Badanie to zidentyfikowało główne cele i ścieżki działania shikoniny na RCC poprzez wielometodyczną analizę i in vitro walidację, dostarczając ram dla dalszych badań mechanistycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Badanie to zidentyfikowało główne cele i ścieżki działania shikoniny na RCC poprzez wielometodyczną analizę i in vitro walidację, dostarczając ram dla dalszych badań mechanistycznych.
Rak komórek nerkowych (RCC) jest jednym z najczęstszych nowotworów układu moczowego i ma najwyższy wskaźnik śmiertelności. Poprzednie badania wykazały, że shikonin może leczyć rak komórek nerkowych, jednak mechanizm działania pozostaje niejasny. Dlatego nasze badanie miało na celu wyjaśnienie mechanizmu działania shikoninu w leczeniu raka komórek nerkowych, wykorzystując farmakologię sieciową, dokowanie molekularne oraz in vitro badania funkcjonalne, w tym proliferację komórek, migrację i apoptozę, z walidacją western blot (WB). Cele shikoninu były przeszukiwane za pomocą PharmMapper, SwissTargetPrediction i innych baz danych, a cele związane z RCC były identyfikowane z Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), GeneCards i innych baz danych; potencjalne cele terapeutyczne uzyskiwano poprzez analizę przecinania. Zbudowano sieć interakcji białko-białko (PPI), a Cytoscape zostało użyte do przesiewania głównych celów, podczas gdy dokowanie molekularne było stosowane do analizy powinowactwa wiązania między shikoniną a kluczowymi celami. Zebrano łącznie 374 cele shikoninu i 1087 cele związane z RCC, a zidentyfikowano 98 nakładających się genów docelowych. Zidentyfikowano sześć głównych celów (SRC, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, PTPN11 i PIK3R1). Analizy Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) wykazały, że shikonin wywierał przeciwdziałające działanie na RCC głównie poprzez regulację aktywności kinaz białkowych, ścieżki HIF-1 i IL-17. Dokowanie molekularne potwierdziło, że shikonin wykazywał silne powinowactwo wiążące z tymi głównymi celami. In vitro badania przeprowadzone na ludzkich komórkach RCC Caki‑1 i 786‑O wykazały, że shikonin znacząco hamował proliferację i migrację komórek w sposób zależny od dawki, promował apoptozę komórek oraz zwiększał aktywność kaspazy‑3 i kaspazy‑8. Doświadczenia western blot dodatkowo potwierdziły, że shikonin modulował ekspresję białek docelowych i hamował ścieżkę sygnalizacyjną HIF-1. To badanie systematycznie wyjaśnia mechanizm farmakologiczny shikoninu przeciwko rakowi komórek nerkowych, dostarczając teoretycznej podstawy dla rozwoju i zastosowania shikoninu jako nowego środka przeciwnowotworowego przeciwko rakowi komórek nerkowych.
Rak komórkowy nerek (RCC) jest najczęstszym złośliwym guzem układu moczowego, stanowiąc około 90% wszystkich złośliwych guzów nerek i 2%–3% złośliwych guzów u dorosłych na świecie. Według danych GLOBOCAN 2022 w 2022 roku na świecie wystąpiło około 434 800 nowych przypadków i 155 953 zgonów z powodu raka komórkowego nerek, a zachorowalność i śmiertelność z powodu RCC wykazują ciągłą tendencję wzrostową. American Cancer Society oszacowała, że tylko w Stanach Zjednoczonych w 2025 roku wystąpi 80 980 nowych przypadków i 14 510 zgonów z powodu raka komórkowego nerek. Rak komórkowy nerek ma najwyższą śmiertelność wśród złośliwych guzów układu moczowego, a pacjenci z przerzutami lub opornym na leki RCC nadal wykazują niekorzystny rokowanie. Dzięki szerokiemu zastosowaniu terapii ukierunkowanej i immunoterapii osiągnięto znaczny postęp w klinicznym leczeniu RCC. Pierwszoliniowym standardowym leczeniem zaawansowanego lub przerzutowego raka komórkowego nerek są głównie schematy łączące inhibitory punktów kontrolnych immunologicznych lub schematy łączące inhibitory punktów kontrolnych immunologicznych z inhibitorami kinazy tyrozynowej przeciwangiogennej. Pomimo ciągłego postępu podejść terapeutycznych, wiele pacjentów nadal doświadcza progresji choroby, oporności na leki lub nietolerancji leczenia. Dlatego rozwój nowych leków przeciwko RCC o jasnych mechanizmach, bezpieczeństwie i skuteczności pozostaje pilną potrzebą kliniczną1,2,3.
Szykonina jest głównym składnikiem czynnym biologicznie wyodrębnionym z Radix Arnebiae, a jego pochodna acetylszykonina wykazała wybitne działanie przeciwko RCC. Istniejące dowody wykazały, że szykonina wywiera działanie przeciwko RCC poprzez wielocelowy i wielodróżkowy mechanizm regulacji. Mechanizmowo, szykonina może zwiększyć ekspresję genu supresorowego nowotworu TEK i hamować fosforylację kaskady sygnałowej AKT/mTOR, tym samym hamując proliferację, migrację i inwazję komórek RCC4; Ponadto, szykonina indukuje gromadzenie się reaktywnych form tlenu (ROS) wewnątrzkomórkowych, aby wywołać dysfunkcję mitochondriów, co dalej inicjuje wiele wzorców zaprogramowanej śmierci komórkowej, w tym apoptozę, nekroptozę i autofagię w komórkach RCC5. Moduluje również ekspresję mikroRNA, takich jak miR-15b i miR-99b i reguluje geny docelowe związane z apoptozą, w tym FOXO1 i PDCD4, za pośrednictwem szlaku MAPK/ERK, przy czym te efekty regulacyjne wykazują wyraźną specyficzność linii komórkowej6. Należy zauważyć, że szykonina zachowuje silne działanie przeciwnowotworowe przeciwko opornym na sunitynib liniom komórek RCC, gdzie wywiera efekty terapeutyczne poprzez aktywację kompleksów nekrosomowych, hamowanie szlaku AKT/mTOR i indukowanie zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G2/M7. Chociaż przeciwnowotworowe działanie szykoniny zostało częściowo potwierdzone istniejącymi badaniami eksperymentalnymi, główne cele terapeutyczne, kluczowe sieci sygnałowe i podstawowe mechanizmy regulacji molekularnej szykoniny przeciwko RCC pozostają niejasne; ponadto, systematyczne przewidywanie, weryfikacja molekularna i eksperymentalne potwierdzenie jej centralnych celów są nadal brakujące, co tworzy istotną lukę badawczą w obecnych badaniach.
Farmakologia sieciowa i dokowanie molekularne służą jako uzupełniające podejścia techniczne w nowoczesnym badaniu naturalnych leków i badaniu mechanizmu farmakologicznego. Z systematycznej perspektywy, farmakologia sieciowa może systematycznie dekodować wielocelowe, wielodróżkowe cechy interakcji holistycznych między związkami czynnymi biologicznie a celami związanymi z chorobą. W przeciwieństwie do tego, dokowanie molekularne umożliwia weryfikację na poziomie molekularnym powinowactwa wiązania i stabilnego wzorca interakcji między związkami małocząsteczkowymi a białkami docelowymi. Połączenie tych dwóch metodologii konstruuje systematyczną pętlę badawczą holistycznego przewidywania celów, następującej weryfikacji molekularnej. Łączenie walidacji eksperymentalnej z farmakologią sieciową i dokowaniem molekularnem jest głównym podejściem do badań nad naturalnymi lekami, które ułatwiają wyjaśnienie patogenezy choroby i ewidencjonowanie mechanizmów farmakologicznych związków, a także zapewniają teoretyczny рамки dla podstawowych badań i zastosowań translacyjnych leków8,9.
W niniejszym badaniu zastosowano farmakologię sieciową do przewidywania kandydatów do celów szykoniny w leczeniu raka komórkowego nerek. Dokowanie molekularne zostało wykorzystane do teoretycznej weryfikacji potencjalnych celów, a kluczowe cele działania zostały ostatecznie określone za pomocą eksperymentów in vitro i potwierdzone dalszymi eksperymentami Western Blot (WB). Cały proces tego badania przedstawiono na Rysunku 1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie linie komórek ludzkich wykorzystane w niniejszym badaniu zostały zakupione od uwierzytelnionych komercyjnych banków komórek, a świeże tkanki ludzkie lub próbki pacjentów nie były pobierane. Dlatego zgoda etyczna nie była wymagana w tym in vitro badaniu opartym na komórkach.
Uzyskiwanie i przewidywanie docelowych substancji shikoniny
Słowo kluczowe "shikonina" zostało wyszukane w bazie danych PubChem. Struktura SDF shikoniny została pobrana, a jej uproszczona notacja systemu wprowadzania linii molekularnych (SMILES) została uzyskana. Zgodnie z wymaganiami poszczególnych baz danych dotyczących docelowych substancji, potencjalne cele shikoniny zostały przewidziane i zebrane z baz danych PharmMapper, SwissTargetPrediction, HERB i SEA Search Server 3 marca 202610,11,12.
Uzyskiwanie docelowych substancji raka nerkowokomórkowego
Wykorzystując rak nerkowokomórkowy jako słowo kluczowe, ludzkie cele chorobowe zostały odzyskane z bazy danych Therapeutic Target Database (TTD), OMIM i GeneCards, przy czym gatunki były ograniczone do Homo sapiens i wynik znaczenia > 50. Początkowo uzyskano 1148 celów, a po skompletowaniu i usunięciu duplikatów, ostatecznie uzyskano 1087 unikalnych docelowych substancji związanych z rakiem nerkowokomórkowym13,14,15.
Identyfikacja docelowych substancji shikoniny na leczenie raka nerkowokomórkowego
Przewidywane cele genów shikoniny i cele raka nerkowokomórkowego zostały wprowadzone do Venny 2.1, narzędzia do analizy online. Przecinające się cele zostały zidentyfikowane poprzez analizę przenikania i zwizualizowano w diagramie Venna.
Ustanowienie sieci składnik-cel-choroba
Wykorzystując shikoninę jako punkt wyjścia badań, zintegrowaliśmy informacje o fizjologicznych powiązaniach między tymi kluczowymi celami a RCC i zbudowaliśmy molekularną sieć interakcji systemu "składnik-cel-choroba" przy użyciu oprogramowania do wizualizacji Cytoscape.
Konstrukcja sieci interakcji białkowych i uzyskanie docelowych substancji shikoniny w leczeniu raka nerkowokomórkowego
Baza danych interakcji białkowych STRING jest podstawowym narzędziem do budowy sieci interakcji białko-białko (PPI), które umożliwia wydobywanie i wizualizację relacji interakcji między białkami. W niniejszym badaniu, przecinające się cele między shikoniną a rakiem nerkowokomórkowym zostały przesłane do bazy danych STRING, z gatunkiem ustawionym na Homo sapiens w celu dalszego pobrania. Kliknij przycisk Kontynuuj na następnej stronie analizy. Na dole strony wyników analizy, w module Ustawienia ustalono minimalny wymagany wynik interakcji na wysoki poziom pewności 0,900. Jednocześnie ukryto niepowiązane białka i rozłączone węzły w sieci, aby uzyskać zoptymalizowaną mapę PPI wzajemnego mapowania. Dane zostały zapisane w formacie TSV i zaimportowane do oprogramowania Cytoscape. Dostosowano odpowiednie parametry, aby wielkość węzłów i odcień koloru odzwierciedlały odpowiednie wartości, a grubość krawędzi odzwierciedlały wynik wiązania. Utworzono mapę sieci PPI16,17.
Na podstawie wyżej wymienionej sieci PPI, dokładnie przesięrowano docelowych substancji. W module Aplikacje w Cytoscape otwarto wtyczkę cytohubba i kliknięto przycisk Oblicz, aby uruchomić program obliczeniowy. Z opcji Top 6 węzłów(ów) wybrano algorytm MCC, a następnie kliknięto przycisk Prześlij, aby zakończyć obliczenie. Przesiewowano sześć najważniejszych docelowych substancji w celu ulepszania i pobierania danych.
Analiza wzbogacenia GO i analiza ścieżek KEGG shikoniny w leczeniu raka nerkowokomórkowego
Do analizy wzbogacenia GO użyto bazy danych Metascape. W niniejszym badaniu, przecinające się cele shikoniny z rakiem nerkowokomórkowym zostały zaimportowane do bazy danych. Najpierw wybrano gatunek Homo sapiens (człowiek), a następnie wybrano tryb Analiza niestandardowa. Analizę wzbogacenia wykonano dla trzech wymiarów wzbogacenia funkcji GO: funkcji molekularnych, komponentów komórkowych i procesów biologicznych. Ustawiono próg wartości p na 0,01 i kliknięto przycisk analizy wzbogacenia, aby wykonać analizę za pomocą platformy microcredit, aby skonstruować wizualizację analizy wzbogacenia GO shikoniny w leczeniu raka nerkowokomórkowego18,19.
Za pomocą bazy danych KOBAS 3.0 przeprowadzono analizę wzbogacenia ścieżek sygnałowych KEGG dla przecinających się docelowych substancji między shikoniną a rakiem nerkowokomórkowym, a baza ta umożliwia adnotacje ścieżek i analizę statystyczną wzbogacenia genów. Przesiewowane przecinające się cele zostały zaimportowane do bazy danych KOBAS 3.0; źródło wybranego gatunku to H. sapiens</
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Uzyskiwanie i przewidywanie celów shikoniny
Za pomocą czterech wyżej wymienionych baz danych przewidziano potencjalne cele shikoniny, a po integracji i podsumowaniu zidentyfikowano 426 celów. Podsumowane cele zostały zdeduplikowanie, co dało 374 cele, jak pokazano na Rysunku 2A.
Uzyskiwanie celów raka nerkowokomórkowego
Po podsumowaniu danych związanych z trzema bazami danych uzyskano łącznie 1147 celów, a po podsumowa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
PIK3CA jest oficjalnie znane jako fosfoinozytydyloinositolo-4,5-bisfosforan 3-kinaza, podjednostka katalityczna alfa. PIK3CA, centralny komponent szlaku PI3K/AKT/mTOR, odgrywa istotną rolę w występowaniu, rozwoju i leczeniu raka nerczycowego (RCC). Badania wykazały, że PIK3CA jest genem o wysokiej częstości mutacji tego podtypu (6/57, 11%), a jego mutacja jest bezpośrednio związana z nieprawidłową aktywacją szlaku PI3K/AKT. Co więcej, pacjenci ci dobrze reagują na terapię składającą się z inhibitora punktu kontrolnego od...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnięcia.
Badania te zostały sfinansowane przez Wydział Zdrowia Prowincji Guizhou w dziedzinie nauki i technologii (gzwkj2024-516); Program Narodowy i Prowincjonalny ds. Upowszechniania Talentów w Zakresie Innowacji Naukowych i Technicznych Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Guizhou, Zespół Naukowiec-Innowator Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Guizhou TD Hopes [2023] 005; Prowincjonalne Fundacje Nauk Przyrodniczych Guizhou [numery grantów: ZK [2024] 404]; Kompleks białko-polisacharydowy oparty na charakterystyce długotrwałego krążenia Pickeringa w mleku w celu promowania leczenia bólów głowy przy użyciu Chuanxiong (82360779).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 786-O | American Type Culture Collection (ATCC) | RRID: CVCL_1051 (ATCC CRL-1932) | Komórki ludzkiego jasnokomórkowego raka nerczycy |
| Baza danych AlphaFold | European Molecular Biology Laboratory (EMBL) - EBI | AlphaFold Protein Structure Database | Baza danych predykcji struktury białka (AlphaFold Protein Structure Database) |
| Oprogramowanie AutoDock Tools | Scripps Research Institute | 1.5.7 | Oprogramowanie do dokowania molekularnego do predykcji wiązania ligand-białko |
| Caki-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | RRID: CVCL_0234 (ATCC HTB-46) | Komórki ludzkiego jasnokomórkowego raka nerczycy |
| Komórki Caki-1 | Mudanjiang Normal University | HTB-46 (RRID: CVCL_0234) | Komórki ludzkiego jasnokomórkowego raka nerczycy |
| Zestawy do wykrywania kaspazy 3 i kaspazy 8 | Credit Suisse Biotechnology Co Ltd (QUANZHOU, China) | Zestaw do badania aktywności kaspazy-3, nr kat. RX302848M, Zestaw do badania aktywności kaspazy-8, nr kat. RX302849M | Używane do wykrywania aktywności kaspazy w celu oceny apoptozy komórek |
| Oprogramowanie Cytoscape | Cytoscape Consortium | 3.9.1 | Używane do budowy i wizualizacji sieci biologicznych |
| Środowisko DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Środowisko kultury komórkowej dla kultury komórek Caki-1 i 786-O |
| Płodowy surowiczka bydlęca | Gbico | 10099-141 | Dodatek do kultury komórek dla wzrostu komórek Caki-1 i 786-O |
| GeneCards | Weizmann Institute of Science | https://www.genecards.org/ | Ogólna baza danych genów ludzkich do oznaczania genów docelowych |
| GraphPad Prism | GraphPad, San Diego, CA, USA | wersja 8.3.0 | Do budowy wykresów statystycznych |
| Baza danych HERB | Chinese Academy of Sciences | http://herb.ac.cn | Baza danych składników i celów medycyny tradycyjnej chińskiej |
| Oprogramowanie ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Fiji | Oprogramowanie do analizy obrazów w celu określenia morfologii komórek i ilości pasm w Western blot |
| Mikroskop inwertowany | Olympus, IX73, Japonia | Powiększenie 100× | Używane do obserwacji zmian morfologii komórek po leczeniu shikonin |
| Baza danych KOBAS 3.0 | Peking University | http://bioinfo.org/kobas/ | Narzędzie do analizy obowiązku genów i wzbogacania ścieżek |
| Baza danych Metascape | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | https://metascape.org/gp/index.html) | Narzędzie do wzbogacania funkcji genów i analizy sieci |
| Platforma Microcredit | National Center for Bioinformation (China) | http://www.bioinformatics.com.cn/ | Internetowa platforma analizy bioinformatycznej do przetwarzania danych |
| Zestaw do badania MTT | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (Pekin, Chiny) | nr kat. M8180 | Używane do wykrywania żywotności komórek (badanie antyproliferacyjne) |
| OMIM | Johns Hopkins University School of Medicine | https://www.omim.org/ | Online Mendelian Inheritance in Man (baza danych chorób genetycznych człowieka) |
| Baza danych PharmMapper | East China University of Science and Technology | https://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ | Baza danych przewidywania docelowych leków małocząsteczkowych |
| PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD i PTPN11 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA) | Pierwotne przeciwciała do analizy Western blot białek docelowych |
| Oprogramowanie PyMol | Schrödinger, Inc. | 2.2.0 | Oprogramowanie do wizualizacji molekularnej do analizy struktury białka |
| Baza danych białek RCSB | RCSB Protein Data Bank (Rutgers University) | https://www.rcsb.org/ | Baza danych struktur białek (PDB) do modelowania molekularnego |
| Baza danych SEA Search Server | University of California, San Francisco | https://sea.bkslab.org | Podobne podejście do predykcji docelowej |
| Shikonin (czystość 98% | rośliny liściaste pochodzące z Chin | Y0001439 | Związek małocząsteczkowy stosowany w niniejszym badaniu w leczeniu raka nerczycy (RCC) |
| SPSS | IBM, Armonk, NY, USA | wersja 20.0 | Do analizy statystycznej |
| STRING | European Molecular Biology Laboratory (EMBL) | https://stringdb.org/ | Baza danych sieci interakcji białko-białko |
| Baza danych SwissTargetPrediction | Swiss Institute of Bioinformatics | https://www.swisstargetprediction.ch/ | Narzędzie do przewidywania docelowych małocząsteczkowych w kierunku odkrywania leków |
| Baza danych Therapeutic Target Database | Shanghai Institute of Materia Medica | https://ttd.idrbrab.cn | Baza danych dotycząca docelowych terapii i leków |
| Venny 2.1 | Spanish National Center for Biotechnology (CNB-CSIC) | https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html) | Narzędzie do analizy przecięcia danych za pomocą diagramów Venna |