Analiza biomarkerów pirostozy specyficznej dla wieku oraz interwencja niefarmakologiczna w ostrym zespole niedociągania oddechowego

Podsumowanie

Protokół ten określa zintegrowany workflow bioinformatyczny i uczenia maszynowego do identyfikacji biomarkerów pirostozy w fazie ostrego zespołu niedociągania oddechowego (ARDS), połączony z metodologią in vivo wykorzystującą model szczura indukowany LPS, aby eksperymentalnie potwierdzić wstępną skuteczność energii widma wody i promieniowania dalekiej podczerwieni.

Streszczenie

Zespół ostrego niedociągania oddechowego (ARDS) to zagrażające życiu zapalne zaburzenie płuc o wysokiej zachorowalności i śmiertelności, w którym piroptoza stała się kluczowym mechanizmem patogenicznym. Biorąc pod uwagę, że różnice immunologiczne i molekularne związane z wiekiem mogą wpływać na pirostozę i odpowiedź terapeutyczną, celem tego badania było zidentyfikowanie biomarkerów związanych z pirostozą specyficznymi dla wieku oraz ocena terapeutycznego potencjału wody energetycznej ze spektrum (SEW) w połączeniu z promieniowaniem dalekiej podczerwieni (FIR). Kompleksowy workflow protokołu obejmuje przetwarzanie danych transkryptomicznych, stratyfikację wiekową, uczenie maszynowe oraz analizę infiltracji immunologicznej w celu identyfikacji genetyki hubów specyficznych dla wieku. Po tej fazie obliczeniowej następuje eksperymentalna walidacja in vivo z wykorzystaniem modelu szczura indukowanego przez LPS, wykorzystującego ocenę histologiczną, ELISA oraz western blotting, aby rygorystycznie ocenić interwencję SEW+FIR i zweryfikować ekspresję genów w hubie. Zidentyfikowano szesnaście genów związanych z pirostozą, z których AXL i GSDME były głównie związane z nasileniem ARDS u starszych pacjentów, podczas gdy SPP1 był bardziej istotny u młodszych osób. Zaobserwowano wyraźne sygnatury immunologiczne, z wzbogaceniem makrofagów M2 i immunosupresją u starszych pacjentów, w przeciwieństwie do aktywacji prozapalnej u młodszych. Analizy funkcjonalne wskazywały na te geny w szlakach regulacyjnych metabolicznych, zapalnych i immunologicznych. In vivo leczenie SEW+FIR złagodziło uszkodzenia płuc, zahamowało produkcję cytokin zapalnych (IL-1β, IL-18, IL-6, TNF-α) oraz modulowało ekspresję AXL, GSDME i SPP1. Łącznie te wyniki podkreślają zależne od wieku różnice w mechanizmach związanych z pirostozą w ARDS i wskazują AXL, GSDME i SPP1 jako wstępne kandydaty na biomarkery, które wymagają dalszej walidacji klinicznej. W obecnym modelu eksperymentalnym na mysach SEW+FIR wykazał działanie ochronne poprzez łagodzenie stanów zapalnych ogólnoustrojowych oraz modulację sygnalizacji związanej z pirostozą, zapewniając podstawowe wsparcie in vivo dla potencjału jako niefarmakologicznej strategii uzupełniającej.

Wprowadzenie

Ostre uszkodzenie płuc (ALI)/ostry zespół niedorostu oddechowego (ARDS) to ciężka choroba układu oddechowego charakteryzująca się ostrym początkiem ciężkiej hipoksemii oraz niekardiogennym obrzękiem płuc, głównie wynikającym z rozlanego uszkodzenia pęcherzyka płucnego¹. Może być wywołana przez różne zaszkodzenia płucne i pozapłucne. Przyczyny płucne obejmują zapalenie płuc zakaźnych, zachłanianie zawartości żołądka oraz poważne urazy klatki piersiowej, natomiast czynniki pozaodpłucne wynikają z ogólnoustrojowych odpowiedzi zapalnych wtórnych do niepłucnych zaburzeń, takich jak sepsa, zapalenie trzustki, uraz nieklatkowy, poważne oparzenia, masowa transfuzja oraz uraz reperfuzji po przeszczepie płuc lub trombektomii ^1,2. Pomimo postępów w opiece wspomagającej, ARDS pozostaje poważnym wyzwaniem klinicznym w medycynie intensywnej terapii, z wysokimi wskaźnikami zachorowalności i śmiertelności^{na całym} świecie. Dlatego zrozumienie patogenezy ALI/ARDS jest kluczowe dla opracowania skutecznych metod leczenia.

Pirostoza, zapalna forma zaprogramowanej śmierci komórkowej, szeroko scharakteryzowana w kontekście supresji nowotworów i terapii onkologicznych⁴, jest obecnie uznawana za kluczowy element w patofizjologii ARDS⁵. W przeciwieństwie do apoptozy, piroptoza jest pośredniczona poprzez aktywację inflammasomu i późniejsze rozszczepienie gasderminy D (GSDMD), co prowadzi do powstawania porów błonowych, lizy komórek oraz uwalniania prozapalnych cytokin, takich jak interleukina-1β (IL-1β) i interleukina-18 (IL-18)⁶. W ARDS nadmierna aktywacja piroptozy w makrofagach pęcherzykowych, komórkach nabłonkowych i komórkach śródbłonka przyczynia się do przesadnej reakcji zapalnej, zakłócenia bariery włosowatej pęcherzyka włosowatego, obrzęku płuc oraz postępu hipoksemii⁷. Rosnące dowody sugerują, że celowanie w kluczowe regulatory szlaku piroptozy może stanowić nowatorską strategię łagodzenia stanu zapalnego i poprawy wyników klinicznych w ARDS ^8,9. Jednak pozostaje istotna luka w wiedzy dotycząca wpływu starzenia się — kluczowego czynnika determinującego podatność i rokowanie na ARDS — na krajobraz piroptotyczny. Obecne badania często traktują ARDS jako schorzenie monolityczne, pomijając potencjał specyficznych dla wieku czynników molekularnych, które mogłyby wyznaczać spersonalizowane reakcje terapeutyczne.

W ostatnich latach zastosowanie nowatorskich interwencji biofizycznych oraz zaawansowanych materiałów funkcjonalnych — takich jak emitery SEW i promieniowania dalekiej podczerwieni (FIR) — zyskało na popularności jako niefarmakologiczne strategie modulowania odpowiedzi immunologicznej i tłumienia stanu^{zapalnego 10,11}. Terapie te zgłoszono jako zwiększające proliferację leukocytów i aktywność fagocytów, zmniejszające obrzęk tkanek oraz łagodzące zaburzenia mikrokrążenia wywołane endotoksyną — w tym adhezję leukocytów, agregację erytrocytów, aktywację płytek krwi oraz uszkodzenia śródbłonka 12,13,14. U szczurów ARDS indukowanych lipopolisacharydami (LPS) połączone leczenie SEW i FIR znacząco obniżyło poziomy IL-1β i IL-18 — charakterystycznych efektorów kaskady piroptotycznej — zarówno w surowicy, jak i płynie płukającym oskrzelowo-pęcherzykowe (BALF). Dowody te zdecydowanie sugerują, że efekty ochronne SEW+FIR mogą być pośredniczone poprzez tłumienie śmierci komórkowej wywołanej inflammasomem. Ponadto SEV, stosowany niezależnie lub jako medium rozpuszczalnik, obniżał poziom ekspresji interleukiny-8 (IL-8) i czynnika martwiczego nowotworów-α (TNF-α), jednocześnie podnosząc poziomy ekspresji interleukiny-4 (IL-4) i interleukiny-10 (IL-10) w surowicy krwi oraz łagodząc histopatologiczne uszkodzenia płuc 15,16,17,18.

Bazując na tych obserwacjach, wysunęliśmy hipotezę, że skuteczność terapeutyczna połączonych SEW i FIR (SEW+FIR) w ARDS zależy od jego zdolności do modulowania specyficznych dla wieku szlaków piroptotycznych, co pozwala na celowane przywrócenie homeostazy immunologicznej płuc. Obecnie podstawą leczenia ARDS są mechaniczne wentylacje oraz ograniczone środki farmakologiczne, takie jak kortykosteroidy, które często niosą ryzyko uszkodzenia płuc wywołanego respiratorem lub ogólnoustrojowej immunosupresji¹⁹. W porównaniu z tymi konwencjonalnymi terapiami, SEW+FIR oferuje nieinwazyjną, niefarmakologiczną alternatywę, która może bezpiecznie łagodzić kaskady zapalne we wczesnym stadium bez toksyczności narządów wtórnych. W praktyce protokół ten jest najbardziej odpowiedni jako wczesna interwencja pomocnicza w przypadku łagodnego do umiarkowanego ARDS. Jego główną ograniczeniem jest to, że skuteczność w ciężkim, późnym stadium fibrotycznego ARDS pozostaje nieudowodniona i nie może zastąpić niezbędnych środków podtrzymujących życie w środowisku intensywnej terapii. Aby przetestować naszą hipotezę, opracowaliśmy zintegrowany pipeline, który łączy wiekowo zhierarchizowane profilowanie transkryptomiczne i uczenie maszynowe z walidacją vivo. To podejście nie tylko identyfikuje AXL, GSDME i SPP1 jako nowe, specyficzne dla wieku cele terapeutyczne, ale także dostarcza pierwszych mechanistycznych dowodów na kliniczny potencjał SEW+FIR jako precyzyjnej, niefarmakologicznej interwencji w ARDS.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach były ściśle przeprowadzane zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt Eksperymentalnych i Etyki Szpitala Dongzhimen Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie (Zatwierdzenie nr 19-54) przed rozpoczęciem badania.

Źródło danych i przetwarzanie danych
Dwa zestawy danych o ekspresji genów (GSE89953 i GSE116560) zostały pobrane z bazy danych Gene Expression Omnibus (GEO)²⁰. Zestaw danych GSE89953, obejmujący transkryptomię całopężowych makrofagów od pacjentów z ARDS w różnych grupach wiekowych, został wykorzystany do różnicowej ekspresji i analizy sieci. Zbiór danych GSE116560, który zawiera informacje kliniczne, takie jak status wentylacji mechanicznej, został wykorzystany do uczenia maszynowego i modelowania prognostycznego. Dodatkowo wyodrębniono 608 genów związanych z pirostozą z kompleksowej bazy danych adnotacji genów ludzkich, przy czym kryterium przesiewowym wykorzystywał wskaźnik korelacji wyższy niż 1. Dane ekspresji genów zostały znormalizowane za pomocą pakietu limma w R. Numer badania klinicznego: nieistotny.

Identyfikacja DEG
Pacjenci w zbiorze danych GSE89953 podzielono na dwie grupy wiekowe: osoby w wieku niskim (<45 lat) oraz osoby w wieku wysokim (≥45 lat). Ten próg został wybrany na podstawie dowodów epidemiologicznych sugerujących, że mediana wieku wystąpienia ARDS wynosi około 45 lat²¹. Aby zapewnić odporność tego progu, przeprowadzono analizy czułości z wykorzystaniem alternatywnych progów wieku (50 i 55 lat). Analizy te wykazały spójne wzorce identyfikacji genów hubów i klastrowania modułów, co statystycznie potwierdza 45-letni próg kolejnych analiz w dalszej fazie. Zbiór danych został znormalizowany za pomocą pakietu limma w R. Geny różnicowo ekspresyjne (DEG) między grupami wiekowymi zostały zidentyfikowane za pomocą modelowania liniowego z empiryczną moderacją Bayesa. Geny o skorygowanej wartości P < 0,05 i |log₂ zmiana składu| ≥ 0,5 uznano za statystycznie istotne DEG. Wykresy wulkanów i mapy ciepła były generowane do wizualizacji DEG za pomocą pakietu ggplot2 w języku R.

Identyfikacja genów związana z pirostozą i analiza wzbogacenia
Geny związane z pirostozą zostały pobrane z bazy danych adnotacji genów za pomocą słowa kluczowego "pirostoza". Przecięcie DEG i genów związanych z pirostozą zostało zdefiniowane jako geny związane z pirostozą o różnej ekspresji (DEPG). Analizy wzbogacania szlaków DEPG przeprowadzono w Ontologii Genów (GO) oraz Encyklopedii Genów i Genomów w Kioto (KEGG) przy użyciu pakietu clusterProfiler w R²². Kategorie Procesów Biologicznych (BP), Komponentu Komórkowego (CC) i Funkcji Molekularnej (MF) zostały oznaczone, a Z-score ≥ 1 i skorygowane wartości P < 0,05 uznano za istotne.

Analiza ważonej sieci współekspresji genów (WGCNA)
Aby zidentyfikować moduły genowe związane z pirostozą, WGCNA przeprowadzono przy użyciu pakietu WGCNA R. Sieć podpisana została zbudowana przy użyciu miękkiego progu mocy (β) wynoszącej 26, aby zapewnić topologię bezskalową²³. Moduły były identyfikowane za pomocą algorytmu dynamicznego cięcia drzewa o minimalnym rozmiarze modułu 30, głębokim podziale 2 oraz progu łączenia (wysokości cięcia) 0,25. Obliczono korelację między genami własnymi modułów a cechami pirostozy. Analiza zmienności zestawu genów (GSVA) została przeprowadzona na wybranych modułach z wykorzystaniem charakterystycznych zestawów genów pobranych z MsigDB^24,25.

Uczenie maszynowe
Zbiór danych GSE116560 podzielono na grupy wysokie i niskie wiekowe, z uwzględnieniem 45 lat jako granicy, a obie grupy analizowano za pomocą algorytmów uczenia maszynowego. Analiza regresji Least Absolute Shrinkage and Selection Operator (LASSO) została zaimplementowana przy użyciu pakietu glmnet (wersje 4.1-2) w języku R, z optimalnym parametrem kary (λ) określonym przez 10-krotną walidację krzyżową (kryteria 1-SE). Dla algorytmu Losowego Lasu (RF) skonstruowano 500 drzew (ntree = 500), a liczba cech próbkowanych przy każdym podziale (mtry) została ustawiona na pierwiastek kwadratowy z całkowitej liczby predyktorów, aby zapewnić stabilność modelu. Nakładające się geny z obu metod zostały zdefiniowane jako geny sygnaturowe specyficzne dla wieku.

Budowa i ocena modeli diagnostycznych
Na podstawie zidentyfikowanych genów sygnaturowych skonstruowano model diagnostyczny predykcyjny. Do opracowania modelu zastosowano regresję logistyczną, a do wizualizacji jego zdolności predykcyjnej stworzono nomogram. Wydajność modelu oceniono za pomocą krzywej charakterystyki pracy odbiornika (ROC), a obszar pod krzywą (AUC) obliczono w celu oceny dokładności diagnostycznej. Wewnętrzna walidacja była przeprowadzana poprzez ponowne próbkowanie bootstrap. Dalsza ocena stabilności modelu i użyteczności klinicznej została przeprowadzona za pomocą wykresów kalibracyjnych oraz analizy krzywej decyzyjnej (DCA).

Analiza infiltracji immunologicznej
Skład komórek odpornościowych w grupach wysokiego i niskiego wieku oszacowano za pomocą algorytmu CIBERSORT na podstawie macierzy sygnatur LM22. Porównano względne proporcje 22 typów komórek odpornościowych pomiędzy grupami. Różnica ekspresji genów hubowych w podzbiorach komórek odpornościowych została przeanalizowana na podstawie danych z pojedynczych próbek i zobrazowana na mapach cieplnych oraz histogramach.

Analiza wzbogacania zbiorów genów (GSEA)
GSEA przeprowadzono oddzielnie na genach hubowych z grup wysokich i niskich wiekowych. Analiza wzbogacania zestawów genów (GSEA) została przeprowadzona z wykorzystaniem zestawów genów Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Geny były klasyfikowane na podstawie stosunku sygnału do szumu (lub zmiany fałdów) między grupami o wysokiej i niskiej ekspresji. Następnie obliczono wyniki wzbogacenia i normalizacji wzbogacenia (NES) przy użyciu 1 000 permutacji, aby zidentyfikować istotnie wzbogacone szlaki. Szlaki z fałszywym wskaźnikiem wykrywania (FDR) poniżej 0,25 i nominalną wartością P poniżej 0,05 były istotnie wzbogacone. Analiza ta posłużyła następnie do wnioskowania o szlakach biologicznych, które mogą być regulowane przez każdy gen hub.

Zwierzęta doświadczalne
W badaniu wykorzystano osiemnaście samców szczurów Sprague Dawley z SPF (w wieku od 6 do 7 tygodni, 180 g ± 10 g). Szczegółowe informacje o dostawcach znajdują się w Tabeli Materiałów.

Odczynniki i instrumenty
Do eksperymentalnych interwencji wykorzystywano urządzenia do przygotowywania wody uzdatnianej polem elektromagnetycznym oraz instrumenty emisji dalekiej podczerwieni, aby zapewnić odpowiednio promieniowanie energii widmowej (SEW) i promieniowania dalekiej podczerwieni (FIR). Do modelowania ARDS użyto lipopolisacharydu (LPS). Poziomy cytokinów (IL-1β, IL-18, IL-6, TNF-α) zostały zmierzone za pomocą konkretnych zestawów ELISA. Poziomy ekspresji białek (AXL, SPP1, Caspase-3, GSDME, GAPDH) oceniano przy użyciu specyficznych przeciwciał pierwotnych oraz odpowiadających im przeciwciał wtórnych sprzężonych z HRP. Przetwarzanie i analizę próbek wykonywano przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego, w tym biomikroskopu, mikrotomu, wirówki o wysokiej prędkości, zamrażarki ultra-niskiej temperatury oraz czytnika mikropłyt. Pełne informacje o wszystkich odczynnikach, przeciwciałach i instrumentach, wraz z ich odpowiednimi producentami, znajdują się w Tabeli Materiałów.

Grupowanie zwierząt i modelowanie
Osiemnaście szczurów Sprague-Dawley zostało losowo przydzielonych do grup Control, Model i SEW+FIR, po sześć szczurów w każdej grupie. Każda grupa była ważona i dokumentowana codziennie. Grupa SEW+FIR otrzymywała terapię FIR (długość fali 4 μm–14 μm, odległość napromieniowania 20 cm od powierzchni grzbietowej) przez 20 minut dziennie w warunkach kontrolowanych temperaturą (22 °C ± 2 °C), jednocześnie otrzymując SEW w dawce 1 mL/100 g/d doustnie⁷. Woda destylowana była podawana doustnie grupom kontrolnym i modelowym w równoważnej dawce 1 mL/100 g/d. Woda SEW i destylowana podawano raz dziennie przez 7 dni po podgrzewaniu w ciepłej kąpieli 60 °C. Siódmego dnia, 6 godzin po karmieniu, grupy Model i SEW+FIR zostały wstrzyknięte roztworem LPS w dawce 2 mg/kg masowo przez żyłę ogonową, natomiast grupa kontrolna była traktowana 0,9% soli fizjologicznej w dawce 2 mg/kg masowo. Technika modelowania była uznawana za dojrzałą i stabilną metodę wywołania ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej przy użyciu pojedynczego zastrzyku LPS przez żyłę ogonową. Tkanka płucna z patologii płuc w modelowanych grupach była zgodna z charakterystyką ARDS²⁵. Punkt kontrolny: Pomyślne wywołanie ARDS oznacza widoczna ospałość, tachypnea oraz ~10% spadek masy ciała w ciągu 16 godzin od podania wstrzyknięcia²⁶.

Zbiór wskaźników związanych ze szczurami
Szesnaście godzin później wszystkie trzy grupy zostały podane dootrzewnowo 3% pentobarbitalu sodu w dawce 30 mg/kg masy ciała w celu wywołania znieczulenia. KRYTYCZNE: Głębokość znieczulenia musi być ściśle potwierdzona przez utratę odruchu cofania pedału przed jakąkolwiek interwencją proceduralną. Ponadto utrzymywano rygorystyczne protokoły bezpieczeństwa biologicznego; wszystkie materiały skażone LPS, płyny biologiczne oraz zwłoki zwierząt zostały utylizowane w wyznaczonych pojemnikach na odpady biologiczne do odpowiedniej spaliarni. Z aorty brzusznej pobrano pięć mililitrów krwi do jałowych rurek, a surowica została wyizolowana przez wirowanie w dawce 1000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Następnie surowica była przechowywana w temperaturze −80 °C do dalszej analizy. Po torakotomii i podwiązaniu prawego płucnego hilum uzyskano płyn płucno-pęcherzykowy (BALF) poprzez trzykrotne przepłukanie lewego płuca schłodzoną fosforanową solą fizjologiczną (PBS) za pomocą kaniuli endotchawicznej. BALF był następnie wirowany w 1000 x g przez 10 minut w 4 °C, a supernatant przechowywano w −80 °C. Górny płat prawego płuca został usunięty i oczyszczony zimną solą fizjologiczną, aby usunąć krew. Dodano dziewięć woluminów soli fizjologicznej względem masy tkanki, a próbkę mielono w kąpieli lodowej nożyczkami okulistycznymi. Przygotowano homogenizację tkanki płucnej o stężeniu 10% przy użyciu homogenizatora, po czym nastąpiła wirówka w 700 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant był zbierany i przechowywany w temperaturze −80 °C do dalszej analizy biochemicznej. Dodatkowo, część prawej tkanki płucnej każdego szczura została utrwalona w 4% paraformaldehydu do badania histologicznego.

Wskaźniki obserwacji i metody detekcji
Dolny płat prawego płuca był przetwarzany przy użyciu standardowego osadzania, cięcia tkanek, odwoskowania, barwienia HE, separacji koloru, odwodnienia oraz uszczelniania filmu po utrwaleniu w 4% paraformaldehydzie. Tkanki płucne każdej grupy wykazywały patologiczne zmiany obserwowane pod mikroskopem świetlnym.

Pod mikroskopem świetlnym zidentyfikowano patologiczne nieprawidłowości w układzie pęcherzyka i przegrodzie płucnej, stopień infiltracji komórek zapalnych, hiperemię oraz obrzęk naczyń włosowatych płuc. Katedra Patologii na Uniwersytecie Medycyny Chińskiej w Pekinie pomagała w obserwacji. Ocena urazu płuc histologicznego została obliczona w celu oceny urazu płuc w następujący sposób: brak urazu = 0, uraz w mniej niż 25% pola = 1, uraz w 25–50% pola = 2, uraz w 50–75% pola = 3, oraz uraz w ponad 75% pola = 4. Dziesięć pól zostało losowo wybranych i ocenionych przez badaczy nieświadomych grupowania.

ELISA przeprowadzono na wcześniej zebranych próbkach supernatantu BALF, homogenacie tkanki płucnej oraz surowicy krwi zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko próbki inkubowano w studniach powlekanych w temperaturze 37 °C przez 90 minut. Po pięciokrotnym myciu buforem do płukania zastosowano biotynowo zastosowany przeciwciała wykrywające (rozcieńczenie 1:100) przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Po kolejnym etapie płukania dodano HRP-konjugat i inkubowano w ciemności przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie zmierzono absorpcję na 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek do obliczania stężeń próbek.

Przeprowadzono analizę western blot w celu oceny poziomu ekspresji AXL, SPP1, kaspazy-1, GSDMD, kaspazy-3, GSDME i GAPDH w tkance płucnej oraz próbkach BALF przechowywanych w temperaturze −80°C. Białka zostały pobrane i zlizowane zgodnie z instrukcjami zawartymi w Zestawie Ekstrakcji Białkowej. Równe ilości ekstraktów białkowych (40 μg) były ładowane na każdą ścieżkę i rozdzielane przez SDS-PAGE. Polipeptydy były następnie rozdzielane i przenoszone na membrany PVDF. Błony zostały zablokowane 5% suchym mlekiem bez tłuszczu w TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z użyciem specyficznych przeciwciał pierwotnych (rozcieńczonych w 1:1000). Po trzykrotnym myciu TBST przez 10 minut każdy, błony były inkubowane odpowiadającymi przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP (rozcieńczone 1:5000) w roztworze blokującym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. GAPDH był używany jako wewnętrzne białko referencyjne. Pasma białkowe były wizualizowane za pomocą zestawu do rozszerzonej chemiluminescencji (ECL) z czasem naświetlania 1–5 minut, a wyniki analizowano za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów. Względne poziomy ekspresji docelowych białek obliczono jako stosunek białka docelowego do GAPDH.

Analiza statystyczna
Indeksy ilościowe wyrażano jako średnią ± odchylenie standardowe, a analizę statystyczną przeprowadzano za pomocą oprogramowania statystycznego. Test Kruskala–Wallisa lub jednokierunkowa ANOVA był używany do porównania różnic między kilkoma grupami, w zależności od tego, czy dane były normalnie rozłożone. Wszystkie statystyki oceniano za pomocą testu hipotez dwustronnych. W analizach obejmujących wiele porównań, takich jak różnica ekspresji genów i profilowanie infiltracji komórek odpornościowych, wartości P były dostosowane metodą fałszywego wykrywania (FDR) Benjamini-Hochberga. Skorygowana wartość P na poziomie 0,05 lub niższa została uznana za statystycznie istotną. Do tworzenia wykresów używano oprogramowania do wykresów.

Wyniki

Identyfikacja DEG w GSE89953 różnych grupach wiekowych oraz odpowiadająca im analiza wzbogacenia funkcjonalnego
Surowe dane ekspresji z zestawu danych GSE89953 zostały znormalizowane za pomocą funkcji normalizeBetweenArrays w pakiecie limma (rysunek 1A), a wykresy pudełkowe przed i po normalizacji potwierdziły poprawę spójności w różnych próbkach. Analiza różnicowej ekspresji oparta na znormalizowanej macierzy zidentyfikowała 228 DEG (skorygowane p < 0,05 za po...

Dyskusja

Nagromadzenie urazów zapalnych i zaburzeń odporności jest cechą charakterystyczną ostrego zespołu niedorostu oddechowego (ARDS), prowadzącą do poważnych uszkodzeń płuc i wysokiej śmiertelności. Ze względu na złożoną patogenezę i brak skutecznych terapii, precyzyjne określenie celów terapeutycznych jest kluczowe dla poprawy efektów. Pojawiające się dowody sugerują, że pirostoza, forma zaprogramowanej śmierci komórki, odgrywa kluczową rolę w progresji ARDS. Biorąc pod uwagę, że wiek jest ważnym czynnikiem wpływającym na po...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało anty-AXL	Abcam	ab215205
Przeciwciało przeciwkaspaza-3	Abcam	ab184787
Przeciwciało anty-GAPDH	Abcam	ab8245
Przeciwciało anty-GSDME	Abcam	ab215191
Przeciwciało przeciw SPP1	Abcam	ab307994
Biomikroskop	OLIMP, Japonia	BH2
Instrument FIR	Grupa JFC Guangdong	JF-802
IgG H& Kozy przeciwkrólikowe L (HRP)	Abcam	ab6721
GraphPad Prism 10.1.2	Oprogramowanie GraphPad	-
Wirówka o dużych prędkościach	Thermo, USA	Sorvall ST16R
Zestaw IL-18 ELISA	Jiangsu Meibiao Biotechnology Co., Ltd.	MB-1735B
IL-1β Zestaw ELISA	Jiangsu Meibiao Biotechnology Co., Ltd.	MB-1588B
Zestaw IL-6 ELISA	Jiangsu Meibiao Biotechnology Co., Ltd.	MB-50054A
ImageJ	NIH	-
Lipopolisacharyd (LPS)	Sigma, USA	L6511
Samce szczurów Sprague Dawley z SPF (6-7 tygodni)	Beijing HFK Bioscience Co., Ltd., Chiny	SCXK (Pekin)2019-008 (licencja)
Czytnik mikropłyt (Varioskan Flash)	Thermo Scientific	Błysk Varioskan
Mikrotom	LEICA	RM2235
Oprogramowanie R (limma, clusterProfiler, WGCNA, glmnet, randomForest)	R Foundation for Statistical Computing	-
Narzędzie do przygotowań do szycia	Grupa JFC Guangdong	JF-139
SPSS 26.0	IBM	-
Równowaga tabeli	Shanghai Cany Precision Instruments Co., Ltd.	HC· TP11· 10
TNF-α Zestaw ELISA	Jiangsu Meibiao Biotechnology Co., Ltd.	MB-50051A
Zamrażarka ultra-niskiej temperatury	Thermo, USA	Seria Forma 900