Test jednostek formujących kolonie przystosowany dla pochodzących od pacjenta komórek rdzenia kostnego i obwodowej krwi jednojądrzastej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę indukowania różnicowania ludzkich komórek macierzystych i prądkotworzycznych krwiotwórczych pochodzących z szpiku kostnego pacjenta i komórek jednojądrzasty składnik krwi obwodowej. Test wykorzystuje półsztywne medium kulturowe wspierające zobowiązanie do linii erytrocytarnej i mieloidalnej oraz zawiera standaryzowane metryki umożliwiające reprodukowalną klasyfikację kolonii w celu charakteryzacji przedklinicznego leku.

Streszczenie

Ocena jednostek tworzących kolonie (CFU) jest techniką podstawową do badania chorób hematologicznych, w tym zespołów mielodysplastycznych (MDS) i ostrej białaczki szpikowej (AML). Ta ocena wykorzystuje półsztywne podłoża uzupełnione o określone kombinacje cytokin w celu wsparcia trójwymiarowego wzrostu i różnicowania komórek prątkowo-progenitorowych krwiotwórczych i mieloidalnych. Jednak próbki krwi obwodowej i szpiku kostnego pobrane od pacjentów stanowią wyzwanie techniczne ze względu na obniżoną żywotność, zwiększoną wrażliwość na manipulacje oraz różnorodność wzrostu kolonii. Ponadto istniejące wytyczne dotyczące identyfikacji i liczenia kolonii wykazują znaczną różnorodność w definiowaniu wielkości kolonii i typów linii, co ogranicza powtarzalność między badaniami. Protokół opisany niżej jest zoptymalizowany pod kątem wzrostu i różnicowania komórek macierzystych i progenitorowych krwiotwórczych izolowanych od pacjentów z MDS i AML. Protokół podkreśla delikatne manipulowanie komórkami, sterylne przetwarzanie próbek pacjentów, zoptymalizowane warunki hodowli oraz okresy wzrostu dostosowane do komórek pochodzących od pacjentów. Ten protokół zapewnia praktyczną ramę dla testów CFU wykorzystujących próbki pobrane od pacjentów i ustanawia standardową metrykę dla spójnego liczenia i analizy kolonii w badaniach nad złośliwymi chorobami krwi.

Wprowadzenie

Krątkoczenie jest ściśle regulowanym procesem, w którym komórki macierzyste krwiotwórcze (HSC) znajdujące się w niszach rdzenia kręgowego dają początek wszystkim dojrzałym liniom komórek krwi. Poprzez hierarchiczną serię zdarzeń różnicowania, HSC wytwarzają wielopotatne prądniki, które stopniowo angażują się w linie erytrocytów, mieloidalne i limfoidalne przed końcowym dojrzewaniem do funkcjonalnych krążących komórek krwi. Ten proces jest rządzony przez skoordynowane sygnalizację w środowisku rdzenia kręgowego i przez wewnętrzne mechanizmy regulacji transkrypcyjnych i epigenetycznych. Zakłócenia tych ścieżek regulacyjnych, szczególnie poprzez akumulację mutacji genetycznych lub somatycznych w HSC, mogą upośledzić normalne różnicowanie i prowadzić do klonalnej ekspansji nieprawidłowych prądników. Takie zmiany mogą ostatecznie prowadzić do zaburzeń hematologicznych charakteryzujących się nieefektywnym krątkoczeniem i cytopeniami, w tym zespołami mielodysplastycznymi (MDS) i ostrą białaczką szpikową (AML)^1,2,3,4,5.

Test jednostki kolonii (CFU) jest dobrze ugruntowaną techniką in vitro do oceny potencjału różnicowania komórek macierzystych i prądników krwiotwórczych (HSPC). Oryginalnie opracowany jako krótkoterminowy test do pomiaru zdolności proliferacyjnej i różnicowania prądników krwiotwórczych^6,7,8, test CFU stał się od tego czasu powszechnie stosowanym narzędziem zarówno w hematologii klinicznej, jak i eksperymentalnej⁹. W przedklinicznych ustawieniach laboratoryjnych test jest często stosowany do oceny wpływu zaburzeń genetycznych lub kandydatów na leki na różnicowanie krwiotwórcze. W kontekście badań nad MDS i AML, testy CFU zapewniają funkcjonalne odczyty do zrozumienia, jak zmiany molekularne i genetyczne wpływają na zdolność różnicowania komórek pochodzących od pacjentów z rdzenia kręgowego lub krwi obwodowej.

Test CFU polega na hodowlanom HSPC w półstałym podłożu na bazie metyloceluozy uzupełnionym o określone czynniki wzrostu, które wspierają ekspansję i różnicowanie linii komórkowych. W tych warunkach prądniki proliferają i dają początek osobnym koloniom, które mogą być morfologicznie sklasyfikowane według tożsamości linii. W tym protokole stosuje się komercyjnie dostępne półstałe podłoże na bazie metyloceluozy zoptymalizowane pod kątem różnicowania erytrocytów i mieloidalnych, które zawiera kombinację cytokin, w tym interleukiny-3 (IL-3), interleukiny-6 (IL-6), czynnika komórki macierzystej (SCF), erytropoetyny (EPO), czynnika stymulującego kolonie granulocytów (G-CSF) oraz czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF). Razem czynniki te wspierają wzrost prądników erytrocytów, takich jak jednostka kolonii-erytrocyt (CFU-E) i jednostka tworząca wybuch erytrocytów (BFU-E), prądników granulocytów-makrofagów (CFU-GM) oraz wielopotatnych prądników, takich jak prądniki granulocytów, erytrocytów, monocytów, megakariocytów (CFU-GEMM)^10,11.

Mimo szerokiego zastosowania, powyższe półstałe podłoże jest ograniczone w swojej zdolności różnicowania, ponieważ nie wspomaga odpowiednio różnicowania megakariocytów i płytek. W tych zastosowaniach bardziej specjalistyczne formuły zawierające czynniki wzrostu płytek są bardziej odpowiednie; jednak są one poza zakresem opisanego protokołu. Ogólnie, poprzez staranne dobór formuły podłoża w połączeniu z oceną morfologiczną i analizą bieżącą, taką jak cytometria przepływowa, naukowcy mogą efektywnie ocenić wrażliwość na leki poprzez analizę zobowiązania linii i potencjału różnicowania¹².

W niniejszym badaniu test CFU jest stosowany do zbadania potencjału terapeutycznego terapii skojarzonych w leczeniu nawrotowych/odpornych wysokiego ryzyka MDS. Pyrymetamina jest klinicznie zatwierdzonym antyfolikiem stosowanym w leczeniu toksoplazmozy oraz malarii pasożytniczej i została niedawno przebadana jako środek przeciwnowotworowy^13,14,15. Ostatnie badania wykazały, że leczenie pyrimetaminą może działać poprzez hamowanie kluczowych szlaków regulujących de novo syntezę pirymidyn¹⁶. W niniejszym protokole testy CFU są wykorzystywane do zbadania klinicznej skuteczności pyrimetaminy jako monoterapii i jako terapii skojarzonej z Venetoclax, który jest obecnie pierwszoliniową terapią w leczeniu MDS i AML^17,18.

Mimo szerokiego zastosowania, test CFU ma kilka ograniczeń technicznych. Identyfikacja i klasyfikacja kolonii opierają się w dużej mierze na kryteriach morfologicznych, co może wprowadzać zmienność między

Protokół

Niniejsze badanie wykorzystuje anonimowe ludzkie materiały biologiczne uzyskane z biobanku na podstawie protokołu zatwierdzonego przez Komisję Etyczną Instytucjonalną – “Biologia molekularna dobroczynnych i złośliwych zaburzeń hematologicznych” (Protokół IRB nr 200536) w Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center. Wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z wytycznymi etyki instytucjonalnej. Wszystkie reagenty i sprzęt wymieniono w ​Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie pochodzących od pacjenta komórek szpiku kostnego lub obwodowego krwi mononuklearnej

UWAGA: Zgodnie z powszechnymi wytycznymi dotyczącymi postępowania z próbkami pacjentów, zaleca się noszenie pełnej laboklautki i rękawic oporny na rozdarcie oraz pracę pod komorą hodowlany w celu ochrony osobistej przed narażeniem na zakażenia przenoszone drogą krwi. Wszystkie końcówki pipet i pipety serologiczne, które mają kontakt z komórkami pacjenta, powinny być moczone w 10% roztworze chloru przez co najmniej 30 minut przed wyrzuceniem w odpady biologicznie niebezpieczne.

1. Przygotowanie eksperymentalne
   1. Podgrzej media IMDM, surowicę położniczą (FBS) i antybiotyki penicylina-streptomycyna (Pen-strep) do 37 °C przez co najmniej 30 min.
   2. Roztapiaj półsztywne media w 4 °C przez noc. W dniu wysiewu, podgrzej butelkę do temperatury pokojowej (RT) przez co najmniej 30 min.
   3. Sterylizuj komorę hodowlaną za pomocą UV przez 15 min, następnie spryskaj powierzchnie komory, pipety i stojaki na probówki 70% alkoholem etylowym (EtOH).
   4. Przygotuj becher z odpadami zawierający 10% roztworu chloru, wystarczająco duży, aby zebrać zanieczyszczone końcówki pipet i pipety serologiczne.
   5. Uzyskaj komórki szpiku kostnego lub obwodowego krwi mononuklearnej izolowane metodami centryfugacyjnymi w gradientzie gęstości. Komórki można użyć w tym samym dniu po pobraniu lub z mrożonych próbek zbiorczych.
2. Jeśli próbki są mrożone, szybko je rozmroź w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aż większość lodu się stopi, a pozostanie tylko mały kryształ lodu. Natychmiast umieść próbki na lodzie po rozmrożeniu.
   UWAGA: Próbki pacjentów są bardzo wrażliwe na rozmrożenie. Ważne jest, aby szybko i w partiach rozmrożać próbki, aby zminimalizować śmierć komórek.
3. Zawieś komórki w 5 mL podgrzanego pełnego medium wzrostowego (media IMDM uzupełnione o 4% FBS i 1% Pen-Strep).
4. Wyznacz stężenie komórek i żywotność za pomocą barwnika AO/PI i automatycznego licznika komórek.
5. Centryfuguj komórki przez 350 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, aby utworzyć pellet komórek. Odłóż nadstan.
6. Ponownie zawieś komórki w 5 mL sterylnego buforu fosforanowego Dulbecco (DPBS). Powtórz centryfugacje, aby utworzyć pellet komórek i odłożyć nadstan.
7. Zawieś komórki w pełnym medium wzrostowym w stężeniu 2 milionów żywych komórek/mL. Przygotuj wystarczającą ilość komórek na 100 tys. komórek/dołku 6-dołkowej płytki.

2. Przygotowanie leków i podawanie leczenia.

UWAGA: Pyrymetamina jest uzyskiwana jako liofilizowano proszek i jest rekonstytuowana w domu w dimetylosulfonie (DMSO) w stężeniu 100 mM; alikwoty są przechowywane w -80 °C. Venetoklaks jest kupowany w postaci roztworu w DMSO w stężeniu 10 mM i jest przechowywany w -20 °C. W tym eksperymencie venetoklaks i pyrimetamina są podawane jako pojedyncza dawka poprzez swobodne przyjęcie równolegle z warunkiem kontrolnym pojazdu DMSO.
OSTROŻNOŚĆ: Pyrymetamina, venetoklaks i DMSO są substancjami biologicznie niebezpiecznymi. Obsługiwać tylko pod komorą, nosząc PPE i stosować z dodatkową ostrożnością.

1. W dniu wysiewu, rozmroź alikwotę leku na lodzie, wymieszaj w wirówce i wiruj z maksymalną prędkością na stołowej mini-wirówce przez 30 s.
2. Wymieszaj i energicznie szarpnij butelkę półsztywnego media, aż wszystkie składniki będą zhomogenizowane. Pozostawić w spokoju w komorze w temperaturze pokojowej przez 30 min, aby pęcherzyki wzniosły się na powierzchnię.
3. Przygotuj 3 mL alikwot półsztywnego media w sterylnych 15 mL stożkowych probówkach. Pozostawić probówki w spokoju przez 30 min, aby pęcherzyki wzniosły się na powierzchnię. Dodatkowe alikwoty półsztywnego media można ponownie zamrozić i przechowywać w -20 °C do późniejszego użytku.
4. Dodaj nie więcej niż 10 μL objętości leku do półsztywnego media. W tym eksperymencie stężenia venetoklaksu i pyrimetaminy są dostosowywane zgodnie z empirycznie określonymi warunkami synergistycznymi. Do grupy kontrolnej pojazdu dodaj odpowiednie objętości DMSO. Przygotuj podwójne 3 mL alikwoty dla każdego warunku.
   UWAGA: Ważne jest, aby objętość do

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia metodę badania kolonii od izolacji próbki pacjenta przez analizę liczby i morfologii kolonii. Rysunek 2 przedstawia kluczowe ustawienia do obrazowania kolonii pod mikroskopem jasnopolowym. Rysunek 3 oraz Rysunek 4 pokazują przykładowe obrazy formacji kolonii pochodzącej od jednego pacjenta, 13 dni po posadzeniu. Na Rysunku 3 ko...

Dyskusja

Opisany tutaj protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę przeprowadzania badań CFU z wykorzystaniem pierwotnych próbek szpiku kostnego i krwi obwodowej pacjentów, ze szczególnym uwzględnieniem utrzymania żywotności komórek i zapewnienia reproduktywalnego wzrostu kolonii. Kilka kroków w protokole jest kluczowych dla uzyskania niezawodnego tworzenia kolonii podczas pracy z próbkami pochodzącymi od pacjentów. Szybkie rozmrażanie krioprzechowywanych komórek jednojądrzastyh wraz z natychmiastowym schłodzeniem jest niezbędne ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Blunt-End 16 G needles	STEMCELL Technologies	28110	do dozowania i wysiewu MethoCult media
Cellometer Auto 2000	Nexelcom Bioscience	26407	licznik komórek
CHT4 Counting Chambers (cell counter slides)	Revvity	CHT4-SD100-002	szlabanki do licznika komórek
Dimethyl sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231-100	używany do rekonstytucji leków i mediów do zamrażania komórek
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	do hodowli komórek
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, Inc.	2701	do sterylizacji powierzchni kultur komórkowych
EVOS M7000 imaging system	ThermoFisher Scientific	AMF7000	do obrazowania kolonii i płytek
Fetal bovine serum	BenchMark	100-106	suplement do mediów do hodowli i zamrażania komórek
IMDM Modified Culture media	Cytiva	SH30228.01	wzbogacone medium kulturowe nadające się do przetwarzania próbek pacjentów
LuerLok Tip 3 mL Syringes	BD	309657	do dozowania i wysiewu MethoCult media
MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	04435	półstałe medium oparte na metylocelulozie do badania kolonii
Multiwell 6-well plate	FALCON	353046	do wysiewu badań kolonii
Nikon Eclipse TS2FL Inverted Trinocular Phase Contrast Fluorescence Microscope	Coastal Microscopes	51623	Do obrazowania i charakteryzacji morfologii kolonii
Pen Strep	Gibco	15140-122	suplement antybiotyczny do hodowli komórek
pyrimethamine	Sigma-Aldrich	46706	zatwierdzony przez FDA antyfoliant
UltraPure Distilled water	Invitrogen	10977-015	do wysiewu badań kolonii
venetoclax	Selleck Chemical LLC	50-136-6419	chemioterapia zatwierdzona przez FDA
ViaStain AOPI Staining Solution	Revvity	CS2-0106	barwnik do liczenia żywych komórek