Analiza bioinformatyczna obejmująca wszystkie nowotwory w połączeniu z weryfikacją eksperymentalną raka jelita grubego: Badanie nad TMED3 jako biomarkerem diagnostycznym i prognostycznym

Podsumowanie

Ten protokół łączy ogólnorakowe analizy bioinformatyczne z walidacją immunochemiczną w raku jelita grubego w celu oceny ekspresji Transmembrane Emp24 Protein Transport Domain 3, znaczenia prognostycznego, skojarzeń immunologicznych i powiązanych ścieżek biologicznych z wykorzystaniem publicznych baz multiomicznych i klinicznych próbek tkankowych.

Streszczenie

Transmembrane Emp24 Protein Transport Domain 3 (TMED3), należący do rodziny białek p24, został zaangażowany w proliferację, inwazję i migrację nowotworową. Badanie to miało na celu ocenę wzorców ekspresji, znaczenia prognostycznego, powiązań immunologicznych i potencjalnych funkcji biologicznych TMED3 w wielu typach raka, stosując pan-rakowe analizy bioinformatyczne w połączeniu z walidacją immunochemiczną (IHC) w raku jelita grubego. Analizowano zestawy danych z The Cancer Genome Atlas, Genotype-Tissue Expression, UALCAN, Human Protein Atlas i cBioPortal w celu zbadania ekspresji TMED3 i zmian genetycznych w pan-raku. Immunohistochemia została przeprowadzona w celu oceny ekspresji białka TMED3 w tkankach raka jelita grubego. Analiza przeżycia Kaplana-Meiera i regresja Coxa zostały wykorzystane do oceny wartości prognostycznej TMED3. Analiza korelacji Spearmana została przeprowadzona w celu oceny powiązań TMED3 z obciążeniem mutacyjnym guza, niestabilnością mikrosatelitarną (MSI), infiltracją komórek immunologicznych i punktami kontrolnymi układu odpornościowego. Analiza wzbogacania zestawów genów została przeprowadzona w celu zbadania potencjalnych ścieżek biologicznych związanych z TMED3 w raku jelita grubego. Ekspresja TMED3 była podwyższona w większości typów guzów i była związana z niekorzystnym przeżyciem ogólnym i przeżyciem specyficznym dla choroby w rakie gruczołu nadnerczy, raku gruczolakowatym jelita grubego i czerniaka tęczówki. Największą częstość zmian genetycznych TMED3 stwierdzono w międzybłoniaku, przy czym amplifikacja była dominującym typem zmiany. Ponadto, ekspresja TMED3 wykazywała istotne korelacje z obciążeniem mutacyjnym guza i niestabilnością mikrosatelitarną w rakie nerki, raku gruczolakowatym żołądka i raku endometrioidalnym ciała macicy. Ekspresja TMED3 była również związana z infiltracją immunologiczną i ekspresją punktów kontrolnych układu odpornościowego w kilku guzach. Analiza IHC wykazała zwiększoną ekspresję TMED3 w tkankach raka jelita grubego w porównaniu z normalnymi tkankami jelita grubego i wykazała związek z etapem T. Analiza wzbogacania funkcjonalnego wykazała ścieżki związane z rybosomalnym przetwarzaniem i prezentacją antygenów, fosforylacją oksydacyjną i cyklem pentozowopirogronowym. Te wyniki wskazują, że TMED3 może reprezentować obiecujący biomarker dla diagnozy i oceny rokowania raka jelita grubego, jak również innych typów guzów.

Wprowadzenie

Rodzina białek Transmembrane Emp24 Domain (TMED) składa się z czterech podrodzin (α, β, γ i δ), które zwykle występują jako monomery, dimer czy oligomeryczne kompleksy w komórkach eukariotycznych. Członkowie rodziny TMED są zaangażowani w wewnątrzkomórkowy transport wezykul i byli implikowani w różnorodnych chorobach człowieka, w tym w raka, choroby immunologiczne, cukrzycę, choroby neurodegeneracyjne, stłuszczenie wątroby, rozstrzenieniową kardiomiopatię, chorobę nerek związaną z mucyną 1 (MKD) oraz zespół Sjögrena (SS)¹. Transbłonowy białko zawierający domenę emp24 typu 3 (TMED3), należący do rodziny białek p24, jest wysoce konserwowanym białkiem transbłonowym typu I z jednym przejściem kodowanym na chromosomie 15q25.1 u ludzi^2,3. Rosnące dowody wskazują, że TMED3 jest nieprawidłowo ekspresowane w kilku nowotworach i jest zaangażowane w inicjację, proliferację, inwazję, przerzuty oraz progresję nowotworową. Podwyższona ekspresja TMED3 została zgłoszona w kostniakomięsaku⁴, raku łuszczycowokomórkowym płuc⁵, raku piersi⁶, raku trzonu macicy⁷ i raku jelita grubego⁸. Badania eksperymentalne wykazały, że hamowanie ekspresji TMED3 hamują proliferację komórek nowotworowych, zdolność przerzutotwórczą i aktywność anty-apoptotyczną, ograniczając tym samym progresję nowotworową. W gliomach nadekspresja TMED3 została związana z wyższym stopniem nowotworu i gorszym rokowaniem, a TMED3 miało promować progresję glioblastoma poprzez regulację ZBTB7A⁹. Chociaż poprzednie badania eksplorowały biologiczną rolę TMED3 w określonych typach nowotworów, jego wzorce ekspresji, znaczenie prognostyczne i funkcje molekularne w całym spektrum nowotworów nie zostały jeszcze systematycznie scharakteryzowane.

Ostatnie osiągnięcia w bazach danych multiomicznych i analizie bioinformatycznej umożliwiły systematyczną ocenę ekspresji genów, rokowania, cech immunologicznych i zmian molekularnych w różnych typach nowotworów. W porównaniu z badaniami jednokohortowymi, zintegrowana analiza pan-rakowa za pomocą publicznie dostępnych baz danych zapewnia szersze podejście do identyfikacji potencjalnych biomarkerów i docelowych terapii w nowotworach. W niniejszym badaniu przeprowadzono kompleksowe analizy bioinformatyczne, aby zbadać rolę TMED3 w wielu typach nowotworów przy użyciu publicznie dostępnych baz danych multiomicznych, w tym The Cancer Genome Atlas (TCGA), Genotype-Tissue Expression (GTEx), UALCAN, Human Protein Atlas i cBioPortal. Badanie systematycznie oceniło wzorce ekspresji TMED3, cechy klinikopatomorfologiczne, znaczenie prognostyczne, skojarzenia immunologiczne oraz potencjalne funkcje biologiczne w pan-rakowie. Ponadto przeprowadzono analizę immunochemiczną (IHC) w tkankach raka jelita grubego, aby zweryfikować ekspresję białka TMED3 i jego związek z cechami klinikopatomorfologicznymi. Nasza analiza pan-rakowa służy jako strategia przesiewowa do identyfikacji kandydatów na biomarkery. Następnie przeprowadzono walidację eksperymentalną specyficznie w raku jelita grubego (CRC). Wyniki wykazują, że TMED3 jest obiecującym biomarkerem prognostycznym w CRC, choć jego znaczenie dla innych rodzajów nowotworów wymaga dalszych badań.

Protokół

Wszystkie procedury związane z tkankami ludzkimi były wykonywane zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego i etyki oraz w środowisku zatwierdzonej komory bezpieczeństwa biologicznego. Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet Etyki Badań Tangshan Central Hospital (nr. TZYL/K/2023-16), a pisemna zgoda świadoma została uzyskana od wszystkich uczestników przed pobraniem próbek.

Zbieranie danych
Dane dotyczące profilu ekspresji TMED3 z różnych tkanek nowotworowych i niesparowanych tkanek normalnych zostały uzyskane z baz danych TCGA i GTEx^10,11 (TCGA: https://portal.gdc.cancer.gov/; GTEx: https://gtexportal.org/; dostęp 1 lipca 2025). Przeprowadzono testy Wilcoxon rank-sum w celu analizy różnicowej ekspresji TMED3 między tkankami nowotworowymi i niesparowanymi tkankami normalnymi. Macierze ekspresji sekwencjonowania RNA znormalizowane na transkrypt na milion (TPM) pobrane z UCSC Xena zostały wykorzystane do dalszych analiz. Wartości ekspresji zostały zharmonizowane za pomocą transformacji log₂(TPM + 1) przed analizą statystyczną. Dane dotyczące ekspresji TMED3 dla 33 rodzajów nowotworów i dopasowanych tkanek normalnych zostały następnie pobrane z bazy danych TCGA. Testy Wilcoxon signed-rank zostały zastosowane do oceny różnicowej ekspresji TMED3 między nowotworami i dopasowanymi tkankami normalnymi. Różnicowa ekspresja białka TMED3 między tkankami nowotworowymi i normalnymi została uzyskana z bazy danych UALCAN¹² (http://ualcan.path.uab.edu; dostęp 1 lipca 2025). Dostęp do modułu analizy proteomiki został uzyskany, a opcja „Pan-cancer View” została wybrana do analizy. Analizy ekspresji białek zostały przeprowadzone za pomocą zestawów danych CPTAC dostępnych w module UALCAN „Pan-cancer View” z domyślnymi ustawieniami platformy i bez dodatkowego filtrowania próbek.

Analiza cech klinikopatomorfologicznych
Informacje klinikopatomorfologiczne z 33 rodzajów nowotworów w bazie danych TCGA zostały zebrane w celu zbadania związku między ekspresją TMED3 a stopniem patologicznym. Fazy nowotworowe zostały podzielone na grupy wczesnej fazy (I-II) i zaawansowanej fazy (III-IV). Różnice w ekspresji TMED3 między grupami fazowymi zostały oceniane za pomocą testów Wilcoxon rank-sum w różnych typach raka.

Analiza prognostyczna
Czas przeżycia i status przeżycia dla 33 rodzajów nowotworów zostały uzyskane do analizy prognostycznej. Przypadki normalne i przypadki bez informacji klinicznych zostały wyłączone. Wartości brakujące zostały obsłużone zgodnie z brakami każdej zmiennej. Ekspresja TMED3 została podzielona na grupy o wysokiej i niskiej ekspresji według mediany wartości ekspresji. Pakiet survival (wersja 3.2-7) w oprogramowaniu do analizy statystycznej R (wersja 4.2.1) został użyty do przeprowadzenia regresji proporcjonalnych hazardów Cox. Wyniki zostały zwizualizowane za pomocą pakietów survminer i ggplot2. Przeżycie ogólne (OS) zostało zdefiniowane jako przedział od rozpoznania do śmierci z dowolnej przyczyny, podczas gdy przeżycie specyficzne dla choroby (DSS) zostało zdefiniowane jako przedział od rozpoznania do śmierci spowodowane konkretnym rakiem, przy czym zgony niezwiązane z nowotworem były traktowane jako zdarzenia ocenzurowane. Następnie przeprowadzono analizy przeżycia Kaplana-Meiera w celu oceny związków między ekspresją TMED3 a OS i DSS w raku okrężnicy (COAD).

Analiza mutacji
Baza danych cBioPortal (www.cbioportal.org; dostęp 5 lipca 2025) została wykorzystana do analizy częstości genetycznych zmian TMED3 w 33 rodzajach raka¹³. Dostęp do strony cBioPortal został uzyskany, a „TMED3” zostało wprowadzone do szybkiego pola wyszukiwania w celu analizy profilu mutacji TMED3 w wielu typach raka. Genetyczne zmiany TMED3 obejmowały głównie mutację, amplifikację, głęboką delecję i wielokrotne zmiany. Do analizy mutacji użyto domyślne badania pan-rakowe i ustawienia zapytań dostępne w cBioPortal bez dodatkowego filtrowania.

Analiza korelacji metylacji DNA
Analiza metylacji DNA została przeprowadzona w celu oceny statusu metylacji promotora TMED3 w tkankach nowotworowych i normalnych za pomocą bazy danych UALCAN (https://ualcan.path.uab.edu/; dostęp 5 lipca 2025). Status metylacji DNA regionu promotora TMED3 został przeanalizowany za pomocą danych metylacji poziomu 3 wygenerowanych z platformy Illumina Infinium HumanMethylation450K w TCGA. Poziomy metylacji były wyrażane jako wartości β, obliczane jako β = intensywność sondy metylowanej / (intensywność sondy metylowanej + intensywność sondy niemetylowanej), ze wartościami od 0 (niemetylowane) do 1 (w pełni metylowane). Sondy CpG znajdujące się w promieniu 1500 bp przed punktem startu transkrypcji (TSS), w tym regiony TSS200 i TSS1500 zdefiniowane przez UALCAN, zostały przeanalizowane w celu oceny statusu metylacji promotora. UALCAN automatycznie wyodrębnił wszystkie dostępne sondy CpG w regionie promotora docelowego genu bez dodatkowego filtrowania. Wartości metylacji β z pan-raka i tkanek normalnych zostały uzys

Wyniki

Analiza ekspresji TMED3 w pan-raku
Analiza zestawów danych TCGA i GTEx wykazała, że ekspresja kwasu rybonukleinowego (mRNA) TMED3 była znacząco podwyższona w większości tkanek nowotworowych w porównaniu z odpowiadającymi im normalnymi tkankami, w tym rak kora nadnerczy (ACC), rak moczowodowy (BLCA), rak piersi inwazyjny (BRCA), rak komórkowo-płaskonabłonkowy szyjki macicy i rak gruczołowy szyjki macicy (CESC), rak dróg żółciowych (CHOL), rak okrężnicy (COAD), rozlane duże limfomy B-komórkowe (DLBC), rak przełyku (ESCA), glejak wielowkomorowy (GBM), rak nerki jasnokomórkowy (KIRC), rak nerki brodawkowatej (KIRP), guz mózgu niskiego stopnia (LGG), rak wątrobowokomórkowy (LIHC), rak płuca gruzkokomórkowego (LUAD), rak płuca płaskonabłonkowego (LUSC), rak jajnika gruczołowo-torebkowego (OV), rak trzustki (PAAD), chromosomocytoma i paraganglioma (PCPG), rak prostaty (PRAD), rak odbytnicy (READ), czerniak skóry (SKCM), rak żołądka (STAD), nowotwory zarodkowe jąder (TGCT), rak tarczycy (THCA), tymoma (THYM), rak trzonu macicy (UCEC) i rak mieszany macicy (UCS), podczas gdy zmniejszona ekspresja została zaobserwowana w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi (HNSC) i ostrym białaczce szpiku (LAML) (Rysunek 1A). Do analizy ekspresji sparowanych służyły dopasowane sąsiednie normalne tkanki jako kontrole. Parzysta analiza TCGA dodatkowo potwierdziła znacząco zwiększoną ekspresję TMED3 w tkankach BLCA, BRCA, CHOL, COAD, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, STAD i UCEC w porównaniu z parzystymi tkankami normalnymi (Rysunek 1B). Ponadto, analiza ekspresji białek przy użyciu bazy danych UALCAN/Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) wykazała zwiększoną ekspresję białka TMED3 w tkankach nowotworowych BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OV i UCEC, podczas gdy zmniejszona ekspresja białka obserwowano w PAAD w porównaniu z tkankami normalnymi (Rysunek 1C). Jednakże ekspresja białka TMED3 była niższa w PAAD niż w tkankach normalnych. Ta różnica między ekspresją mRNA i białka może odzwierciedlać mechanizmy regulacji pozatranskrypcyjnych lub pozatranslacyjnych. Te wyniki sugerują, że TMED3 jest nieprawidłowo nadekspresowany w wielu rakach i może być związany z cechami diagnostycznymi i prognostycznymi w wielu rakach.

Rysunek 1. Profile ekspresji TMED3 w różnych rakach człowieka. (A) Różnicowa ekspresja mRNA TMED3 między tkankami nowotworowymi a normalnymi w wielu typach raka na podstawie zestawów danych TCGA i GTEx. Poziomy ekspresji są przedstawione jako log₂(TPM + 1). (B) Parzysta analiza ekspresji mRNA TMED3 między tkankami nowotworowymi a dopasowanymi sąsiednimi tkankami normalnymi z zestawów danych TCGA. (C) Różnicowa ekspresja białka TMED3 między tkankami normalnymi a głównymi guzami w zestawach danych CPTAC/UALCAN, w tym rak piersi inwazyjny (BRCA), rak okrężnicy (COAD), glejak wielowkomorowy (GBM), rak nerki jasnokomórkowy (KIRC), rak wątrobowokomórkowy (LIHC), rak płuca gruzkokomórkowego (LUAD), rak płuca płaskonabłonkowego (LUSC), rak jajnika gruczołowo-torebkowego (OV), rak trzustki (PAAD) i rak trzonu macicy (UCEC). Dane są przedstawione jako wykresy pudełkowe. Statystyczne znaczenie analizowano za pomocą testów Wilcoxona rangowo-sumowego lub Wilcoxona podpisanego rangowo, w stosownej kolejności. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; ns, bez znaczenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza cech klinikopatomorfologicznych
Analiza stadiów klinicznych wykazała, że ekspresja TMED3 była znacząco wyższa w nowotworach zaawansowanych (III-IV) w porównaniu z nowotworami we wczesnym stadiach (I-II) w ACC, KIRC, KIRP i LUAD (Rysunek 2). W przeciwieństwie do tego, ekspresja TMED3 była znacząco zmniejszona w zaawansowanych tkankach UCEC. Te wyniki sugerują, że podwyższona ekspresja TMED3 może być związana z progresją nowotworową w kilku typach raka.

Rysunek 2. Związek między ekspresją TMED3 a etapem patologicznym w wielu rakie. Wykresy smyczkowe przedstawiające poziomy ekspresji mRNA TMED3 w nowotworach wczesnego stadium (I-II) i nowotworach zaawansowanego stadium (III-IV) w raku kory nadnerczy (ACC), raku nerki jasno

Dyskusja

Białka TMED są wysoce konserwatywnymi białkami zawierającymi domenę emp24, które występują jako monomery lub dimer w komórkach eukariotycznych²⁰. Członkowie rodziny TMED są białkami przebłonowymi typu I, które uczestniczą w transporcie białek za pośrednictwem pęcherzyków i transporcie wewnątrzkomórkowym²⁰. Rodzina białek p24 obejmuje 10 członków TMED, w tym TMED3. Rosnące dowody wykazały, że TMED3 jest nieprawidłowo ekspresowane w kilku nowotworach złośliwych, takich jak rak trzonu macicy, rak kostny, rak jasnokomórkowy, rak wątrobowokomórkowy, rak prostaty i rak piersi^4,6,21,22,23. Podwyższona ekspresja TMED3 była również łączona z niekorzystnym rokowaniem w wielu typach nowotworów^3,5,17,18,19. W raku płaskonabłonkowym płuc wykazano, że TMED3 ułatwia progresję nowotworową poprzez regulację ezryn, podczas gdy wyciszenie TMED3 hamowało proliferację komórek, tworzenie kolonii, migrację i dysregulację białek związanych z apoptozą⁵. Łącznie, te badania wskazują, że TMED3 jest ściśle zaangażowany w rozwój i progresję raka; jednak jego funkcje biologiczne i mechanizmy molekularne w różnych nowotworach pozostają do pełnego wyjaśnienia.

W niniejszym badaniu, wiele publicznych baz danych zostało zintegrowanych w celu kompleksowej oceny wzorców ekspresji, znaczenia prognostycznego, cech immunologicznych i potencjalnych funkcji biologicznych TMED3 w różnych nowotworach. Ekspresja TMED3 była znacząco zwiększona w 26 typach nowotworów, a te wyniki zostały dodatkowo potwierdzone za pomocą analizy tkanek nowotworowych i sąsiednich normalnych w kilku nowotworach. Zgodnie z tym, dane CPTAC wykazały podwyższoną ekspresję białka TMED3 w BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OV i UCEC. Co ciekawe, chociaż ekspresja mRNA TMED3 była podwyższona w tkankach PAAD, zmniejszona ekspresja białka została zaobserwowana w bazie danych UALCAN, sugerując, że regulacja post-transkrypcyjna, degradacja białka lub modyfikacje potranslacyjne mogą przyczyniać się do tego rozbieżności. Poprzednie badania wykazały, że przewlekła ekspresja TMED3 w komórkach raka piersi promuje akumulację β-kateniny i Axin-2 zarówno w cytoplazmie, jak i jądrze komórek MCF-7 i zwiększa ekspresję genów docelowych Wnt/β-kateniny, w tym c-myc, MMP7 i TCF4, ułatwiając w ten sposób proliferację, migrację i inwazję komórek nowotworowych²⁴. Podobnie, TMED3 zostało zgłoszone jako zwiększone w raku płuc nieziarniczych, a wyciszenie TMED3 hamuje proliferację i zdolność inwazyjną komórek nowotworowych²⁵. W obecnym badaniu analizy klinikopatomorfologiczne wykazały, że ekspresja TMED3 była podwyższona w zaawansowanych stadiach ACC, KIRC, KIRP i LUAD, podczas gdy niższa ekspresja została zaobserwowana w zaawansowanych stadiach UCEC, co wskazuje na możliwe, specyficzne dla nowotworu, funkcje biologiczne TMED3 podczas progresji raka. Analizy przeżycia wykazały ponadto istotne powiązania między wysoką ekspresją TMED3 a niekorzystnym przeżyciem ogólnym i przeżyciem bez choroby w ACC, COAD i UVM, co wspiera potencjalną wartość prognostyczną TMED3 w wielu nowotworach złośliwych. Ponadto, analiza metylacji promotora wykazała zwiększone poziomy metylacji TMED3 w BRCA, COAD, ESCA, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, PAAD i PRAD, podczas gdy zmniejszone poziomy metylacji zostały zidentyfikowane w BLCA, TGCT i UCEC. Te wyniki wskazują, że nieprawidłowa metylacja promotora może przyczyniać się do dysregulacji ekspresji TMED3 w sposób zależny od nowotworu i może uczestniczyć w rozwoju raka.

MSI reprezentuje odrębny podtyp molekularny raka, który jest często związany z lepszą odpowiedzią na immunoterapię, ponieważ te guzy zwykle wykazują podwyższone obciążenie mutacyjne i zwiększoną ekspresję PD-L1^26,27. Guzy o wysokiej TMB mogą generować liczne nowe antygeny pochodzące z mutacji somatycznych, zwiększając tym samym aktywność immunologiczną przeciwnowotworową komórek T i potencjalnie zwiększając wrażliwość na blokadę punktów kontrolnych odpowiedzi immunologicznej^28,29. W niniejszym badaniu, ekspresja TMED3 wykazywała dodatnie korelacje zarówno z TMB, jak i MSI w KIRC, STAD i UCEC, co wskazuje, że TMED3 może być związany z immunogenicznością nowotworową i odpowiedzią na immunoterapię w tych typach raka. Rosnące dowody wykazały, że mikrośrodowisko nowotworowe, szczególnie komponenty odpornościowe i stromowe, odgrywa krytyczną rolę w progresji raka, odpowiedzi terapeutycznej, nawrocie i rokowaniu pacjentów. Algorytm ESTIMATE oblicza

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0.5% Ammonia Solution	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1336-21-6	N/A
1% Acid Alcohol	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
10% Neutral Buffered Formalin	Wuhan Huntz Biotechnology Co., Ltd	H-H8060	N/A
100% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
70% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
80% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
95% Ethanol	Shandong Lirun Medical Technology Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
Alcian Blue Stain	Baso Diagnostics Inc., Zhuhai	BA4121	N/A
cBioPortal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center	N/A	SCR_014555
Citrate-Based Antigen Retrieval Buffer	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9640-CN	N/A
clusterProfiler package	Bioconductor	N/A	SCR_016884
DESeq2 package	Bioconductor	N/A	SCR_015687
Diaminobenzidine Tetrahydrochloride Hydrate	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
ESTIMATE package	R package	Version 1.0.13	N/A
GSCALite platform	GSCALite	N/A	N/A
GTEx database	GTEx Consortium	N/A	SCR_013042
Hematoxylin	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
Hydrogen Peroxide	OriGene Technologies, Inc	PV-6000D	N/A
Kaplan–Meier Survival Analysis	survival R package	Version 3.2-7	SCR_021137
KEGG Gene Sets	MSigDB	Version 7.5.1	SCR_016863
Light Microscope	Zeiss Technology (Suzhou) Co., Ltd	N/A	N/A
Paraffin Embedding Medium	PATHO-Reagent Department of YL Company	CAS:8002-74-2	N/A
Polymer-Based Detection System	Leica Biosystems Newcastle Ltd	PV-6000	N/A
R statistical analysis software	R Foundation for Statistical Computing	Version 4.2.1	SCR_001905
Secondary Rabbit Anti-Mouse IgG	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
TCGA database	National Cancer Institute	N/A	SCR_003193
TMED3 Primary Antibody	CUSABIO Technology, Houston, USA	CSB-PA897107LA01HU	N/A
Tris-Buffered Saline (TBS)	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9590-CN	N/A
UALCAN database	UALCAN	N/A	SCR_015827
Wilcoxon Statistical Analysis	stats R package	N/A	SCR_003005
Xylene	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1330-20-7	N/A