrozumieć behawioralny efekt konkretnych sygnałów, wyklucza się inne bodźce wykorzystywane przez komary. W celu zbadania dodatkowych aspektów naturalnych środowisk, w których komary żerują na swoich gospodarzach, można by opracować coraz bardziej złożone testy laboratoryjne oraz testy półpolowe.

Kolejnym ograniczeniem optogenetyki u komarów jest fakt, że stworzono niewiele linii sterujących poza tymi dla neuronów sensorycznych. Zatem jej pełny potencjał zostanie zrealizowany, gdy zostanie ona połączona z liniami sterującymi wykazującymi ekspresję w interneuronach, których nie można bezpośrednio stymulować za pomocą innych metod. Nowo powstające zasoby, takie jak Aedes aegypti Mosquito Cell Atlas, otwierają drogę do postępów w neurogenetyce komarów44. Przyszłe prace będą niezbędne do opracowania takich linii sterujących w celu badania obwodów neuronalnych komarów. Podobnie, potrzebne są dodatkowe narzędzia optogenetyczne do inhibicji, aby określić, czy dany typ neuronu jest niezbędny dla konkretnego zachowania. Chociaż testy przedstawione w niniejszej pracy zostały zaprojektowane w celu pomiaru atrakcyjności gospodarza i pobierania krwi, podejścia te można rozszerzyć na badanie dodatkowych etapów poszukiwania gospodarza oraz zachowań takich jak kopulacja, składanie jaj i pobieranie nektaru. Badania optogenetyczne dostarczą nowych informacji na temat tego, jak zachowanie komarów jest kontrolowane na poziomie obwodów neuronalnych, i mogą doprowadzić do nowych metod zapobiegania rozprzestrzenianiu się chorób przenoszonych przez komary.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Kim Lezon-Geyda, Fernande Medeiros Contini oraz Yaoyu Jiao za uwagi do manuskryptu. Badania te zostały sfinansowane z grantu NIH DP2AI177891. Dziękujemy jednostce Neurotechnology Core, finansowanej przez Yale Kavli Institute for Neuroscience, za pomoc techniczną. T.S. jest stypendystą HHMI Freeman Hrabowski Scholar.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1⁄8-calowy czarny akrylMcMaster-Carr8650K32Struktura optomembranowego systemu dozowania
1⁄Przezroczysty akryl 8 caliMcMaster-Carr8536K134Kanister z optomembranowym systemem podawania pokarmu
¼ Czarny akryl calowyMcMaster-Carr8560K259Struktura optomebranowego podajnika
Zasilacz ACJameco ReliaPro2197581Struktura opto-membranowego systemu podawania pokarmu
Klej akrylowyUnited States Plastic Corp 97562Kanister z opto-membranowym podajnikiem, klatka z krwawą warstwą ochronną
Adenozyna 5′uwodniona sól disodowa trójfosforanuSigma AldrichA6419-1GSztuczny posiłek krwisty
Wszystko-trans-retinalSpectrum ChemicalR3041-1GMWychowywanie optogenetyczne
Aluminiowa płyta optycznaThorlabsMB12Struktura optomembranowego podajnika
Blacha aluminiowa 0,03125 calaMcMaster-Carr89015K11Płytka do karmienia z warstwą krwi
Blacha aluminiowa 0,0625 calaMcMaster-Carr89015K37Płytka do karmienia z warstwą krwi
System śledzenia części zwierząt (APT)Laboratorium Bransona w HHMI Janelia FarmPonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przetłumaczyć z języka angielskiego na polski zgodnie z wytycznymi.Wersja 3.0, dane powtórzone z opto-termocyklera (Rysunek 2), pobrane 9 lipca 2020 r.
Środowisko programistyczne Arduino IDEArduinoPonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski. Jestem gotowy do przygotowania profesjonalnego tłumaczenia naukowego zgodnie z Twoimi wytycznymi.Wersja 1.8.12, stosowana do kontroli bodźców dla opto-termocyklera, koca grzewczego do krwi, &doza opto-membranowa
Płytka mikrokontrolera Arduino Uno Rev3ArduinoA000066 Programowanie optomebranicznego podajnika
Czarna siatka przeciw owadom z włókna szklanegoPrzełomowe produkty klasy premium IHLRS3684BLKlatka z krwawym kocem
Czarna taśmaThorlabsT137-2.0Opto-termocykler
Czarne opaski zaciskowe Opaski zaciskowe i inne akcesoriact242Struktura optomembranowego podajnika
Zasłona zaciemniającaSklep z wyposażeniem6520SFOpto-termocykler i koc grzewczy do krwi
Niebieskie diody LED21LEDUSARB5730BLWPHodowla komarów
ButelkaButelka SKS &Pakowanie0604-07Podgrzewacz krwi z optyczną membraną doprowadzającą
Granulaty dla ryb żerujących przy dnieInterfejs programistyczny aplikacji (API)5352983Karmienie larw
KameraKuczmanówkaU3-13S2M-CS, FLINagrywanie wideo dla analiz biochemicznych
Licznik kliknięćULineH-7350Przerzedzanie larw
KomputerAsus X1407QPrzeprowadzanie analiz
Stężony wybielacz (8,25% podchlorynu sodu)VWR89501-620Czyszczenie opto-membranowego dozownika
CoolTermOprogramowanie bezpłatne Rogera MeieraNie dotyczyWersja 2.0.1, używana do rejestracji portu szeregowego dla opto-termocyklera, koca grzewczego do krwi, &podajnik z optomembraną i wzmacniaczem
Defibrynowana krew owcza Laboratoria Hemostat DSB100Posiłek krwi dla karmnika z opto-membraną
Śruba imbusowa 4-40 z półokrągłym łbemMcMaster-Carr92949A105Płytka do karmienia z warstwą krwi
EpoksydLoctite1363118Akrylowa płytka opto-termocyklera, struktura podajnika opto-membran
EtanolDecon Labs2716Dekontaminacja
Zewnętrzny dysk twardyLaCieLAC9000298Przechowywanie wideo
ffmpegFFmpegNie dotyczyWersja 8.0.1, wstępne przetwarzanie wideo
Bawełniany knot o długości czterech caliRichmond Dental201226Karmienie dorosłych komarów
GitHubGitHub, Inc.Brak danychRepozytoria kodu, plików części oraz modeli SLEAP dla opto-termocyklera (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0), koca grzewczego do krwi (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/bloodblanket/releases/tag/v1.0.0) oraz opto-podajnika membranowego (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0)
Gr3>CsChrimsonPonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski.N/AOpracowane na potrzeby niniejszego badania, opisane w kroku 1.2
Komary Gr3-QF2Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski.Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski.Odczynnik genetyczny, DOI: 10.1016/j.cell.2013.12.044
Inkubator z nieprzezroczystymi drzwiamiCaron7340-25Hodowla komarów
Dioda LED emitująca światło podczerwoneAdafruit387Opto-termocykler i koc grzewczy do krwi
Taśma LED na podczerwieńWaveform Lighting7031.85Optotermocykler, kocyk grzewczy do krwi oraz struktura optomembrany
Filtr przepuszczający podczerwieńEdmund Optics65-796Nagrywanie wideo dla analiz biologicznych 
Klatka dla owadówBugdormDP1000Klatka dla dorosłych komarów
Automatyczny Adnotator Zachowań Zwierząt Janelia (JAABA)Laboratorium Bransona w HHMI Janelia FarmPonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia (N/A), proszę o wprowadzenie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski. Jestem gotowy do przygotowania profesjonalnego przekładu naukowego zgodnie z Twoimi wytycznymi.Dane odtworzone przez opto-termocykler (Rycina 2); Wersja 0.5.0
Duży kubek na zupęWebstaurantStore50016SOUPPLAHodowla komarów
Radiator LEDLuxeon StarN25-15BOptotermocykler i koc grzewczy do krwi
Soczewka LEDLuxeon Star10209Opto-termocykler i koc grzewczy do krwi
Uchwyt soczewki LEDLuxeon Star10235Optotermocykler i koc grzewczy do krwi
Taśma soczewkowa LEDLuxeon StarLT-01Opto-termocykler i koc grzewczy do krwi
Światło LEDLuxeon StarSP-01-D9Bodziec światłem czerwonym dla opto-termocyklera i koca grzewczego do krwi
Taśma termoprzewodząca do LEDLuxeon StarLXT-S-12Opto-termocykler i koc do ogrzewania krwi
Szyny do montażu optycznegoThorlabsXE25L12, XE25L24, XE25L09, XE25T4, RA90, TRA6, TR12Struktura opto-termocyklera i koca grzewczego do krwi
Słupek optyczny ThorlabsTR12Struktura opto-membranowego podajnika
Ręczniki papierowePacific Blue27385Czyszczenie kanistra
ParafilmAmcorPM-996Membrana krwawego koca, opto-membranowy pojemnik na posiłki
Termocykler PCREppendorf2231001196Opto-termocykler i koc grzewczy do krwi
Plastikowy kubek porcjowyWybór999P2CKarmienie dorosłych komarów
Plastikowa pokrywka do kubka porcjyjnegoWybór999PL2Karmienie dorosłych komarów
Kuweta poliwęglanowaCambro21410CWCHCLHodowla larw 
Kuweta z poliwęglanu, rozmiar 1/2 GNCambro24CW135 Oczyszczanie membran optycznych z osadów organicznych
Pokrywa do połowy pojemnika z poliwęglanuCambro20CWCH135 Oczyszczanie opto-membranowych systemów filtracyjnych
Pokrywa do kuwety poliwęglanowejCambro10CWCH135Hodowla larw
Probówka poliwęglanowaMcMaster-Carr8585K56Kanister do zasilania z opto-membraną 
WatomierzSpójny1299161Wszystkie analizy
Komary QUAS-CsChrimsonPonieważ nie podano tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o dostarczenie treści, którą należy przełożyć na język polski. Jestem gotowy do przygotowania profesjonalnego tłumaczenia naukowego zgodnie z wytycznymi dla treści JoVE.Ponieważ nie podano tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski. Jestem gotowy do przygotowania profesjonalnego tłumaczenia naukowego zgodnie z Twoimi wytycznymi.Odczynnik genetyczny, DOI: 10.7554/eLife.76663
Światła RGBDigikey 289-1189-NDDostarczanie bodźców przez opto-membranowy system podawania pokarmu
Zacisk kątowyThorlabsRA90Struktura opto-membranowego podajnika
taśma Scotch Magic Tape3M104Opto-termocykler i akrylowa pokrywa koca grzewczego do krwi
Uszczelka silikonowa, 0,5 mmMcMaster-Carr1460N22Płytka do hodowli z warstwą krwi
SLEAPLaboratorium TalmoJako że nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski. Po otrzymaniu tekstu przygotuję profesjonalne tłumaczenie zgodnie z wytycznymi dla treści naukowych i edukacyjnych JoVE.Wersja 1.4.1a2, śledzenie pozy komarów w każdym z testów
Wodorowęglan sodu, roztwór buforowy 1M, pH 8,0Thermo ScientificJ62495.APSztuczny posiłek krwisty
roztwór chlorku soduSigma-AldrichS5150-1L 100 3532552Sztuczny posiłek krwi
SpinViewTeledyne Vision SolutionsNie dotyczyWersja 1.27.0.48, oprogramowanie do rejestracji wideo dla wszystkich trzech testów
Butelka z atomizeremUlineS-11686Dezynfekcja
SacharozaSigma AldrichS0389-500GKarmienie dorosłych komarów
Termopara (typ T)Harold G Schaevitz Industries LLCCPTC-120-X-NOpto-termocykler i koc grzewczy do krwi
Wzmacniacz termoparyAdafruitMAX31856Opto-termocykler i koc grzewczy do krwi
TimerEnduraLightRAC-MTKontrola cyklu świetlnego w hodowli komarów
Pipeta transferowa Thermo ScientificSAM-225Przerywanie larw
Worek na odpadyUlineS-23040Transport owadów
Siatka odporna na promieniowanie UVMcMaster-Carr 87655K13Kanister dozujący z membraną optyczną
WodaSigma AldrichW4502-1LSztuczny posiłek krwiowy do koca krwiowego
Nici woskowaneMcMaster-Carr6356K91Pokrywa kanistra z opto-membraną
Siatka drucianaMcMaster-Carr9322T65Struktura opto-membranowego podajnika

Bibliografia

  1. UNICEF, UNDP, World Bank, WHO Special Program for Research and Training in Tropical Diseases. Global vector control response 2017-2030. Geneva: World Health Organization; 2017.
  2. Knight KL, Stone A. A catalog of the mosquitoes of the world (Diptera: Culicidae). Lanham (MD): Entomological Society of America; 1959.
  3. Raji JI, DeGennaro M. Genetic analysis of mosquito detection of humans. Curr Opin Insect Sci. 2017;20:34-38.
  4. Coutinho-Abreu IV, Riffell JA, Akbari OS. Human attractive cues and mosquito host-seeking behavior. Trends Parasitol. 2022;38(3):246-264.
  5. McMeniman CJ, Corfas RA, Matthews BJ, Ritchie SA, Vosshall LB. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 2014;156(5):1060-1071.
  6. Gillies MT. The role of carbon dioxide in host-finding by mosquitoes (Diptera: Culicidae): a review. Bull Entomol Res. 1980;70(4):525-532.
  7. Geier M, Bosch O, Boeckh J. Influence of odor plume structure on upwind flight of mosquitoes towards hosts. J Exp Biol. 1999;202(Pt 12):1639-1648.
  8. Sorrells TR, Pandey A, Rosas-Villegas A, Vosshall LB. A persistent behavioral state enables sustained predation of humans by mosquitoes. eLife. 2022;11:e76663.
  9. Dekker T, Geier M, Cardé RT. Carbon dioxide instantly sensitizes female yellow fever mosquitoes to human skin odors. J Exp Biol. 2005;208(15):2963-2972.
  10. van Breugel F, Riffell J, Fairhall A, Dickinson MH. Mosquitoes use vision to associate odor plumes with thermal targets. Curr Biol. 2015;25(16):2123-2129.
  11. Liu MZ, Vosshall LB. General visual and contingent thermal cues interact to elicit attraction in female Aedes aegypti. mosquitoes. Curr Biol. 2019;29(13):2250-2257.e4.
  12. Chandel A, DeBeaubien NA, Ganguly A, et al. Thermal infrared directs host-seeking behavior in Aedes aegypti. mosquitoes. Nature. 2024;633(8030):615-623.
  13. Tang R, Busby R, Laursen WJ, Keane GT, Garrity PA. Functional dissection of mosquito humidity sensing reveals distinct Dry and Moist Cell contributions to blood feeding and oviposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(35):e2407394121.
  14. Burgess L. Probing behavior of Aedes aegypti. (L.) in response to heat and moisture. Nature. 1959;184(4703):1968-1969.
  15. Hol FJ, Lambrechts L, Prakash M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 2020;9:e56829.
  16. Martin-Martin I, Williams AE, Calvo E. Determination of mosquito probing and feeding time to evaluate mosquito blood feeding. Cold Spring Harb Protoc. 2023;2023(6):pdb.top107659.
  17. Boyd MF, Stratman-Thomas WK. Studies on benign tertian malaria. VII. Some observations on inoculation and onset. Am J Epidemiol. 1934;20(2):488-495.
  18. Swanson MM, Poodry CA. The shibire(ts) mutant of Drosophila: a probe for the study of embryonic development. Dev Biol. 1981;84(2):465-470.
  19. Sweeney ST, Broadie K, Keane J, Niemann H, O'Kane CJ. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 1995;14(2):341-351.
  20. Baines RA, Uhler JP, Thompson A, Sweeney ST, Bate M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J Neurosci. 2001;21(5):1523-1531.
  21. Hamada FN, Rosenzweig M, Kang K, et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 2008;454(7201):217-220.
  22. Corfas RA, Vosshall LB. The cation channel TRPA1 tunes mosquito thermotaxis to host temperatures. eLife. 2015;4:e11750.
  23. Greppi C, Laursen WJ, Budelli G, et al. Mosquito heat-seeking is driven by an ancestral cooling receptor. Science. 2020;367(6478):681-684.
  24. Allen WE, DeNardo LA, Chen MZ, et al. Thirst-associated preoptic neurons encode an aversive motivational drive. Science. 2017;357(6356):1149-1155.
  25. Inagaki HK, Jung Y, Hoopfer ED, et al. Optogenetic control of Drosophila courtship using a red-shifted channelrhodopsin reveals experience-dependent influences. Nat Methods. 2014;11(3):325-332.
  26. Sahel JA, Boulanger-Scemama E, Pagot C, et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nat Med. 2021;27(7):1223-1229.
  27. Klapoetke NC, Murata Y, Kim SS, et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 2014;11(3):338-346.
  28. Deisseroth K. Optogenetics. Nat Methods. 2011;8(1):26-29.
  29. Potter CJ, Tasic B, Russler EV, Liang L, Luo L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 2010;141(3):536-548.
  30. Herre M, Goldman OV, Lu TC, et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 2022;185(17):3104-3123.e28.
  31. Wohl MP, McMeniman CJ. Batch rearing Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2023;2023(3):pdb.prot108017.
  32. American Committee of Medical Entomology, American Society of Tropical Medicine and Hygiene. Arthropod containment guidelines, version 3.2. Vector Borne Zoonotic Dis. 2019;19(3):152-173.
  33. Pleil JD, Wallace MAG, Davis MD, Matty CM. The physics of human breathing: flow, timing, volume, and pressure parameters for normal, on-demand, and ventilator respiration. J Breath Res. 2021;15(4):042002.
  34. Pereira TD, Tabris N, Matsliah A, et al. SLEAP: a deep learning system for multi-animal pose tracking. Nat Methods. 2022;19(4):486-495.
  35. Mathis A, Mamidanna P, Cury KM, et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 2018;21(9):1281-1289.
  36. Goodwin NL, Choong JJ, Hwang S, et al. Simple Behavioral Analysis (SimBA) as a platform for explainable machine learning in behavioral neuroscience. Nat Neurosci. 2024;27(7):1411-1424.
  37. Tillmann JF, Hsu AI, Schwarz MK, Yttri EA. A-SOiD, an active-learning platform for expert-guided, data-efficient discovery of behavior. Nat Methods. 2024;21(4):703-711.
  38. Skovorodnikov P, Zhao J, Buck F, et al. FERAL: a video-understanding system for direct video-to-behavior mapping. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.11.16.688666.
  39. Kabra M, Robie AA, Rivera-Alba M, Branson S, Branson K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nat Methods. 2013;10(1):64-67.
  40. Autrum H, Bennett MF, Diehn B, et al. Comparative physiology and evolution of vision in invertebrates. A: Invertebrate photoreceptors. Berlin: Springer; 1979.
  41. Alberto DAS, Rusch C, Zhan Y, Straw AD, Montell C, Riffell JA. The olfactory gating of visual preferences to human skin and visible spectra in mosquitoes. Nat Commun. 2022;13(1):555.
  42. Dekker T, Cardé RT. Moment-to-moment flight maneuvers of the female yellow fever mosquito (Aedes aegypti. L.) in response to plumes of carbon dioxide and human skin odor. J Exp Biol. 2011;214(Pt 20):3480-3494.
  43. Demir M, Kadakia N, Anderson HD, Clark DA, Emonet T. Walking Drosophila navigate complex plumes using stochastic decisions biased by the timing of odor encounters. eLife. 2020;9:e57524.
  44. Goldman OV, DeFoe AE, Qi Y, et al. A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult Aedes aegypti. mosquito. Cell. 2025;188(25):7267-7290.e26.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Zachowanie komarówobwody neuronalneaktywacja optogenetycznatesty behawioralneposzukiwanie żywicielażerowanie na krwiwizja komputerowabodźce sensoryczne

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.