Ten protokół pokazuje ablacje laserem Ho:YAG przezpęcherzową w celu stworzenia możliwie najbardziej powtarzalnego modelu szczura z przewlekłym zapaleniem szyi pęcherza moczowego do badania nad remodelacją włóknień indukowaną obrażeniami termicznymi i interwencjami terapeutycznymi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Laserowa indukcja ściśnięcia szyjki pęcherza z zastosowaniem lasera Holmium:YAG w modelu szczura
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zwężenie szyi pęcherza (BNC) jest zwłóknionym zwężeniem otworu pęcherza i trudną powikłaniem po przezcewkowej resekcji prostaty (TURP). Istniejące modele zwierzęce często opierają się na zewnątrzmaziowej ligturze lub chemicznym kauteryzacji, które nie adekwatnie odtwarzają zwłóknienie wywołane obrażeniami termicznymi, które rozwijają się po zabiegu endoskopicznym i mogą wykazywać ograniczoną powtarzalność. Przedstawiamy tutaj model szczura zwłóknienia szyi pęcherza indukowanego przez przezcewkową ablacje szyi pęcherza laserem Holmium:YAG (laser Ho:YAG). Po małej środkowej laparotomii w dolnej części brzucha i cystotomii, 200-μm światłowód lasera Ho:YAG jest wprowadzany do światła pęcherza pod bezpośrednim widzeniem. Energia lasera jest dostarczana w trybie kontaktowym przy 1,0 J i 10 Hz przez 5 s na punkt w pozycjach 3 i 9 na zegarku szyi pęcherza, co odpowiada 50 J na punkt i 100 J na zwierzę. Cztery tygodnie później, u zwierząt leczonych rozwija się makroskopowe powiększenie pęcherza, zwężenie szyi pęcherza, pogrubienie ściany pęcherza oraz dowód histologiczny na zwłóknienie przebudowy, w tym zwiększone odkładanie kolagenu oraz zwiększone ekspresję kolagenu typu I i III. Ten protokół zapewnia praktyczny model, który naśladuje miejscowe blizny wywołane obrażeniami termicznymi w otworze pęcherza. Ponieważ używane są szczury płci żeńskiej, a funkcjonalne badanie urodynamiczne nie zostało przeprowadzone w obecnym badaniu, model ten jest najlepiej przystosowany do badania zwłóknienia szyi pęcherza i strukturalnej przebudowy, a nie do pełnego odtworzenia BNC po operacji gruczołu krokowego u mężczyzn. Model może być przydatny do badania mechanizmów zwłóknienia BNC oraz do przedklinicznej oceny interwencji przeciwzwłóknieniowych lub rekonstrukcyjnych.
Wprowadzenie
Zwężenie szyjki pęcherza (BNC) to włókniste zwężenie szyjki pęcherza, które występuje często po zabiegach przezcewkowych, szczególnie TURP1,2,3. Jego podstawą patofizjologiczną jest nadmierny proces bliznowacenia i odkładanie kolagenu po urazie tkankowym oraz nieprawidłowym gojeniu się ran4,5,6. Ponieważ BNC może prowadzić do uporczywych zaburzeń opróżniania, nawracających interwencji i znacznej morbidytetu, potrzebny jest odtwarzalny model eksperymentalny do badania jego patogenezy i leczenia7.
Do badania obturacji ujścia pęcherza lub otaczającej moczowodu fibrozy stosowano kilka modeli zwierzęcych, w tym zewnątrzotrzewnowe związanie proksymalnego odcinku cewki moczowej8 oraz inne otwarte podejścia chirurgiczne9. Chociaż modele te mogą wywołać obturację dróg moczowych i przerost mięśnia zwieracz pęcherza, nie odtwarzają one specyficznie zlokalizowanego urazu termicznego, który jest uznawany za inicjujący pooperacyjne BNC po chirurgii endoskopowej. Ponadto często trudno jest standaryzować docelowy obszar anatomiczny i stopień urazu, co może zwiększyć zmienność między zwierzętami.
Idealny model związany z BNC powinien spełniać trzy kryteria: powinien mieć na celu anatomiczną szyjkę pęcherza, odtwarzać kontrolowane urazy termiczne podobne do tych wytwarzanych przez endoskopowe urządzenia energetyczne oraz niezawodnie powodować włókniste zwężenie przy dopuszczalnej złożoności chirurgicznej. Aby sprostać tym potrzebom, opracowałeśmy protokół oparty na laserze Ho:YAG przezcewkowym u szczurów samic. Wybrane zostały samice, aby ułatwić ekspozycję chirurgiczną i izolować uraz termiczny specyficzny dla szyjki pęcherza oraz przebudowę włókniącą bez ingerencji ze strony tkanki prostaty. Za pomocą bezpośredniej wizualizacji dopęcherzowej metoda ta umożliwia dokładne dostarczenie energii laserowej do błony śluzowej i podśluzówki szyjki pęcherza i powoduje występowanie powtarzalnego włóknistego zwężenia ujścia pęcherza.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Instytucjonalnymi i ich Użytkowania Komitetu Etyki Opieki nad Zwierzętami Eksperymentalnymi Instytutu Medycyny Tradycyjnej Chin w Pekinie (Numer zgody BJTCM-R-2025-03-02). Zwierzęta przetrzymywano w standardowych warunkach z dostępem ad libitum do pokarmu i wody. W obecnym protokole użyto łącznie 16 szczurów, w tym 8 szczurów w grupie kontrolnej bez operacji i 8 szczurów w grupie leczonych laserem Ho:YAG. Dwa zwierzęta w grupie leczonych laserem Ho:YAG zmarły pooperacyjnie. Żadne dodatkowe zwierzęta nie zostały wykluczone z powodu perforacji, ciężkiego krwotoку lub niepowodzenia indukcji modelu.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
- Przygotuj meloxicam w stopniu farmaceutycznym do przewlekania analgezji okołooperacyjnej (Rysunek 1A), małe urządzenie do znieczulenia inhalacyjnego (Rysunek 1B), system laserowy Ho:YAG z 200-mikrometrową włókną laserową (Rysunek 1C), sterylne mikrochirurgiczne narzędzia (Rysunek 1D), 8-0 absorbowalne warkocze (powlekane kwasem poliglikolinowym, PGA) do zamknięcia cystotomii, 4-0 absorbowalne warkocze z poliglaktyny 910 do zamknięcia skóry, sterylny roztwór soli fizjologicznej, sterylne prześcieradła, sterylne waciki, i sterylny smar (Rysunek 1E).
- Wywołać znieczulenie z 3%;4% izofluranem w tlenie w komorze indukcyjnej i podtrzymać znieczulenie z 1,5%;2,5% izofluranem przez rurkę nosową podczas operacji.
- Dostosować stężenie według częstości oddechów i zatwierdzonego protokołu instytucjonalnego dotyczącego zwierząt. Potwierdzić wystarczającą głębokość znieczulenia brakiem odruchu po szczypnięciu palca przed nacięciem i ponownie ocenić głębokość znieczulenia przez cały zabieg.
- Odstrzyżyć sierść szeroko z dolnej części brzucha, aby prześcieradło pokryło włosy, które pozostały i zapobiegłoby kontaktowi narządów z nieodstrzyżoną sierścią.
- Dezynfekować pole operacyjne naprzemiennie piaskowcami povidonu-jodu i 70% alkoholem izopropylowym; wykonaj trzy aplikacje każdego roztworu przed przykryciem.
- Umieść zwierzę w pozycji leżącej na plecach na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C i podtrzymuj sterylne warunki podczas całego zabiegu.
- Jeśli wymagane jest wypełnienie pęcherza lub śródoperacyjne zidentyfikowanie szyi pęcherza, wysmaruj małej sterylnej cewnik lub kanylu sterylnym smarem, delikatnie wsuń go przez ujście cewki moczowej do pęcherza i powoli wpraw sterylny roztwór soli fizjologicznej. Unikaj siłkowego wprowadzania lub nadmiernego wypełnienia. Usuń lub zabezpiecz cewnik zgodnie z planowanym narażeniem chirurgicznym.
2. Ekspozycja pęcherza
- Wykonaj 3-4 cm dolny środkowy nacięcie skóry w warunkach sterylnych (Rysunek 2A).
- Za pomocą szczypców o ostrych końcach i mikroskalpeli podziel tkankę podskórną i otwórz linię białą, aby wejść do jamy otrzewnej.
- Delikatnie ujawni pęcherz moczowy za pomocą bezpiecznych szczypiec (Rysunek 2B).
- Zidentyfikuj szyję pęcherza jako połączenie między podstawą pęcherza a proksymalną częścią cewki moczowej.
- Umieść tępy probnik pod szyją pęcherza, aby zapewnić delikatne wsparcie i ustabilizować docelowy obszar (Rysunek 2C).
3. Transwezykalna ablacja laserem Ho:YAG
- Rozcieńczyć pęcherz sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aż ściana pęcherza stanie się umiarkowanie napięta. Unikać nadmiernego rozciągnięcia, które może zasłonić znamiona anatomiczne lub zwiększyć napięcie w miejscu cystotomii.
- Stwórz 0,5 cm podłużne cystotomię na przednim czubku pęcherza za pomocą drobnych mikroskalpelek (Rysunek 2D).
- Wprowadź przygotowaną 200-mikrometrową włóknę laserową Ho:YAG przez cystotomię do światła pęcherza.
- Za pomocą bezpośredniego widoku zasuń włókno do szyi pęcherza.
- Delikatnie umieść końcówkę włókna w bezpośrednim kontakcie ze śluzówką szyi pęcherza. Utrzymuj tryb kontaktowy bez widocznego wgniecenia tkanki; upewnij się, że odległość końcówka-tkanka wynosi około 0 mm przez cały czas dostarczania energii.
- Dostarcz energię laserową na poziomie 1,0 J i 10 Hz przez 5 s w położeniu 9 godzin (Rysunek 3A) i powtórz w położeniu 3 godzin (Rysunek 3B). To ustawienie dostarcza
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Cztery tygodnie po zabiegu szczury poddane działaniu lasera Ho:YAG wykazały powtarzalne zmiany makroskopowe i histologiczne zgodne z włóknistym zwężeniem szyjki pęcherza moczowego. W badaniu grupa kontrolna bez operacji obejmowała 8 szczurów, a grupa leczona laserem Ho:YAG obejmowała 8 szczurów. U 6 z 8 zwierząt leczonych rozwinął się oczekiwany fenotyp; ubytki wynikały z 2 zgonów pooperacyjnych w grupie leczonej laserem Ho:YAG, bez dodatkowych wykluczeń. Makroskopowo pęcherze kontrolne miały prawidłową wielkość i gładką...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tej pracy utworzyliśmy model szczura zwężenia włóknisto-fibrotycznego szyi pęcherza za pomocą transpęcherzowej ablacji laserem Ho:YAG. Główną zaletą tej metody jest to, że wytwarza kontrolowane uszkodzenie termiczne w miejscu anatomicznym szyi pęcherza, po którym następuje progresywna włóknista remodelacja. Różni się to od tradycyjnych modeli zewnątrzpęcherzowych zwężeń, które głównie powodują obturację poprzez zewnętrzne ściskanie, a nie wrodzone tworzenie blizny10. Ponieważ pooperacyjne zwężen...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta została wspierana przez granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82474255 dla H.R.) oraz Program Badań Administracji Prowincji Hebei ds. Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (B2025018 dla H.R.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Absorbable braided suture (coated PGA), 8-0 | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd., Shanghai, China | R831 | |
| Anti-collagen I antibody, mouse monoclonal | Proteintech Group, Inc., Wuhan, China | 66761-1-Ig | |
| Anti-collagen III antibody, mouse monoclonal | Proteintech Group, Inc., Wuhan, China | 68320-1-Ig | |
| Coated Vicryl Plus suture (polyglactin 910), 4-0 | Ethicon, Inc. (Johnson & Johnson) | VCP773D | SH 26 mm ½-circle taper needle; violet braided; absorbable; Lot: RLMCJX |
| Hematoxylin and eosin (HE) staining kit | Servicebio, Wuhan, China | 2310005 | |
| Holmium-YAG Laser System (LITHO) | Quanta System S.p.A, Italy | https://www.quantasystem.com/laser/litho/ | 1 J, 10 Hz, 10 W, 200 μm fiber |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Boster, Wuhan, China | BA1050 | |
| Isoflurane | RWD | 2025010601 | |
| Masson's trichrome staining kit | Zhuhai Baso Biotechnology Co., Ltd., Zhuhai, Guangdong, China | BA4079B | |
| Meloxicam Injection | Qilu Animal Health, Shandong, China | E135H003 | |
| Paraformaldehyde (4%) | Servicebio, Wuhan, China | 2510H0070148 | |
| Picrosirius red staining kit | Nanjing Senbeijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, Jiangsu, China | 20250228 | |
| Safety intravenous catheter, 24 G | Guangdong Lily Medical Technology Co., Ltd., Foshan, Guangdong, China | AD4-240827 | |
| Small-animal inhalation anesthesia system | RWD Life Science, Shenzhen, China | https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/ | Induce with 3%–4% isoflurane in oxygen |
Bibliografia
- Wu Y, et al. Analysis of risk factors for bladder neck contracture after transurethral endoscopic surgery for benign prostatic hyperplasia. Aging Male. 2024;27(1):2429456.
- Rassweiler J, et al. Complications of transurethral resection of the prostate (TURP)--incidence, management, and prevention. Eur Urol. 2006;50(5):969-79; discussion 980.
- Simhan J, et al. Bladder neck contracture. Transl Androl Urol. 2014;3(2):214-20.
- Browne BM, Vanni AJ. Management of urethral stricture and bladder neck contracture following primary and salvage treatment of prostate cancer. Curr Urol Rep. 2017;18(10):76.
- Pakshir P, Hinz B. The big five in fibrosis: macrophages, myofibroblasts, matrix, mechanics, and miscommunication. Matrix Biol. 2018;68-69:81-93.
- Li L, Zhao Q, Kong W. Extracellular matrix remodeling and cardiac fibrosis. Matrix Biol. 2018;68-69:490-506.
- Ren Y, et al. Bladder neck contracture: incidence, mechanisms, and therapeutic advances. Ann Med Surg (Lond). 2025;87(11):7378-7389.
- Mattiasson A, Uvelius B. Changes in contractile properties in hypertrophic rat urinary bladder. J Urol. 1982;128(6):1340-2.
- Igawa Y, et al. A rat model for investigation of spinal mechanisms in detrusor instability associated with infravesical outflow obstruction. Urol Res. 1993;21(4):239-44.
- Varkarakis IM, et al. Comparison of erbium:yttrium-aluminum-garnet and holmium:yttrium-aluminum-garnet lasers for incision of urethra and bladder neck in an in vivo porcine model. Urology. 2005;65(1):191-5.
- Hu X, et al. Clinical comparison of TURP, PVP and HoLEP for small volume BPH. Sci Rep. 2025;15(1):34751.
- Kang D, et al. Morphological characterization of tissue destruction according to the distance between holmium:YAG laser tip and tissue surface. Int Neurourol J. 2024;28(3):196-206.
- Zhang SL, Wong AW. A novel technique for atraumatic transurethral catheterisation of male rats. Biol Open. 2024;13(9).
- Kendall RT, Feghali-Bostwick CA. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Front Pharmacol. 2014;5:123.
- Kitta T, et al. Benefits and limitations of animal models in partial bladder outlet obstruction for translational research. Int J Urol. 2018;25(1):36-44.
- Wang Y, et al. Urethral orifice hyaluronic acid injections: a novel animal model of bladder outlet obstruction. BMC Urol. 2015;15:8.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
