Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Ochronny efekt lncRNA FGD5-AS1 przeciwko uszkodzeniu mózgu po krwotoku śródmózgowym poprzez targetowanie miR-93-5p

90 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71556

⸱

4 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency Medicine, Nanjing Drum Tower Hospital, The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, 2Department of Neurology, Jianli People's Hospital, 3Department of Rehabilitation Medicine, Ganzhou People's Hospital, 4Department of Nephrology and Endocrinology, Ganzhou Fifth People's Hospital, 5Department of Neurosurgery, Langfang People's Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie to zbadano interakcję między FGD5-AS1 i miR-93-5p w eksperymentalnych modelach krwotoku śródmózgowego i stwierdzono, że wyłączenie FGD5-AS1 było związane ze zmniejszeniem uszkodzenia neurologicznego, stanu zapalnego i stresu oksydacyjnego.

Streszczenie

Krwotok śródmózgowy (ICH) to zaburzenie neurologiczne związane z wysoką śmiertelnością i wysokimi współczynnikami niepełnosprawności, które może prowadzić do poważnych uszkodzeń neurologicznych. W badaniu tym zbadano rolę i mechanizm leżący u podstaw działania FGD5-AS1 w ICH. Stworzono modele in vitro i in vivo ICH. Ocena ekspresji FGD5-AS1 i miR-93-5p została przeprowadzona za pomocą odwrotnej transkrypcji z ilościową reakcją polimerazy łańcuchowej (RT-qPCR). Deficyty neurologiczne oceniono za pomocą zmodyfikowanej skali ciężkości objawów neurologicznych (mNSS), a obrzęk mózgu wyznaczono za pomocą metody suchej i mokrej wagi. Ocena cytokin zapalnych i markerów stresu oksydacyjnego została przeprowadzona za pomocą enzymatycznego testu immunopochłaniania (ELISA). Wyznaczanie żywotności komórek przeprowadzono za pomocą zestawu do badania żywotności i proliferacji komórek. Interakcję między FGD5-AS1 i miR-93-5p zbadano za pomocą podwójnych testów reporterowych luciferase oraz analizy korelacji Pearsona. Eksperymentalne ICH towarzyszyło podwyższonemu występowaniu FGD5-AS1 zarówno w modelach zwierzęcych jak i komórkowych. Tłumienie FGD5-AS1 łagodziło obrzęk mózgu, poprawiało działanie neurologiczne, zmniejszało uszkodzenia zapalne i oksydacyjne oraz poprawiało przeżywalność komórek śródbłonka. Hamowanie miR-93-5p zmniejszało te efekty ochronne, co potwierdza regulacyjną interakcję między dwoma cząsteczkami. FGD5-AS1 negatywnie regulowało ekspresję miR-93-5p, a hamowanie miR-93-5p osłabiało efekty obserwowane po wyłączeniu FGD5-AS1. Wyniki te wskazują, że FGD5-AS1 może przyczyniać się do uszkodzenia mózgu związanego z ICH poprzez regulację miR-93-5p i że oś FGD5-AS1/miR-93-5p może stanowić potencjalny cel dalszych badań nad eksperymentalnym ICH.

Wprowadzenie

Krwotok mózgowy (ICH) to zaburzenie neurologiczne o wysokiej śmiertelności i stopniu niepełnosprawności, stanowiące od 10% do 20% wszystkich przypadków udaru1,2. Z powodu braku skutecznych celów terapeutycznych, leczenie ICH jest obecnie ograniczone do chirurgii i opieki wspomagającej3. Pinho et al. zweryfikowało przewidywania dotyczące śmiertelności ICH, wyników funkcjonalnych i ułamka wzrostu krwotoków, dostarczając nowej perspektywy dla specjalistów zdrowia publicznego4. Pomimo postępów w leczeniu ICH, wyniki dla pacjentów nadal są niezadowalające. Dlatego identyfikowanie nowych celów terapeutycznych dla ICH jest ważne dla poprawy długoterminowego rokowania.

Długie niekodujące RNA (lncRNA) stanowią klasę niekodujących transkryptów o długości przekraczającej 200 nukleotydów, które regulują ekspresję genów poprzez różne mechanizmy, w tym procesy transkrypcyjne, post-transkrypcyjne i epigenetyczne5. Gromadzące się dowody wykazały, że nieprawidłowa ekspresja lncRNA jest związana z patogenezą szeregu zaburzeń neurologicznych, takich jak udar, uraz mózgu, krwotok mózgowy (ICH) i krwotok podpajęczynówkowy6. Wśród tych cząsteczek regulacyjnych, FGD5-AS1 zostało powiązane z kilkoma procesami komórkowymi, w tym proliferacją, apoptozą, sygnalizacją zapalną i reakcjami na stres oksydacyjny. Dzięki mechanizmom takim jak rywalizacja o aktywność endogennych RNA, regulacja transkrypcyjna i modyfikacje epigenetyczne, FGD5-AS1 wpływa na ekspresję wielu dolnych celów. Nieprawidłowa ekspresja FGD5-AS1 została zgłoszona w różnych warunkach patologicznych, w tym nowotworach złośliwych, zaburzeniach układu krążenia i chorobach metabolicznych7,8,9,10,11. Niemniej jednak jego biologiczne znaczenie w chorobach neurologicznych pozostaje niedostatecznie poznane. Poprzednie badania wykazały, że FGD5-AS1 uczestniczy w progresji guza mózgu i glejaka12,13oraz przyczynia się do uszkodzenia neuronów w warunkach niedotlenienia/reperfuzji glukozowej14. Te obserwacje sugerują, że FGD5-AS1 może odgrywać rolę regulacyjną w uszkodzeniu neuronów; jednak jego wkład w uszkodzenie mózgu po ICH nie został jeszcze w pełni wyjaśniony.

MikroRNA (miRNA) to krótkie niekodujące RNA, które regulują ekspresję genów, współdziałając z komplementarnymi sekwencjami w docelowych RNA kurierowych15. Badania wykazały, że miRNA również odgrywają ważną rolę w ICH. Konkretnie, miR-143-3p promuje przejście przez śródbłonek neutrofilów po ostrej kontuzji mózgu poprzez targetowanie ATP6V1A16. miR-195-5p wywiera efekt ochronny przed uszkodzeniem mózgu wywołanym ICH poprzez hamowanie ekspresji MMP-9 i MMP-217. miR-93-5p również zostało zidentyfikowane jako cel terapeutyczny w celu poprawy wyników po ICH18. Chociaż badania potwierdziły nieprawidłową ekspresję FGD5-AS1 i miR-93-5p w ICH oraz ich udział w progresji dysfunkcji neurologicznej po ICH, poprzednie badania koncentrowały się głównie na ich indywidualnych efektach biologicznych. Konkurencyjna relacja regulacyjna między FGD5-AS1 a miR-93-5p jako endogennych RNA nie została jeszcze jasno ustalone.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zwierzęta eksperymentalne

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etykę Zwierząt Szpitala Ludowego w Ganzhou (Numer zgody 20230789) i przeprowadzono zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. W badaniu tym zastosowano szczury SD płci żeńskiej (w wieku 6–8 tygodni, 180–230 g). Szczury były przetrzymywane w warunkach kontrolowanych, z wolnym dostępem do pokarmu i wody, w temperaturze 22 °C ± 3 °C i 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. Zwierzętom pozwolono przyzwyczaić się do warunków przez 7 dni przed rozpoczęciem eksperymentu. Chemikaliami, odczynnikami i sprzętem używanymi w protokołach są wymienione w Tabeli Materiałów.

2. Ustanowienie modelu ICH in vivo

Aby stworzyć eksperymentalny model krwotocznego wylewu wewnątrzczaszkowego (ICH), 0,23 U kolagenazy typu VII zostało rozpuszczone w 1 µL sterylnego fizjologicznego roztworu soli. Szczury zostały znieczulone za pomocą pentobarbitalu sodu (50 mg/kg) wstrzykiwanego dootrzewnowo, po czym roztwór kolagenazy został stereotaktycznie wlewany do zakrętu w tempie 0,5 µL/min (0,2 mm za punktem czołowym, 3,0 mm bocznie od linii środkowej i 6 mm głęboko w powierzchnię czaszki). Zwierzęta w grupie kontrolnej przeszły ten sam proces, ale otrzymały równoważną objętość fizjologicznego roztworu soli zamiast kolagenazy. Schematyczny przegląd eksperymentu znajduje się w Dodatkowej Figurze 1.

Dodatkowa Figura 1: Schemat eksperymentu na zwierzętach. Szczury zostały losowo podzielone na dwie grupy: jedna grupa wykorzystała 0,23U kolagenazy typu VII do konstruowania modelu ICH; druga grupa użyła fizjologicznego roztworu soli jako grupy kontrolnej. Szczury w grupie modelowej zostały losowo podzielone na dwie grupy do analizy roli FGD5-AS1 w ICH i synergicznego działania osi FGD5-AS1/miR-93-5p. Jedną godzinę po indukcji ICH wstrzykano środek transfekcyjny do mózgu szczurów. Ocena funkcji neurologicznych szczurów za pomocą mNSS w dniach 0, 1, 3 i 7; Zbieranie tkanki mózgowej po indukcji ICH przez 7 dni.Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Szczury zostały losowo podzielone na dwie grupy. Jedna grupa została wykorzystana do analizy roli FGD5-AS1 w ICH i została dalej podzielona na cztery podgrupy: Kontrola, ICH, ICH + lentiwirus (LV)-shNC oraz ICH + LV-shFGD5-AS1. Druga grupa została użyta do analizy synergicznych efektów osi FGD5-AS1/miR-93-5p i została podzielona na pięć podgrup: ICH, ICH + LV-shNC, ICH + LV-shFGD5-AS1, ICH + LV-shFGD5-AS1 + antagomir NC oraz ICH + LV-shFGD5-AS1 + antagomir miR-93-5p. Każda grupa obejmowała 12 szczurów. 1 godzinę po indukcji ICH wstrzykano środek transfekcyjny do mózgu szczurów w dawce 2 mg/kg.

3. Hodowla i przetwarzanie komórek

Komórki śródbłonka mikrokrążeniowego mózgu (BMEC) służą jako kluczowy model do badania bariery krew-mózg, mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń neurologicznych i dostarczania leków20. In vitro model ICH został stworzony za pomocą tlenowo-glukozowego niedotlenienia (OGD)/leczenia heminą w BMEC3. BMEC były hodowane w pożywce DMEM bez glukozy i surowicy pod mieszanką gazową 5% CO2 i 95% N2 przez 10 min. Następnie komórki były traktowane heminą (10µM) i przenoszone do komory beztlenowej zawierającej 5% CO2 i 95% N2 przez 2 godziny. OGD było kończone przez przywrócenie komórek do normalnych warunków hodowli. Grupa kontrolna była traktowana PBS w tych samych warunkach.

Komórki były transfekowane zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki były transfekowane 20 nM siRNA FGD5-AS1 (si-FGD5-AS1), siRNA kontroli ujemnej (si-NC), inhibitorem miR-93-5p lub inhibitorem kontroli ujemnej (NC inhibitor).

4. Zmodyfikowany test wskaźnika wskaźnika neurologicznego

Po ustanowieniu in vivo modelu ICH, funkcje neurologiczne oceniono za pomocą zmodyfikowanego Wskaźnika Ciężkości Neurologicznej (mNSS) w dniach 0, 1, 3 i 7. Wyniki były liczone na podstawie czterech domen: funkcja motoryczna, funkcja zmysłowa, równowaga i funkcja odruchowa. Wynik od 1–4 oznaczał łagodne upośledzenie, 5–9 oznaczało umiarkowanie zaburzone funkcje, a 10–14 oznaczało ciężkie upośledzenie.

5. Pobieranie próbek

7 dni po indukcji ICH, szczury zostały znieczulone za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 50 mg/kg pentobarbitalu sodu, po czym wykonano e

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wpływ FGD5-AS1 na szczury z ICH

Ekspresja FGD5-AS1 była znacznie wyższa w grupie ICH niż w grupie kontrolnej (P < 0.01; Rycina 1A). Po transfekcji LV-shFGD5-AS1 ekspresja FGD5-AS1 uległa wyraźnemu zmniejszeniu w porównaniu z grupą LV-shNC (Rycina 1B). Ocena obrzęku mózgu wykazała cięższy obrzęk mózgu u szczurów z ICH niż u szczurów kontrolnych, natomiast wyciszenie FGD5-AS1 znacząco zredukowało zawartość wody w móz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Uszkodzenie mózgu po śródmózgowym krwotoku wynika nie tylko z początkowego zdarzenia krwotocznego, ale również z serii wtórnych reakcji patologicznych, które rozwijają się z czasem21. Podczas gdy pierwotne krwiak powoduje bezpośrednią mechaniczną destrukcję otaczającej tkanki, późniejsze uszkodzenie jest pośredniczywane przez procesy takie jak aktywność zapalna, uszkodzenie oksydacyjne i zaprogramowana śmierć komórek. Te mechanizmy wtórne znacząco przyczyniają się do pogorszenia stanu neurologiczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych istotnych interesów finansowych ani niefinansowych, które należy ujawniać.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Antagomir NCGenePharma, ChinaB04007Negative control antagomir
BMECsATCC, USACRL-8270Human brain microvascular endothelial cells
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)Beyotime, ChinaC0038Kit do badania żywotności komórek
DMEM mediumGibco, USA12430054Środowisko bezglukozowego i bezsurowcowego
Dual-Glo Luciferase Assay SystemPromega, USAE2920Wykrywanie aktywności lucyferazy
Electronic balanceSartoriusSecura224-1CNPrecyzyjne wagi do ważenia tkanek
GAPDH and U6 primersSangon BiotechCustom primer synthesis servicePrymery referencyjne wewnętrzne
Graphpad Prism 8.0GraphPad Software, USA——Oprogramowanie do analizy statystycznej
HeminMCE, ChinaHY-19424Hemina jako środek do wywoływania uszkodzeń komórek
IL-1 beta ELISA kitsAbcam, UKab197742Ilościowe określanie cytokin zapalnych
IL-6 ELISA kitsAbcam, UKab222503Ilościowe określanie cytokin zapalnych
LightCycler 96 PCR systemRoche,Szwajcaria5815916001Instrument do przeprowadzania reakcji PCR w czasie rzeczywistym
Lipofectamine 3000Invitrogen, USAL3000001Środek transfekcyjny
MDA assay kitBeyotime, ChinaS0131Kit do badania peroksydacji lipidów
Microplate readerBioTekSynergy H1Pomiar absorbancji OD450
miR-93-5p antagomirGenePharma, ChinaB05001Inhibitor miR-93-5p do eksperymentów in vivo
PBSSolarbio, ChinaP1020Sól fosforanowa buforowa
Pentobarbital sodiumSigma, Merck KGaA11715Środek znieczulający
pGL3-PromoterNovoPro, ChinaV011541Wektor reporterowy lucyferazy
PrimeScript RT Mix kitTakara, JaponiaRR037AKit do odwrotnej transkrypcji
RIPABeyotime, ChinaP0013BBufor do lizy białkowej/tkankowej
ShFGD5-AS1 lentivirusGenePharma, ChinaD02001Wektor knockdown FGD5-AS1
SPF-grade female SD ratVital River——6-8 tygodni stara szczura SD, klasa SPF
SYBR Green Realtime PCR Master MixTakara, JaponiaRR420AŚrodek do ilościowego badania PCR w czasie rzeczywistym
TNF-α ELISA kitsAbcam, UKab208348Ilościowe określanie cytokin zapalnych
TRIzol reagentInvitrogen, USA15596026Środek do ekstrakcji RNA
Type VII collagenaseSigma, Merck KGaAC0773Z Clostridium histolyticum; indukcja ICH

Bibliografia

  1. Wang B, et al. CircTrim37 ameliorates intracerebral hemorrhage outcomes by modulating microglial polarization via .the miR-30c-5p/SOCS3 axis. Mol Neurobiol. 2024;61(7):4038-54.
  2. Sheth KN. Spontaneous intracerebral hemorrhage. N Engl J Med. 2022;387(17):1589-96.
  3. Xie L, Wang Y, Chen Z. LncRNA Blnc1 mediates the permeability and inflammatory response of cerebral hemorrhage by regulating the PPAR-γ/SIRT6/FoxO3 pathway. Life Sci. 2021;267:118942.
  4. Pinho J, et al. Intracerebral hemorrhage outcome: A comprehensive update. J Neurol Sci. 2019;398:54-66.
  5. Bridges MC, Daulagala AC, Kourtidis A. LNCcation: lncRNA localization and function. J Cell Biol. 2021;220(2):e202009045.
  6. Zhang L, et al. Targeting non-coding RNA for CNS injuries: Regulation of blood-brain barrier functions. Neurochem Res. 2023;48(7):1997-2016.
  7. He Z, et al. Exosome-derived FGD5-AS1 promotes tumor-associated macrophage M2 polarization-mediated pancreatic cancer cell proliferation and metastasis. Cancer Lett. 2022;548:215751.
  8. Aichen Z, Kun W, Xiaochun S, Lingling T. LncRNA FGD5-AS1 promotes the malignant phenotypes of ovarian cancer cells via .targeting miR-142-5p. Apoptosis. 2021;26(5-6):348-60.
  9. Zhu F, Niu R, Shao X, Shao X. FGD5-AS1 promotes cisplatin resistance of human lung adenocarcinoma cell via .the miR-142-5p/PD-L1 axis. Int J Mol Med. 2021;47(2):523-32.
  10. Wei J, et al. Long non-coding RNA FGD5 antisense RNA 1 targets Baculovirus inhibitor 5 via .microRNA-497-5p to alleviate calcific aortic valve disease. Clin Hemorheol Microcirc. 2024;86(3):285-302.
  11. Ajorlou P, Hosseini SA, Ghanbarnejad A, Shekari M. FGD5-AS1 and Th1/Th2 imbalance in the progression of diabetic nephropathy: Evidence from bioinformatic and experimental validation. Clin Exp Med. 2025;26(1):38.
  12. Gong X, Huang M, Chen L, Zeng H. FXR1 promotes glioma progression by downregulating microRNA-124-3p through long noncoding RNA FGD5-AS1 upregulation. Acta Neurol Belg. 2023;123(4):1453-64.
  13. Su D, et al. Long noncoding RNA FGD5-AS1 enhances the viability, migration, and invasion of glioblastoma cells by regulating the miR-103a-3p/TPD52 axis. Cancer Manag Res. 2020;12:6317-29.
  14. Zhang XQ, Song LH, Feng SJ, Dai XM. LncRNA FGD5-AS1 acts as a competing endogenous RNA for miRNA-223 to lessen oxygen-glucose deprivation and simulated reperfusion (OGD/R)-induced neuronal injury. Folia Neuropathol. 2019;57(4):357-65.
  15. Ho PTB, Clark IM, Le LTT. MicroRNA-based diagnosis and therapy. Int J Mol Sci. 2022;23(13):7167.
  16. Wu X, et al. Astrocyte-derived extracellular vesicular miR-143-3p dampens autophagic degradation of endothelial adhesion molecules and promotes neutrophil transendothelial migration after acute brain injury. Adv Sci (Weinh). 2024;11(5):e2305339.
  17. Tsai YC, et al. MicroRNA-195-5p attenuates intracerebral-hemorrhage-induced brain damage by inhibiting MMP-9/MMP-2 expression. Biomedicines. 2024;12(6):1373.
  18. Cheng X, et al. MicroRNA and their target mRNAs change expression in whole blood of patients after intracerebral hemorrhage. J Cereb Blood Flow Metab. 2020;40(4):775-86.
  19. Lu Z, Huang K. Protective effect of silencing lncRNA HCP5 against brain injury after intracerebral hemorrhage by targeting miR-195-5p. BMC Neurosci. 2025;26(1):2.
  20. Wu Z, Liang Y, Yu S. Downregulation of microRNA-103a reduces microvascular endothelial cell injury in a rat model of cerebral ischemia by targeting AXIN2. J Cell Physiol. 2020;235(5):4720-33.
  21. An SJ, Kim TJ, Yoon BW. Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: An update. J Stroke. 2017;19(1):3-10.
  22. Keep RF, et al. Brain endothelial cell junctions after cerebral hemorrhage: Changes, mechanisms and therapeutic targets. J Cereb Blood Flow Metab. 2018;38(8):1255-75.
  23. Srinivas T, Siqueira E, Guil S. Techniques for investigating lncRNA transcript functions in neurodevelopment. Mol Psychiatry. 2024;29(4):874-90.
  24. Zhang J, et al. LncRNA Snhg3 contributes to dysfunction of cerebral microvascular cells in intracerebral hemorrhage rats by activating the TWEAK/Fn14/STAT3 pathway. Life Sci. 2019;237:116929.
  25. Ai Y, et al. Long non-coding RNA MIR17HG impedes FOSL2-mediated transcription activation of HIC1 to maintain a pro-inflammatory phenotype of microglia during intracerebral haemorrhage. Eur J Neurosci. 2023;58(10):4107-22.
  26. Jiang F, et al. LncRNA FGD5-AS1 accelerates intracerebral hemorrhage injury in mice by adsorbing miR-6838-5p to target VEGFA. Brain Res. 2022;1776:147751.
  27. Wang H, et al. Transforming growth factor-β1 functions as a competitive endogenous RNA that ameliorates intracranial hemorrhage injury by sponging microRNA-93-5p. Mol Med Rep. 2021;24(1):511.
  28. Xie B, Qiao M, Xuan J. LncRNA MEG3 downregulation relieves intracerebral hemorrhage by inhibiting oxidative stress and inflammation in an miR-181b-dependent manner. Med Sci Monit. 2021;27:e929435.
  29. Chen JX, Zhi JW, Wang YP, Ning B. LncRNA-PEAK1 promotes neuronal apoptosis after intracerebral hemorrhage by the miR-466i-5p/caspase-8 axis. Heliyon. 2023;9(4):e15091.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Medycynanumer 234numer 234Wartość pustaNumerstan zapalnystres oksydacyjny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.