Ten protokół ma na celu zbadanie mechanizmu, poprzez który QUF3 poprawia receptywność endometrium w PCOS za pomocą farmakologii sieciowej, dokowania i symulacji MD.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
* These authors contributed equally
Ten protokół ma na celu zbadanie mechanizmu, poprzez który QUF3 poprawia receptywność endometrium w PCOS za pomocą farmakologii sieciowej, dokowania i symulacji MD.
Upośledzona receptywność endometrium jest główną przyczyną niepłodności w zespole policystycznych jajników (PCOS). Formuła 3 Qu (QUF3) to chińska formuła leków ziołowych, klinicznie stosowana w celu poprawy receptywności endometrium u pacjentów z PCOS. W niniejszym badaniu zastosowano farmakologię sieciową, dokowanie molekularne oraz symulacje dynamiki molekularnej (MD), aby zbadać podstawowe mechanizmy. Aktywne składniki QUF3 zidentyfikowano za pomocą bazy danych TCMSP, a potencjalne cele związane z receptywnością endometrium i PCOS uzyskane zostały z DrugBanku oraz innych źródeł. Sieć interakcji związek-cel oraz sieć interakcji białko-białko (PPI) zostały stworzone za pomocą Cytoscape, aby zidentyfikować kluczowe cele. Kluczowe cele poddano analizie wzbogacenia GO i KEGG. Do oceny interakcji wiązania zastosowano dokowanie molekularne, symulacje MD, analizę głównych składowych (PCA), krajobraz energii swobodnej (FEL) oraz macierz skorelowania przepływów dynamicznych (DCCM). Z 91 aktywnych składników i 294 potencjalnych docelowych leków zidentyfikowano 60 dotyczących choroby. Luteolina i sezamyna były wśród kluczowych składników farmakodynamicznych. Zidentyfikowano dziesięć głównych celów: AKT1, EGFR, TNF, TP53, IL6, BCL2, ESR1, IL1B, STAT3 i MMP9. Analiza wzbogacenia KEGG wykazała 132 ścieżki sygnałowe, a analiza GO zidentyfikowała 678 wpisów. Symulacje MD wskazały, że powiązanie między pięcioma najaktywniejszymi składnikami a ich odpowiednimi celami było stabilne. PCA, FEL i DCCM dodatkowo wykazały wysoką stabilność termodynamiczną oraz sztywność strukturalną tych kompleksów. Podsumowując, QUF3 poprawia receptywność endometrium w PCOS poprzez wieloskładnikowe, wielocele i wieloscieżkowe interakcje. Niniejsze badanie dostarcza podstawy teoretycznej, z perspektywy symulacji komputerowych, dla rozwoju ukierunkowanych terapii ziołowymi lekami chińskimi w leczeniu niepłodności związanej z PCOS oraz może mieć pozytywne implikacje dla poprawy wyników ciąży u kobiet z PCOS w przyszłości.
Zespół policystycznych jajników (PCOS) jest jednym z najczęstszych zaburzeń endokrynologicznych u kobiet1. Jego głównymi cechami są przewlekłe uporczywe zaburzenia owulacji, nadmierny poziom androgenów w znaczeniu klinicznym lub biochemicznym oraz politorski wzrost jajników, a objawy kliniczne obejmują brak miesiączki, niepłodność, hirsutyzm, trądzik i otyłość. W ostatnich latach postępy w indukcji owulacji i technologii wspomaganego rozrodu (ART) znacząco poprawiły wskaźniki ciąży u pacjentek z PCOS; jednakże wyniki ciąży są gorsze niż u zdrowych kobiet2,3. Odczynność endometrium jest kluczowym czynnikiem wpływającym na wyniki ART4. Odczynność endometrium odnosi się do zdolności endometrium do przyjęcia zarodka na określonym etapie fizjologicznym, co odgrywa decydującą rolę w implantacji zarodka i późniejszym rozwoju5,6. Patologiczne stany często obserwowane w PCOS, takie jak otyłość, oporność na insulinę i przewlekła reakcja zapalna, mogą osłabiać odczynność endometrium, utrudniać implantację zapłodnionego jaja i rozwój zarodka, a ostatecznie prowadzić do niepłodności i poronień7,8. Niemniej mechanizmy regulacyjne leżące u podstaw odczynności endometrium w PCOS pozostają w dużej mierze niejasne, a sieć interakcji między różnymi czynnikami wpływającymi na nią nie została jeszcze wyjaśniona. Formula 3 Qu'a (QUF3), chińska formuła ziołowa stosowana klinicznie w celu poprawy odczynności endometrium u pacjentek z PCOS, jest wspierana przez solidne klasyczne teorie medycyny tradycyjnej (TCM) w dziedzinie ginekologii. Formuła składa się z Paeoniae Radix Alba (Baishao), Rehmanniae Radix Praeparata (Shudihuang), Cuscutae Semen (Tusizi), Fructus Ligustri Lucidi (Nvzhenzi), Herba Taxilli (Sangjisheng), Radix Salviae (Danshen) oraz Cornus Officinalis Sieb. et Zucc. (Shanzhuyu) w proporcji 2:4:3:4:3:2:2, przygotowana przez ekstrakcję refluksową z alkoholem etylowym. QUF3 wywiera synergistyczne działanie wielu ziół, wzmacnia nerki, wzbogaca esencję, odżywia krew i poprawia krążenie krwi9. Jego skuteczność kliniczną w poprawie odczynności endometrium u pacjentek z PCOS potwierdzono, ale jego podstawowe mechanizmy farmakologiczne wymagają dalszych badań.
Farmakologia sieciowa to analityczna metoda oparta na biologii systemowej, która konstruuje wielopoziomowe sieci „zioło-składnik-cel-choroba” w celu ujawnienia, z perspektywy holizmu, efektów interwencyjnych leków na sieci chorobowe. W przeciwieństwie do tradycyjnego modelu „jeden lek-jeden cel”, farmakologia sieciowa może kompleksowo uchwycić synergistyczne cechy „wieloskładnikowych, wielocelowych i wieloszlakowcowych” działań formuł TCM, co sprawia, że jest szczególnie odpowiednia do badania złożonych mechanizmów TCM. Symulacja dynamiki molekularnej (MD), natomiast, to technika obliczeniowa oparta na mechanice Newtona, która symuluje na poziomie atomowym zmiany konformacyjne i dynamiczne zachowanie kompleksów białko-ligand w czasie. W porównaniu z statycznym dokowaniem molekularnym, symulacja MD może oceniać parametry dynamiczne, takie jak stabilność wiązania, krajobrazy energii wolnej i sztywność strukturalną, zapewniając tym samym bardziej realistyczną ocenę interakcji między cząsteczkami leków a białkami docelowymi. Farmakologia sieciowa nadaje się do globalnego przesiewania potencjalnych celów i ścieżek formuł TCM, podczas gdy symulacja MD może dynamicznie ocenić stabilność wiązania między kluczowymi składnikami a białkami docelowymi. Połączenie tych dwóch podejść umożliwia bardziej wiarygodną analizę wieloskładnikowych, wielocelowych mechanizmów synergistycznych formuł TCM. Na podstawie tej zasady niniejsze badanie zastosowało połączone podejście farmakologii sieciowej i symulacji MD w celu systematycznego zbadania potencjalnych mechanizmów farmakologicznych lepszego działania QUF3 na odczynność endometrium u pacjentek z PCOS.
To połączone obliczeniowe przepływy pracy są najbardziej odpowiednie do wstępnego badania mechanizmów wieloskładnikowych, wielocelowych ziołowych formuł chińskich lub produktów naturalnych, szczególnie dla złożonych systemów, w których składniki aktywne i cele są w dużej mierze nieznane. Użytkownicy powinni posiadać podstawową wiedzę z zakresu bioinformatyki, w tym wyszukiwanie w bazach danych i analiza sieci, a także umiejętności wykonywania podstawowych analiz biologii obliczeniowej, takich jak dokowanie molekularne i symulacje dynamiki molekularnej, przy użyciu wspólnych pakietów oprogramowania. Zalecane jest środowisko komputerowe oparte na Linuxie z co najmniej 16 GB pamięci RAM, wraz z dostępem do odpowiednich publicznych baz danych, takich jak Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP), PubChem i UniProt. Wszystkie oprogramowanie użyte w tym przepływie (np. Cytoscape, AutoDockTools, GROMACS) jest źródłowe lub darmowe do użytku akademickiego, a czytelnicy mogą uzyskać je z informacji podanych w Tabeli Materiałów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wykrywanie aktywnych składników i potencjalnych celów QUF3
Aktywne składniki chemiczne Baishao, Shudihuang, Tusizi, Nvzhenzi, Sangjisheng, Danshen i Shanzhuyu w leku QUF3 zostały zidentyfikowane za pomocą TCMSP 1 kwietnia 2025 roku10. Aktywne składniki zostały wstępnie przesiąknięte na podstawie warunków biodostępności doustnej (OB) ≥30% i podobieństwa do leku (DL) ≥ 0,1811. Te progi zostały wybrane jako standardowe empiryczne kryteria, aby zapewnić wystarczające wchłanianie i właściwości podobne do leku. Kanoniczny ciąg SMILES każdego związku został wyszukany w bazie danych PubChem, a wynikający ciąg został użyty do przewidywania docelowych związków w bazie danych Swiss Target Prediction online, po czym zebrano nazwy genów białek docelowych i identyfikatory UniProt z bazy danych UniProt12,13,14. Jako pośredni punkt kontrolny, zanotowano liczbę unikalnych docelów uzyskanych po usunięciu duplikatów.
Identyfikacja celów działania na rzekomą receptywność endometrium w PCOS
Słowa kluczowe „zespół wielotorbielowych jajników” i „receptywność endometrium” zostały użyte jako wyszukiwania w Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), DrugBank, Therapeutic Target Database (TTD) i GeneCards, aby zidentyfikować potencjalne cele15,16,17,18. W przypadku GeneCards, zachowano tylko cele o wynikowym wynikiem >5; w pozostałych bazach danych zachowano wszystkie odnalezione cele. Po połączeniu i usunięciu duplikatów, jako pośredni wynik zanotowano liczbę unikalnych docelów związanych z chorobą.
Budowa sieci składników i celów
Celę przecięcia wygenerowano poprzez wpisanie możliwych docelów dla QUF3, PCOS i rzekomej receptywności endometrium do internetowego narzędzia Venn diagram. Te cele przecięcia zostały uznane za kluczowe cele, przez które QUF3 wywiera swoje działanie poprawiające rzekomą receptywność endometrium w PCOS. Następnie stworzono sieć „zioło-składnik-cel” (H-C-T) przez dopasowanie tych docelów przecięcia z danymi składników-docelów QUF3 za pomocą Cytoscape19. Sieć została zwizualizowana za pomocą narzędzia „Network Analyzer”.
Budowa sieci interakcji białko-białko (PPI)
Potencjalne geny docelowe QUF3 poprawiające rzekomą receptywność endometrium w PCOS zostały przesłane jako wejście do platformy danych STRING20. Gatunek został ustawiony na „Homo sapiens”, a próg pewności został ustawiony na „średnie (0,4)”, co dało plik TSV danych interakcji białko-białko. Plik ten został następnie zaimportowany do oprogramowania do analizy sieci w celu zbudowania i analizy sieci PPI21. Ważność węzłów w sieci jest wskazana przez wartość „Degree”: wyższa wartość Degree wskazuje na bardziej znaczący węzeł. Następnie główne aktywne składniki zostały posortowanie według Degree, a top 10 głównych docelów zostało wybranych na podstawie rankingu Degree.
Analiza ontologii genów (GO) i ścieżek bogacenia w encyklopedii genów i genomów Kyoto (KEGG)
Analizy bogacenia ścieżek GO i KEGG zostały przeprowadzone za pomocą bazy danych DAVID w celu zbadania ścieżek biologicznych i mechanizmów, za pomocą których QUF3 poprawia rzekomą receptywność endometrium w PCOS22. Gatunek został ustawiony na „Homo sapiens”, a próg znaczącości został ustawiony na P < 0,05. Analiza GO obejmowała proces biologiczny (BP), komponent komórkowy (CC) i funkcję molekularną (MF)23. Wyniki zostały posortowane według liczby wzbogaconych docelów. Następnie wykluczono ścieżki związane z ludzkim metabolizmem i chorobami, a wybrano top 20 ścieżek KEGG do wizualizacji. Następnie stworzono multidimensionalną sieć „składnik-choroba-ścieżka KEGG” za pomocą oprogramowania do analizy sieci.
Analiza dokowania molekularnego
Top 10 kluczowych aktywnych składników i top 10 głównych docelów zostało wybranych do analizy dokowania molekularnego za pomocą oprogramowania AutoDockTools i PyMOL24,25. Pliki PDB kluczowych docelów zostały pobrane z bazy danych struktur białek26, a pliki SDF głównych aktywnych składników zostały uzyskane z bazy danych chemikaliów27. Cząsteczki białek zostały następnie przetworzone za pomocą oprogramowania do dokowania molekularnego, co obejmowało odsolowanie, hydratację i obliczenie ładunku. Dokowanie pół-elastyczne zostało przeprowadzone za pomocą skrzynki siatkowej pokrywającej całe miejsce wiązania białka. Proces dokowania został uznany za udany, gdy energia wiązania była ujemna, a odchylenie średniokwadratowe (RMSD) górnej pozycji wynosiło ≤ 2,0 Å. Po dokowaniu, wyniki dla głównych aktywnych składników QUF3 z głównymi celami zostały zwizualizowane za pomocą oprogramowania do wizualizacji molekularnej.
Symulacje dynamiki molekularnej (MD)
Symula
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wykrywanie aktywnych składników i potencjalnych docelów QUF3
Zastosowując kryteria przesiewne OB ≤ 30% i DL ≥ 0,18, po przeszukaniu bazy TCMSP, QUF3 zidentyfikowało 126 składników chemicznych. Wśród nich, Paeoniae Radix Alba (Baishao) zawierała 13 aktywnych składników, Rehmanniae Radix Praeparata (Shudihuang) zawierała 2, Cuscutae Semen (Tusizi) zawierała 13, Fructus Ligustri Lucidi (Nvzhenzi) zawierała 13, Herba Taxilli (Sangjisheng) zawierała 2, Radix Salviae (Danshen) zawierała 65, Cornus Offici...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Istnieje coraz więcej dowodów na to, że endometrium pacjentek z PCOS wykazuje upośledzoną funkcję, co może korelować z wyższymi wskaźnikami niepowodzenia implantacji i niekorzystnymi wynikami ciąży40. Różnice endometrium u kobiet z PCOS charakteryzują się głównie zmniejszoną ekspresją pinopodes, układów kanalików nukleolarnych, receptorów estrogenu i receptorów progesteronu w oknie implantacji (WOI)41. Ponadto zmniejszona jest ekspresja markerów endometrium takich jak homeo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W przypadku przesłania niniejszego rękopisu nie występuje żaden konflikt interesów, a rękopis został zatwierdzony przez wszystkich autorów do publikacji.
Autorzy deklarują, że nie ma dodatkowych potwierdzeń do zgłoszenia w odniesieniu do niniejszego badania.
FINANSOWANIE: Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (nr. LZ26H270001 dla F.Q.); National Natural Science Foundation of China (nr. 82575119 dla F.Q.); Projekt Szkolenia Wysokiego Poziomu Talentów w dziedzinie zdrowia, Komisja Zdrowia Prowincji Zhejiang, Chiny (grant nr [2021] 40 dla F.Q.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (Version 2.3) | Lab of Systems Pharmacology | https://www.tcmsp-e.com/load_intro.php?id=43 | Baza danych do przesiewowego testowania składników aktywnych |
| Swiss Target Prediction online database (2019 version) | Molecular Modelling Group, University of Lausanne & SIB Swiss Institute of Bioinformatics | http://www.swisstargetprediction.ch/ | Baza danych do przewidywania online |
| PubChem database | National Library of Medicine, NIH | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ | Baza chemiczna do pobierania SMILES/SDF związków |
| UniProt database | NIH | https://www.uniprot.org/uniprotkb | Baza danych białek dla UniProt ID i nazw genów |
| Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) | Johns Hopkins University | https://www.omim.org/ | Baza danych dotyczących dolegliwości |
| DrugBank | University of Alberta | https://www.drugbank.ca/ | Baza danych dotyczących dolegliwości |
| Therapeutic Target Database (TTD) | Zhejiang University | https://ttd.idrblab.cn/ | Baza danych dotyczących dolegliwości |
| GeneCards (Version 5.26) | Weizmann Institute of Science, LifeMap Sciences | https://www.genecards.org/ | Baza danych dotyczących dolegliwości (wysoki wskaźnik istotności >5) |
| Venny visualization platform (Version 2.1.0) | Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC) | https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ | Narzędzie online do tworzenia diagramu Venna dla wizualnej analizy przecięcia |
| Cytoscape (Version 3.10.3) | National Resource for Network Biology, NHGRI | https://cytoscape.org/ | Oprogramowanie do analizy i wizualnej reprezentacji sieci H-C-T, PPI i ścieżek |
| STRING database (Version 12.0) | STRING Consortium | https://string-db.org/ | Baza danych oddziaływań białko-białko do budowy sieci PPI |
| DAVID database (Version v2025-2) | U.S. Department of Health & Human Services, NIH | https://davidbioinformatics.nih.gov/ | Baza danych do analizy wzbogacania genów dla GO i KEGG |
| AutoDockTools (Version 1.5.7) | The Scripps Research Institute | https://autodock.scripps.edu/ | Oprogramowanie do dokowania molekularnego do przetwarzania i obliczeń |
| PyMOL software (Version 3.0.3) | Schrödinger | https://pymol.org/ | Oprogramowanie do wizualizacji molekularnej do wizualizacji dokowania |
| Protein Data Bank (PDB) | RCSB | https://www.rcsb.org/ | Baza danych struktur białkowych do pobierania plików PDB |
| GROMACS (Version 2023.2) | GROMACS development team | https://www.gromacs.org/ | Oprogramowanie do symulacji dynamiki molekularnej |
| VMD (Version 1.9.3) | University of Illinois | https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/ | Oprogramowanie do wizualizacji molekularnej i analizy trajektorii |
| gmx_MMPBSA | Open-source (GitHub) | https://github.com/Valdes-Tresanco-MS/gmx_MMPBSA | Narzędzie do obliczania wolnej energii wiązania z trajektorii MD |
| Science Data Bank | Chinese Academy of Sciences, Computer Network Information Center | https://www.scidb.cn/ | Repozytorium danych naukowych dostępu do danych i ich przechowywania |