Generowanie aneuploidalnych ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z pierwotnych komórek płynu owodniowego poprzez elektroporację plazmidów episomalnych

Zifan Song; Jing Wang; Peng Yuan; Xiaohui Zhu; Liying Yan; Jianying Guo

doi:10.3791/71975

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie aneuploidalnych ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z pierwotnych komórek płynu owodniowego poprzez elektroporację plazmidów episomalnych

110 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71975

⸱

3 września 2026

Zifan Song¹^,²^,³^,⁴ , Jing Wang¹^,²^,³^,⁴ , Peng Yuan¹^,²^,³^,⁴ , Xiaohui Zhu¹^,²^,³^,⁴ , Liying Yan¹^,²^,³^,⁴ , Jianying Guo¹^,²^,³^,⁴

¹State Key Laboratory of Female Fertility Promotion, Center for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, ²National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, ³Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), Ministry of Education, ⁴Beijing Key Laboratory of Collaborative Innovation in Frontier Technologies for Population Quality

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół przedstawia powtarzalną metodę generowania wolnych od integracji aneuploidalnych ludzkich iPSC z pierwotnych komórek płynu owodniowego z wykorzystaniem elektroporacji plazmidów episomalnych. Optymalizuje on warunki dostarczania i hodowli w celu stabilizacji nieprawidłowości chromosomowych, oferując praktyczną platformę do tworzenia specyficznych dla danej choroby modeli do dalszych badań i zastosowań klinicznych.

Streszczenie

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) specyficznych dla pacjenta z komórek płynu owodniowego (AFCs) wykazujących określone aneuploidie chromosomalne stanowi potężną platformę do modelowania zaburzeń genetycznych. Jednakże ustanowienie niezawodnego i powtarzalnego procesu przeprogramowania aneuploidnych AFCs pozostaje wyzwaniem technicznym ze względu na wewnętrzną niestabilność genomową i zmienną zdolność proliferacyjną tych komórek. W niniejszej pracy przedstawiamy kompleksową, nieintegrującą metodę generowania aneuploidnych ludzkich iPSCs z pierwotnych AFCs z wykorzystaniem elektroporacji plazmidów episomalnych. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje cały przebieg prac, obejmujący rozmrażanie i ekspansję komórek z zastosowaniem strategii stopniowej adaptacji pożywki, zoptymalizowane dostarczanie plazmidów poprzez system elektroporacji, sekwencyjną hodowlę po elektroporacji z wymianą pożywek ukierunkowaną na przejście mezenchymalno-nabłonkowe (MET) oraz mechaniczne wyizolowanie kolonii na podstawie określonych kryteriów morfologicznych. Opisujemy również procedury walidacyjne, w tym barwienie immunofluorescencyjne na kluczowe markery pluripotencji, analizę kariotypu metodą prążkowania G w celu potwierdzenia zachowania kariotypu aneuploidnego oraz weryfikację usunięcia wektora episomalnego za pomocą metody PCR. Ten protokół, niewymagający obecności komórek feeder oraz nieprowadzący do integracji z genomem, pozwala na uzyskanie linii aneuploidnych iPSCs odpowiednich do modelowania chorób, przesiewania leków oraz badań nad biologią chromosomów.

Wprowadzenie

Pojawienie się technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przekształciło medycynę regeneracyjną, modelowanie chorób oraz odkrywanie leków, umożliwiając generowanie pluripotencjalnych komórek specyficznych dla pacjenta bez obaw etycznych związanych z ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi (hESCs). Konceptualne podstawy przeprogramowania komórkowego wywodzą się z demonstracji transferu jąder komórek somatycznych przeprowadzonej przez Gurdona¹, a następnie z ustanowienia embrionalnych komórek macierzystych²^,³^,⁴ i ostatecznie z opracowania indukowanej pluripotencji⁵poprzez ektopową ekspresję OCT4, SOX2, KLF4 i c-MYC. Od tego czasu technologia iPSC stała się niezbędną platformą do badania rozwoju człowieka, zaburzeń genetycznych i medycyny precyzyjnej. Wczesne metody przeprogramowania wykorzystywały wektory retrowirusowe lub lentiwirusowe, jednak ryzyko związane z ich integracją ograniczało zastosowanie kliniczne. W związku z tym priorytetem dla translacji klinicznej stało się opracowanie metod przeprogramowania bezintegracyjnych. Należą do nich zastosowanie wirusa Sendai⁶, syntetycznego mRNA⁷, wektorów episomalnych opartych na mechanizmie oriP/EBNA1 (białko jądrowe wirusa Epsteina-Barra 1)⁸ oraz przeprogramowanie chemiczne⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹² z wykorzystaniem wyłącznie związków małocząsteczkowych.

Aneuploidia jest główną przyczyną poronień oraz wrodzonych wad rozwojowych u ludzi. Zrozumienie komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw nieprawidłowości rozwojowych związanych z aneuploidią wymaga odpowiednich modeli komórkowych, które wiernie odtwarzają tło genetyczne tych stanów. Komórki płynu owodniowego (AFCs) stanowią atrakcyjny i wydajny materiał wyjściowy do generowania iPSC specyficznych dla pacjenta¹³^,¹⁴^,¹⁵, szczególnie w kontekście prenatalnie zdiagnozowanych zaburzeń genetycznych¹⁶^,¹⁷. Pozostałości płynu owodniowego pobranego podczas rutynowej amniocentezy umożliwiają dostęp do komórek pochodzenia płodowego bez konieczności przeprowadzania dodatkowej inwazyjnej biopsji tkanek po urodzeniu. W porównaniu z dorosłymi komórkami somatycznymi, AFCs wykazują zazwyczaj wyższą zdolność do proliferacji, dłuższe telomery, mniejsze skumulowane obciążenie mutacjami środowiskowymi oraz większą plastyczność rozwojową, co w połączeniu ułatwia przeprogramowanie komórkowe¹⁸^,¹⁹. Co istotne, AFCs wiernie zachowują konstytucję chromosomową rozwijającego się płodu, co czyni je idealnym źródłem do tworzenia specyficznych dla danej choroby modeli iPSC nieprawidłowości chromosomowych, w tym trisomii 21²⁰, trisomii 18²¹, zespołu Turnera oraz zespołu Klinefeltera²².

Niniejszy protokół stanowi kompleksowy przewodnik po generowaniu wolnych od integracji iPSC z aneuploidalnych komórek płynu owodniowego z wykorzystaniem wektorów episomalnych. Metoda obejmuje szczegółowe procedury izolacji komórek, przeprogramowania, selekcji klonów oraz charakterystyki. W porównaniu z innymi metodami przeprogramowania bez integracji, system plazmidów episomalnych zapewnia praktyczną równowagę między bezpieczeństwem genomowym, prostotą techniczną a efektywnością kosztową, co czyni go szczególnie odpowiednim do rutynowego użytku laboratoryjnego i zastosowań w szerokiej skali biobankowania. Protokół ma zastosowanie zarówno do kriokonserwowanych AFC pochodzących z uznanych biobanków, jak i świeżych pozostałości próbek płynu owodniowego pobranych podczas rutynowej diagnostyki prenatalnej. Chociaż raportowana wydajność przeprogramowania episomalnego dla AFC jest stosunkowo niska, a podczas przeprogramowania lub przedłużonej hodowli może dojść do spontanicznego ratowania chromosomów, szczególnie w przypadku niektórych aneuploidii, opisany schemat pracy znajduje bezpośrednie zastosowanie w tworzeniu biobanków iPSC specyficznych dla konkretnych chorób, badaniach biologii chromosomów i wczesnego rozwoju ludzkiego oraz w późniejszym różnicowaniu do specyficznych linii komórkowych. Podejście to jest szczególnie odpowiednie do generowania wolnych od integracji, klinicznie istotnych linii iPSC z próbek prenatalnych na potrzeby modelowania chorób i badań mechanistycznych nad nieprawidłowościami chromosomalnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z wykorzystaniem próbek ludzkiego płynu owodniowego zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i zostały zatwierdzone przez Radę Przeglądu Instytucjonalnego (IRB)/Komitet Etyki Badań nad Ludźmi w Trzecim Szpitalu Uniwersytetu Pekińskiego (Protokół nr M2023406). Próbki aneuploidalne pozyskano z Biobanku Centrum Medycyny Reprodukcyjnej w Trzecim Szpitalu Uniwersytetu Pekińskiego, który jest certyfikowanym państwowym repozytorium klinicznym specjalizującym się w zasobach rozwojowych i reprodukcyjnych człowieka. Materiał ten składa się z pozostałości płynu owodniowego pobranego pierwotnie podczas rutynowej amniocentezy w celu klinicznej diagnostyki prenatalnej, który w przeciwnym razie zostałby zutylizowany. Przed pobraniem od wszystkich dawców uzyskano pisemną świadomą zgodę, wyraźnie zezwalającą na przechowywanie pozostałych próbek w Biobanku oraz ich późniejsze wykorzystanie w badaniach. Wszystkie próbki zostały rygorystycznie zanonimizowane w celu ochrony prywatności pacjentów. Do indukcji iPSC wybrano próbki z potwierdzonymi aneuploidalnymi kariotypami zidentyfikowanymi w drodze klinicznej analizy prążkowania G, w tym Trisomię 21 (zespół Downa, N = 2), Trisomię 18 (zespół Edwardsa, N = 1), Monosomię X (zespół Turnera, N = 1) oraz zespół Klinefeltera (N = 2). Szczegółowe informacje na temat aneuploidalnych linii komórkowych użytych w przeprogramowaniu podsumowano w Tabeli 1.

1. Rozmrażanie i hodowla pierwotna komórek z płynu owodniowego pochodzących z biobanku

UWAGA: W tej sekcji szczegółowo opisano zestandaryzowaną procedurę pobierania i odzyskiwania aneuploidalnych AFC z biobanku. Hodowane komórki są namnażane w celu uzyskania populacji wystarczających do późniejszego przeprogramowania episomalnego.

Zestandaryzowana procedura rozmrażania
1. Równoważenie pożywek: Podgrzać kompletną pożywkę AmnioType-1 do 37 °C przed użyciem.
2. Pobieranie próbek: Należy pobrać z przechowywania w ciekłym azocie krio probówkę zawierającą około 300 000 krio-konserwowanych komórek AFC w medium do zamrażania komórek. Probówkę należy niezwłocznie przenieść do laboratorium w suchym lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu rozmrożeniu.
3. Szybkie rozmrażanie: zanurz dolną połowę probówki kriogenicznej w 37 °C umieścić w łaźni wodnej i delikatnie mieszać. Przerwać proces rozmrażania, gdy pozostanie jedynie mały, widoczny kryształ lodu.
  UWAGA: Należy unikać całkowitego rozmrożenia. Zapobiega to narażeniu komórek na toksyczne działanie ocieplonego DMSO.
4. Rozcieńczanie: W komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieś zawiesinę komórek kroplami do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml uprzednio ogrzanej pożywki AmnioType-1.
5. Wirowanie: Wirować zawiesinę z prędkością 300 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
6. Wysiewanie: Odessać nadsącz i delikatnie resuspender osad komórkowy w 2 ml świeżej pożywki AmnioType-1. Przenieść komórki do płytki 6-dołkowej lub kolby T25 uprzednio pokrytej 0,1% żelatyną, zachowując gęstość 30 000–50 000 komórek/cm²².
7. Inkubacja wstępna: Umieść komórki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C oraz 5% CO2₂W 3. dniu po wysianiu należy zbadać kolby pod mikroskopem fazowo-kontrastowym w odbiciu, aby potwierdzić wstępne przytwierdzenie komórek.
Ekspansja i zmiana pożywki pierwotnych komórek AFC
1. Przygotowanie pożywki do hodowli fibroblastów (FC): Aby przygotować 100 ml domowej pożywki do hodowli fibroblastów, połączyć 82 ml DMEM z wysoką zawartością glukozy z 15 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Dodać 1 ml 100× GlutaMAX, 1 ml 100× nieessentialne aminokwasy (NEAA) oraz 1 ml penicyliny i streptomycyny (P/S). Przefiltrować pożywkę przez 0.22 µm system filtracji próżniowej w środowisku sterylnym.
2. Podczas ekspansji należy stopniowo wymieniać medium hodowlane AFC co 3 dni, przechodząc ze specjalistycznego medium klinicznego (AmnioType-1) na standaryzowany system hodowli fibroblastów (medium FC, przygotowane we własnym zakresie), aby zapewnić stabilność metaboliczną przed elektroporacją.
  1. Przeprowadź stopniową zmianę pożywki:
    1. Dzień 3 (75% AmnioType-1: 25% FC): Odessać obecną pożywkę AmnioType-1. Dodać pożywkę mieszaną składającą się w 75% z AmnioType-1 i w 25% z pożywki FC.
    2. Dzień 6 (50% AmnioType-1 : 50% FC): Odessać pożywkę i zastąpić ją mieszaniną AmnioType-1 i pożywki FC w stosunku 1:1.
    3. Dzień 9 (25% AmnioType-1: 75% FC): Odessać pożywkę i zastąpić ją mieszaniną 25% AmnioType-1 i 75% pożywki FC.
    4. Dzień 12 (100% FC): Odessać medium i wymienić na medium 100% FC.
      UWAGA: Ta stopniowa adaptacja zmniejsza szok komórkowy i zapobiega odrywaniu się wrażliwych klonów aneuploidalnych.
3. Codziennie obserwuj morfologię kolonii. Płyn owodniowy zawiera heterogenną populację komórek. Przy użyciu mikroskopii fazowo-kontrastowej zidentyfikuj dwa główne typy: typ F (fibroblastopodobne, wrzecionowate) oraz typ E (nabłonkowopodobne, zaokrąglone). Fibroblastopodobna subpopulacja mezenchymalna jest optymalna do reprogramowania.
  UWAGA: Należy uważnie monitorować komórki pod kątem oznak starzenia.
Pasażowanie pierwotnych komórek AFC
1. Po osiągnięciu przez komórki 80%–90% konfluencji (zazwyczaj 10.–14. dnia), odessać medium z kolby i raz delikatnie przemyć 2 ml fosforanowego buforu solnego Dulbecco (DPBS) bez Ca2+²⁺/Mg²⁺.
2. Dodać 1 ml 0,25% roztwór trypsyny-EDTA dla jednej studni płytki 6-dołkowej, wystarczający do pokrycia monowarstwy komórek.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4–5 min, aż komórki całkowicie się odkleją.
4. Zneutralizować odczyn rozdrabniający, dodając 3 ml pożywki FC. Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
5. Wirować przy 300 g × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
6. Odssać nadosad i resuspendować osad komórkowy w 1 ml świeżego medium FC. Policzyć żywe komórki za pomocą komory countingowej (hemocytometru) lub automatycznego licznika komórek z wykorzystaniem metody wykluczania trypanu niebieskiego.
7. Wysiać komórki do nowej kolby T25 z gęstością 30 000–50 000 komórek/cm²² w pożywce pełnej (zazwyczaj w stosunku 1:2 lub 1:3).
8. Namnażać komórki do pasażu 3–5 przed wykorzystaniem ich do reprogramowania. Nie należy używać komórek powyżej 6. pasażu.
  UWAGA: Jakość komórek w momencie elektroporacji jest najważniejszym czynnikiem determinującym sukces przeprogramowania. Należy używać wyłącznie zdrowych komórek AFC typu F w fazie logarytmicznego wzrostu, bez oznak starzenia się lub nieprawidłowej morfologii.

2. Elektroporacja plazmidów episomalnych do AFC z użyciem systemu elektroporacji komórek

Pokrycie naczyń hodowlanych matrycą błony podstawnej
1. Rozmrozić macierz błony podstawnej (Matrigel) przez noc w temperaturze 4 °C w lodzie.
2. Schłodzić sterylny DPBS lub DMEM/F-12 na lodzie. Wstępnie schłodzić końcówki do pipet i probówki na lodzie przez 30 min.
3. Rozcieńczyć macierz błony podstawnej w stosunku 1:200 w schłodzonym do temperatury lodowej medium DMEM/F-12, używając schłodzonych końcówek i probówek (np. 30 µL matryca + 6 ml DMEM/F-12 dla płytki 6-dołkowej).
4. Wymieszać dokładnie, lecz delikatnie, pipetując w górę i w dół 5–6 razy. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza.
5. Nanieś rozcieńczony roztwór powlekający do naczyń hodowlanych w ilości 1 ml na dołek w przypadku płytki 6-dołkowej.
6. Inkubować powlekłe naczynia w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 h lub w temperaturze pokojowej przez 2 h.
7. Odssać roztwór powlekający bezpośrednio przed wysianiem komórek. Dodać 2 ml pożywki FC bez antybiotyków oraz 10 μM Y-27632 (inhibitor ROCK) i zwrócić płytkę do 37 °C inkubator. Nie dopuścić do wyschnięcia powlekanej powierzchni.
  UWAGA: Płytki pokryte mogą być przechowywane w 4 °C uszczelnione Parafilmem do 7 dni. Przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej.
Rozmrożenie i przygotowanie plazmidów do reprogramowania episomalnego
1. Wybór plazmidów: Do reprogramowania należy użyć następujących plazmidów episomalnych: pCXLE-hOCT3/4-shp53, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL oraz pCXLE-EBNA1.
  UWAGA: (Opcjonalnie) W celu optymalizacji warunków elektroporacji można równolegle przeprowadzić elektroporację pCE-GFP przy identycznych ustawieniach. Ekspresja GFP w ciągu pierwszych 48–72 h stanowi wygodny wskaźnik wydajności transfekcji, natomiast stopniowy zanik sygnału GFP podczas kolejnych pasaży może służyć do monitorowania przejściowego rozcieńczania plazmidu.
2. Kontrola jakości (QC): Zweryfikować stężenie i czystość DNA za pomocą spektrofotometru. Upewnić się, że stosunek A260/280 mieści się w przedziale od 1,8 do 1,9. Upewnić się, że stężenie każdego plazmidu jest wyższe niż 1 µg/µL i sterylne.
  UWAGA: Kluczowe jest zapewnienie, aby wszystkie plazmidy zostały przygotowane metodami wolnymi od endotoksyn. Pozostałości endotoksyn mogą prowadzić do wysokiej cytotoksyczności i znaczącego obniżenia wydajności reprogramowania. Plazmidy należy przechowywać w małych aliquotach w temperaturze -20 °C aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
3. Dla 100 µL reakcja, przygotować 5 µg mieszaniny plazmidów (równy stosunek wagowy pCXLE-hOCT3/4-shp53, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL oraz pCXLE-EBNA1).
Ustaw parametry elektroporacji.
1. Uruchom urządzenie do elektroporacji. Ustaw parametry impulsu zgodnie z optymalną konfiguracją dla pierwotnych komórek adherentnych: napięcie impulsu: 1 200 V; szerokość impulsu: 20 ms; liczba impulsów: 2.
2. Napełnij stację pipetującą 2 ml buforu E, upewniając się, że elektroda jest całkowicie zanurzona.
  UWAGA: Jeśli wstępne eksperymenty wykażą przeżywalność komórek poniżej 50%, należy rozważyć przetestowanie alternatywnych zestawów parametrów: 950 V / 20 ms / 2 impulsy (łagodniejsze). Alternatywy te wiążą się z obniżeniem wydajności na rzecz poprawy przeżywalności.
Przygotowanie AFC do elektroporacji
1. W dniu 0 należy zweryfikować pod mikroskopem, czy komórki wykazują prawidłową, wrzecionowatą morfologię i czy nie występują oznaki przerośnięcia, starzenia się lub kontaminacji. Należy upewnić się, że komórki osiągnęły 90% konfluencji i znajdują się w aktywnej logarytmicznej fazie wzrostu.
2. Tuż przed procedurą elektroporacji odessaj powłokę z Matrigelu i zastąp ją 2 mL uprzednio ogrzanej pożywki bez antybiotyków pożywka FC medium plus 10 μM Y-27632 (inhibitor ROCK). Podgrzej to wolne od antybiotyków pożywkę FC do 37 °C w inkubatorze przez co najmniej 20 min przed zebraniem komórek do systemu elektroporacji.
  UWAGA: DO NIE dodawania penicyliny-streptomycyny (P/S) ani żadnych innych antybiotyków do tej konkretnej partii pożywki. Po elektroporacji błona komórkowa pozostaje przejściowo przepuszczalna i podatna na uszkodzenia. Obecność antybiotyków może prowadzić do zwiększenia apoptozy.
3. Odssać pożywkę z AFC przed elektroporacją i jednokrotnie przemyć monowarstwę DPBS bez Ca²⁺/Mg²⁺.
4. Dodać 2 ml (dla kolby T25) enzymu TrypLE Select i inkubować w 37 °C przez 4–5 min.
5. Zneutralizować 6 ml pełnej pożywki FC i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Należy policzyć komórki przy użyciu automatycznego licznika komórek.
6. Wiruj przy 300 g × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
7. Całkowicie usuń nadsącz za pomocą 200 μL końcówką pipety, uważając, aby nie naruszyć małego osadu komórkowego.
8. Resuspenduj osad komórkowy w buforze R do końcowego zagęszczenia 1,0 × 10⁷ do 1,4 × 10⁷ komórek/ml
  UWAGA: Odessać nadsącz tak dokładnie, jak to możliwe, aby upewnić się, że osad komórkowy jest suchy. Pozostałości pożywki hodowlanej mogą rozcieńczyć bufor do resuspensji, co może obniżyć wydajność elektroporacji. W przypadku komórek AFC stosować Bufor R (do komórek adherentnych). Wybór buforu należy zweryfikować z zaleceniami producenta.
Przeprowadź elektroporację.
1. Aliquota 110 μL zawiesiny komórkowej (zawierającej 1,0–1,4 × 10⁶ komórki) do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  UWAGA: Dodaj dodatkowy 10 μL buforu R do uzyskania objętości końcowej, aby zapewnić wystarczającą ilość zawiesiny komórkowej, co pomaga uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza podczas aspiracji.
2. Dodaj 5 μg mieszaninę plazmidów do 110 μL alikwot komórek. Wymieszać, delikatnie pipetując 3 razy.
3. Przymocuj sterylny 100 μL zamocuj końcówkę do elektroporacji do pipety. Upewnij się, że końcówka została stabilnie i pewnie osadzona.
4. Załaduj 100 μL zawiesiny komórek/DNA, upewniając się, że nie ma w niej widocznych pęcherzyków powietrza.
  UWAGA: Pęcherzyki powietrza powodują powstawanie łuków elektrycznych podczas impulsu elektrycznego, co prowadzi do śmierci komórek i uszkodzenia końcówki. Jeśli widoczne są pęcherzyki, należy wypchnąć mieszaninę z powrotem do probówki i powtórzyć aspirację powoli.
5. Wsuń napełnioną pipetę pionowo do probówki z buforem w stacji, aż wskoczy na miejsce. Sprawdź na ekranie dotykowym, czy wszystkie parametry są poprawne, a następnie naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć sekwencję impulsów.
6. Należy poczekać, aż obraz pojawi się na ekranie "Zakończono" (zazwyczaj w ciągu 1–2 s). Natychmiast wyjmij pipetę ze stacji i przenieś elektroporowaną zawiesinę komórek bezpośrednio do 2–3 dołki powlekanej płytki 6-dołkowej zawierające uprzednio ogrzane medium FC bez antybiotyków + 10 μM Y-27632.
7. Bezpiecznie wyrzuć zużyty końcówkę. W razie potrzeby powtórz czynności dla kolejnych dołków lub powtórzeń. Umieść płytkę 6-dołkową w 37 °C, 5% CO2₂ inkubator z nawilżaniem przez noc.

3. Hodowla reprogramująca po elektroporacji

UWAGA: Ta sekcja opisuje sekwencyjne zmiany mediów oraz proces pełnego przeprogramowania AFC w iPSC. Harmonogram obejmuje około 25 dni od momentu elektroporacji do wyboru kolonii.

Około 16–18 h po elektroporacji ostrożnie odessaj medium, aby nie usunąć żadnych przeżyłych komórek adherentnych. Do każdego dołka delikatnie dodaj 2 mL uprzednio ogrzanego medium FC (zawierającego P/S), aby umożliwić stabilizację komórek w ciągu pierwszych 24 h. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze.
Od 2. do 6. dnia wymieniaj połowę medium co drugi dzień: ostrożnie odessaj 1 mL zużytego medium i dodaj 1 mL świeżego medium TeSR-E8 (E8).
UWAGA: Częściowa wymiana medium pozwala zachować wydzielane czynniki autokrynne, które wspierają wczesne etapy reprogramowania. Odsysaj medium powoli od krawędzi dołka, aby zminimalizować zakłócenia w obrębie słabo przytwierdzonych komórek w fazie przejścia.
W 7. dniu przeprowadź pełną wymianę medium na 2 mL E8, powtarzając tę czynność co drugi dzień.
Codziennie obserwuj zmiany morfologiczne pod mikroskopem. Około 10.–14. dnia należy spodziewać się pojawienia częściowo przeprogramowanych skupisk o strukturze przypominającej brukową.
UWAGA: (Opcjonalnie) Jeśli tworzenie kolonii jest słabe, od 9. do 15. dnia uzupełnij hodowle maślanem sodu w stężeniu 25–100 μM²³.
Od 15. dnia wymieniaj medium E8 codziennie.
Zaczynając około 18. dnia, codziennie sprawdzaj dołki pod kątem pojawienia się prawdziwych kolonii iPSC. Pełny harmonogram procesu reprogramowania, od elektroporacji w dniu 0. do wyboru kolonii, przedstawiono w Tabeli 2.

4. Mechaniczne wyławianie kolonii iPSC i ekspansja ustanowionych linii iPSC

UWAGA: Należy odróżnić prawdziwe kolonie iPSC od komórek przeprogramowanych lub nieprzeprogramowanych na podstawie poniższych kryteriów morfologicznych. Kolonie „idealne” rozpoznaje się po następujących cechach morfologicznych: (1) Wyraźność granic: należy szukać ostrej, gładkiej i okrągłej krawędzi, która wyraźnie oddziela kolonię od otaczających ją komórek płynu owodniowego; (2) Gęstość komórkowa: należy upewnić się, że komórki w obrębie kolonii są małe, ściśle upakowane i posiadają wysoki stosunek jądra do cytoplazmy z wyraźnymi jąderkami; (3) Refrakcyjność: wysokiej jakości kolonie wydają się jasne i silnie refrakcyjne w kontraście fazowym; (4) Płaskość: kolonia powinna rosnąć jako płaska, dwuwymiarowa warstwa, a nie trójwymiarowy „zbitek”. Kolonie częściowo przeprogramowane często pojawiają się wcześniej niż prawdziwe kolonie iPSC i mają tendencję do bycia większymi, grubszymi i bardziej trójwymiarowymi. Ulegają one spontanicznej różnicowaniu podczas pobierania i pasażowania. Nie należy pobierać kolonii wykazujących „wakuole”, poszarpane krawędzie lub oznaki różnicowania w centrum.

Mechaniczne pobieranie i przenoszenie kolonii iPSC
1. Przygotować płytkę 24-dołkową pokrytą Matrigelem, wlewając do każdego dołka 0,5 mL pożywki E8 uzupełnionej o 10 μM Y-27632. Przechowywać w 37 °C do momentu użycia.
2. Umieścić płytkę hodowlaną pod stereomikroskopem w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II. Przed zbliżeniem płytki do pola widzenia wysterylizować obiektyw i stolik stereomikroskopu 70% etanolem.
3. Zidentyfikować kolonie wykazujące prawidłową morfologię (płaskie, zwarte, o wyraźnych krawędziach).
4. Używając sterylnego grotu pipety 10 μL trzymanego pod niewielkim kątem (około 30° względem poziomu), delikatnie naciąć obwód wybranej kolonii, aby wyznaczyć jej granicę. Podzielić kolonię na około 3 fragmenty, wykonując równoległe nacięcia w poprzek jej średnicy. Za pomocą tego samego grotu pipety delikatnie zeskrobać i podnieść fragmenty kolonii z podłoża, a następnie przenieść je do jednego dołka przygotowanej płytki 24-dołkowej.
5. Powtórzyć kroki dla każdej kolonii, umieszczając fragmenty w osobnych dołkach.
6. Umieścić płytkę 24-dołkową w inkubatorze. Pozostawić bez zakłóceń na 24 h, aby umożliwić przytwierdzenie się fragmentów.
7. Zaczynając od 2. dnia po pobraniu, codziennie wymieniać pożywkę na pożywkę E8 bez Y-27632.
8. Gdy pobrane kolonie osiągną 70–80% konfluencji (zazwyczaj po 3–6 dniach), przeprowadzić pasażowanie przy użyciu Accutase.
Pasażowanie i ekspansja ustalonych linii iPSC
1. Odssać pożywkę z dołka zawierającego iPSC. Dodać Accutase tak, aby pokryć monowarstwę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2–6 min. Obserwować krawędzie kolonii pod mikroskopem; komórki powinny zacząć się rozdzielać, a między nimi powinny pojawić się przerwy.
2. Całkowicie odssać roztwór Accutase. Dodać 1 mL pożywki E8 + 10 μM Y-27632. Delikatnie pipetować pożywkę po powierzchni kolonii 5–8 razy za pomocą pipety P1000, aby rozdzielić kolonie na małe skupiska po 2–8 komórek.
  UWAGA: Należy unikać nadmiernej dysocjacji iPSC, co drastycznie obniża przeżywalność. Celem jest uzyskanie jednolitych małych skupisk, a nie zawiesiny pojedynczych komórek.
3. Przenieść skupiska wraz z 1 mL pożywki E8 + 10 μM Y-27632 równomiernie do nowo pokrytej Matrigelem płytki 12-dołkowej. Umieścić płytkę w inkubatorze.
4. Codziennie wymieniać pożywkę na pożywkę E8 (bez Y-27632 po 1. dniu).
5. Kontynuować pasażowanie co 3–4 dni przy stosunku rozcieńczenia od 1:2 do 1:5, w zależności od konfluencji.
6. Hodować linie iPSC przez minimum 10 pasaży przed zastosowaniami w dalszych etapach, aby zapewnić stabilne usunięcie plazmidów episomalnych.

5. Charakterystyka aneuploidalnych linii iPSC

UWAGA: Przeprowadź następujące testy walidacyjne na ugruntowanych liniach iPSC (pasaż 10 lub późniejszy), aby potwierdzić pluripotencję, integralność kariotypu oraz usunięcie wektora episomalnego.

Potwierdź ekspresję markerów pluripotencji.
1. Należy zweryfikować ekspresję kluczowych markerów pluripotencji za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, cytometrii przepływowej lub obu tych metod. Oczekiwane profile markerów podsumowano w Tabela 3.
  UWAGA: Chociaż barwienie immunofluorescencyjne zapewnia wstępne potwierdzenie pluripotencji, do szerszej oceny ekspresji genów związanych z pluripotencją, w tym LIN28A, DPPA4 i KLF4, zaleca się zastosowanie RT-qPCR oraz RNA-seq.
Analiza kariotypu metodą prążkowania G
KRYTYCZNE: Reprogramowanie może indukować ratunek trisomii w części klonów. Należy przesiewowo przebadać wiele klonów (5–10 na linię rodzicielską), aby zidentyfikować pochodne zarówno z zachowaną aneuploidią, jak i z uratowaną euploidią.
1. Zbiór iPSC w pasażach 10–15 przy konfluencji 70%–80%.
2. Dodaj 0.1 μg/mL colcemid do pożywki hodowlanej. Inkubować w 37 °C przez 2–4 h w celu zatrzymania komórek w metafazie.
  UWAGA: Kolcemid jest trucizną mitotyczną. Należy go używać w rękawiczkach w komorze z laminarnym przepływem powietrza (dygestorium biologicznym). Odpady zawierające kolcemid należy utylizować jako materiały niebezpieczne.
3. Dysocjuj komórki do postaci zawiesiny jednokomórkowej przy użyciu Accutase lub odpowiednika. Wirowuj przy 300 × g przez 5 min.
4. Resuspender osad w 5 ml podgrzanego wcześniej roztworu hipotonicznego (0,075 M chlorku potasu). Inkubować w 37 °C przez 15–20 min.
5. Do probówki dodać 1 ml świeżo przygotowanego utrwalacza (metanol: kwas octowy w stosunku objętościowym 3:1), delikatnie mieszając. Wirować przy 300 × g przez 10 min.
6. Odessać nadsącz. Dodać 5 ml świeżego utrwalacza. Delikatnie wymieszać i inkubować przez 10 min. Ponownie odwirować.
7. Powtórz etap fiksacji (krok 6) jeszcze raz, aby przeprowadzić łącznie 3 fiksacje.
8. Po końcowym wirowaniu osad zawiesić ponownie w 0,5–1 ml świeżego utrwalacza, aby uzyskać odpowiednie zagęszczenie komórek.
9. Nanieś 2–3 krople zawiesiny komórkowej na czyste, wilgotne szkiełka przedmiotowe z wysokości około 30 cm. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
10. Wypiekać preparaty w temperaturze 80 °C przez 2 h lub 65 °C przez noc w celu starzenia chromosomów.
11. Wykonaj prążkowanie G: potraktuj preparaty roztworem trypsyny 0,025% przez 30–60 s, wypłucz i barw roztworem Giemsy 5% przez 1–5 min.
12. Przeanalizować co najmniej 20 dobrze rozprzestrzenionych metafaz na klon przy użyciu mikroskopu z obiektywem imersyjnym w świetle przechodzącym (100× cel).
13. Dokumentuj kariotyp zgodnie z nomenklaturą ISCN (np. 47,XX,+21 dla trisomii 21 u kobiet; 45,X dla zespołu Turnera).
  UWAGA: Kariotypowanie z prążkowaniem G pozwala na wykrycie głównych nieprawidłowości chromosomowych, lecz charakteryzuje się ograniczoną rozdzielczością. W celu zidentyfikowania submikroskopowych zmian genetycznych oraz potwierdzenia integralności genomowej iPSC zaleca się zastosowanie uzupełniających analiz, takich jak analiza liczby kopii (CNV), sekwencjonowanie całego eksomu (WES) lub sekwencjonowanie całego genomu (WGS).
Weryfikacja eliminacji wektora episomalnego metodą PCR.
UWAGA: Ten etap potwierdza utratę wszystkich plazmidów episomalnych z linii iPSC poprzez amplifikację PCR sekwencji specyficznych dla wektora.
1. Wyizoluj genomowe DNA z iPSC (pasaż ≥ 10) oraz z nietransfekowanych kontrolnych AFC, wykorzystując standardowy zestaw do ekstrakcji oparty na kolumienkach.
2. Przygotuj 25 μL Reakcja PCR. Przeprowadzić reakcję PCR z użyciem par starterów Orip/GAPDH w następujących warunkach cykliczności (94 °C przez 2 min; a następnie 35 cykli obejmujących 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s, a następnie 72 °C przez 30 s; końcowa elongacja w 72 °C przez 5 min). W każdym cyklu PCR należy uwzględnić kontrolę dodatnią (matryca plazmidowa) oraz kontrolę ujemną (DNA genomowe z komórek nietransfekowanych).
3. Rozdziel produkty PCR w 2% żelu agarozowym z zastosowaniem odpowiedniej drabinki DNA.
4. Interpretacja wyników: linie iPSC po usunięciu episomów nie wykazują prążków amplifikacyjnych o wielkości 544 bp. Kontrola dodatnia musi wykazywać prążki o oczekiwanej wielkości. Kontrola ujemna nie może wykazywać żadnych prążków.
Wykrywanie Mycoplasma metodą PCR
1. Przed wymianą medium zebrać 0,5–1 ml nadsączu hodowlanego z kultur iPSC po co najmniej 24 h inkubacji, a następnie odwirować przy 12 000 × g przez 5 min w celu usunięcia szczątków komórkowych.
2. Klarowny nadsącz należy wykorzystać jako matrycę do reakcji PCR z użyciem zestawu PCR Mycoplasma Detection Kit, zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Produkty PCR rozdzielono metodą elektroforezy w 2% żelu agarozowym. Należy kontynuować dalsze eksperymenty tylko w przypadku potwierdzenia braku zanieczyszczenia kultur iPSC mykoplazmą.
  UWAGA: Jeśli komórki AFC od rodziców nie pochodzą z certyfikowanego biobanku z udokumentowaną sterylnością i wynikami testów na obecność mykoplazm, przed przeprogramowaniem zdecydowanie zaleca się rutynowe badanie przesiewowe w kierunku mykoplazm jako wstępny etap kontroli jakości.
Test potencjału różnicowania w trzech liniach (opcjonalnie)
1. Potwierdź in vitro zdolność do różnicowania za pomocą kierowanego różnicowania trójliniowego lub tworzenia ciał embroidalnych (EB), a następnie analizy markerów specyficznych dla poszczególnych listków zarodkowych. Alternatywnie przeprowadzić in vivo tworzenie teratoma u myszy z niedoborem odporności w celu walidacji pluripotencji metodą złotego standardu.
  UWAGA: W celu uzyskania szczegółowych protokołów dotyczących testu teratoma lub różnicowania kierowanego należy zapoznać się z opublikowanymi standardowymi procedurami operacyjnymi²⁴Zaleca się przeprowadzenie tych analiz, jednak można je pominąć, jeśli przeprowadzono kompleksowe in vitro przedstawiono dane z analizy markerów oraz różnicowania funkcjonalnego.

6. Izolacja i weryfikacja klonów jednokomórkowych

UWAGA: Aby upewnić się, że każda linia iPSC pochodzi z pojedynczej komórki, zaleca się dwuetapowy proces weryfikacji klonalnej. Po mechanicznym pobieraniu i ekspansji zaleca się wtórne wysiewanie klonów jednokomórkowych po potwierdzeniu kariotypu. Weryfikacja, że każda linia iPSC pochodzi z jednej komórki, jest krytycznym wymogiem generowania iPSC. Zapewnia ona usunięcie mozaicyzmu somatycznego komórek wyjściowych i potwierdza, że diagnostyczna sygnatura aneuploidii jest jednolita w całej populacji.

Wysiew pojedynczych komórek
1. Dysocjować i resuspender kolonie iPSC z potwierdzonym kariotypem do zawiesiny pojedynczych komórek, używając Accutase przez 2–6 min w 37 °C.
2. Stosować pożywkę E8 uzupełnioną o 10 µM Y-27632, aby zmaksymalizować przeżywalność izolowanych pojedynczych komórek. Osadzać pojedyncze komórki, stosując jedną z poniższych metod:
  1. Rozcieńczanie ograniczające: Rozcieńczyć zawiesinę do stężenia 0,5–1 komórki na 100 µL. Wysiać 100 µL do każdego dołka płytki 96-dołkowej powlekanej Matrigel.
  2. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS): Sortować pojedyncze żywe komórki bezpośrednio do dołków płytki 96-dołkowej powlekanej Matrigel.
Weryfikacja monoklonalności i ekspansja
1. Wstępna inspekcja: W ciągu 24–48 h po wysiewie, przy użyciu mikroskopu fazokontrastowego o wysokiej rozdzielczości, sprawdzić każdy dołek. Zaznaczyć tylko te dołki, w których znajduje się pojedyncze, wyraźnie zdefiniowane zdarzenie przylegania. Wykluczyć dołki z wieloma klastrami lub bez komórek.
2. Wzrost kolonii: Utrzymywać zidentyfikowane pojedyncze komórki w pożywce E8 bez inhibitora ROCK po pierwszych 24 h.
3. Sekwencyjna ekspansja: Po osiągnięciu przez kolonię pochodzącą z pojedynczej komórki 70% konfluencji, sekwencyjnie przenosić komórki z płytki 96-dołkowej do formatów 24-dołkowych, 12-dołkowych, a na końcu 6-dołkowych.
  UWAGA: W badaniach nad terapią komórkową często wymagana jest dokumentacja fotograficzna etapu pojedynczej komórki (Dzień 0 lub Dzień 1) jako część Certyfikatu Analizy, aby udowodnić czystość linii iPSC pod względem linii komórkowej.
  Potencjalne przyczyny nieudanego przeprogramowania, suboptimalnego tworzenia kolonii oraz problemy podczas ustanawiania klonów iPSC zostały podsumowane wraz z praktycznymi rozwiązaniami w Tabeli 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Progresja morfologiczna podczas przeprogramowania

Pierwotne komórki płynu owodniowego wykazywały heterogeniczne morfologie, w tym komórki typu E i typu F (Ryc. 1A). Komórki typu F należy namnożyć i wykorzystać do przeprogramowania. Po elektroporacji AFC plazmidami episomalnymi Epi5 obserwuje się charakterystyczną sekwencję zmian morfologicznych. W dniu 0 AFC wykazują typową wrzecionowatą morfologię fibroblastopodobną. Między 3. a 5. dniem pojawiają się pierwsze mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje nieintegrującą, bezkarmiącą metodę generowania aneuploidalnych ludzkich iPSC z komórek płynu owodniowego przy użyciu plazmidów episomalnych dostarczanych poprzez elektroporację. O sukcesie reprogramowania decyduje kilka krytycznych etapów. Po pierwsze, kluczowa jest jakość wyjściowej populacji AFC. W klinicznych laboratoriach cytogenetycznych AFC są zazwyczaj namnażane w mediach mających na celu przyspieszenie proliferacji komórek do prenatalnej analizy kariotypu, a nie do długote...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych. Schematyczny rysunek na Ryc. 7A został wygenerowany przy użyciu narzędzi wspomaganych przez AI, a następnie sprawdzony i zmodyfikowany przez autorów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (Grant No. 2022YFA0913300) oraz Kliniczny Projekt Kluczowy Trzeciego Szpitala Uniwersytetu Pekińskiego (Grant No. BYSY2022054) przyznany Jianying Guo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,25% Trypsyna-EDTA	Thermo Fisher (Gibco)	25200056	Dysocjacja komórek do pasażowania AFC
100bp Plus II DNA Ladder	TransGen Biotech	BM321-01	Marker wielkości DNA
Zamrażarka -80 °C	Thermo Fisher	FDE60086fv	Długoterminowe przechowywanie plazmidowego DNA i próbek
Roztwór do odrywania komórek Accutase	StemCell Technologies	07920	Łagodna dysocjacja iPSC do małych skupków
Kwas octowy (lodowaty)	Sigma-Aldrich	338826	Składnik utrwalacza do kariotypowania (MeOH:AcOH 3:1)
Agaroza	Sigma-Aldrich	A9539	Elektroforeza żelowa dla produktów PCR (2%)
Pożywka AmnioType-1	VivaCell BIOSCIENCES	C3620-0100	Pożywka do pierwotnych kultur AFC
Automatyczny licznik komórek / Hemocytometr	Countstar	TC20	Liczenie żywych komórek z wykluczeniem błękitu trypanu
Mikroskop w świetle przechodzącym (obiektyw olejowy 100x)	Zeiss	Axiovert5	Analiza preparatów metafazowych do kariotypowania
Wirówka (rotor z koszyczkami)	Eppendorf	5810R	Wirowanie komórek przy 300 ×g
Komora z laminarnym przepływem powietrza klasy II	ESCO	AC2-4S8-CN	Sterylne miejsce pracy dla wszystkich operacji hodowli komórkowych
Inkubator CO2 (uwilżany)	There scientific	3131	Utrzymywanie środowiska 37 °C, 5% CO2
Kolcemid (10 µg/mL)	Capricorn scientific	COL-H	Zatrzymanie w metafazie do kariotypowania (0,1 µg/mL, 2-4 h)
Pożywka do zamrażania komórek CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	07959	Pożywka do zamrażania komórek
DAPI	Merck Millipor	10236276001	Barwienie jąder komórkowych
DMEM (wysoka zawartość glukozy)	Thermo Fisher (Gibco)	11965092	Baza do pożywki dla fibroblastów (FC)
DMEM/F-12	Thermo Fisher (Gibco)	11330032	Bufor do rozcieńczania Matrigelu (1:200)
DPBS bez Ca2+/Mg2+	Thermo Fisher (Gibco)	14190250	Bufor do płukania
Plazmid episomalny (pCE-GFP)	Addgene	#41858	Nieintegrujący wektor reprogramujący (kontrola GFP)
Plazmid episomalny (pCXLE-hOCT3/4-shp53-F)	Addgene	#27077	Nieintegrujący wektor reprogramujący (OCT4 + shp53)
Plazmid episomalny (pCXLE-hSK)	Addgene	#27078	Nieintegrujący wektor reprogramujący (SOX2 + KLF4)
Plazmid episomalny (pCXLE-hUL)	Addgene	#27080	Nieintegrujący wektor reprogramujący (L-MYC + LIN28)
Płodowa surowica bydlęca	HyClone	SH30071.03	Surowica jako dodatek do ekspansji AFC (pożywka FC, 15%)
Mikroskop fluorescencyjny	Leica	Sp8	Barwienie żywych komórek TRA-1-60/81 i wizualizacja IF
System elektroforezy żelowej	Bio-Rad	164-5056	Analiza produktów PCR w żelu agarozowym
Żelatyna (0,1%)	Sigma-Aldrich	G1393	Powlekanie naczyń hodowlanych dla adhezji AFC
Zestaw do ekstrakcji DNA genomicznego	TIANGEN	4992199	Izolacja DNA jakości PCR z iPSC
Roztwór barwiący Giemsy	Sigma-Aldrich	GS500	Barwienie G-pasmowe chromosomów (5%)
GlutaMAX (100x)	Thermo Fisher (Gibco)	35050061	Dodatek do pożywki FC
Odwrócony mikroskop fazowo-kontrastowy	Zeiss	Axiovert5	Codzienny monitoring hodowli i morfologii kolonii
Zbiornik do przechowywania w ciekłym azocie	Thermo Scientific	CY50985	Kriokonserwacja komórek
Matryca błony podstawnej Matrigel	Corning	354230	Powlekanie naczyń hodowlanych dla adhezji iPSC
Metanol (bezwodny)	Sigma-Aldrich	34860	Składnik utrwalacza do kariotypowania (MeOH:AcOH 3:1)
Przeciwciało przeciw NANOG (królicze)	Abcam	ab109250	Immunofluorescencja; jądrowy marker pluripotencji
Zestaw do elektroporacji Neon NxT (100 µL)	Thermo Fisher (Invitrogen)	N10025	Elektroporacja; zawiera bufory R, T, E oraz końcówki 100 µL
System elektroporacji Neon NxT	Thermo Fisher (Invitrogen)	NEON18S	Wprowadzanie plazmidów episomalnych drogą elektroporacji
Niezasadnicze aminokwasy (NEAA, 100x)	Thermo Fisher (Gibco)	11140050	Dodatek do pożywki FC
Przeciwciało przeciw OCT4 (królicze)	Abclonal	A7920	Immunofluorescencja; jądrowy marker pluripotencji
PCR Master Mix (wysokiej wierności)	TIANGEN	4992920	Weryfikacja eliminacji plazmidów episomalnych metodą PCR
pCXWB-EBNA1	Addgene	#37624	Niereplikująca episomalna ekspresja EBNA1
Przeciwciało PE przeciwludzkie TRA-1-81	BioLegend	330708	Barwienie na pluripotencję
Penicylina-Streptomycyna (100x)	Thermo Fisher (Gibco)	15140122	Dodatek antybiotykowy (NIE stosowany po elektroporacji)
Odczynnik Phalloidin-iFluor 647	Abcam	ab176759	Znakowanie F-aktyny (filamentów aktynowych)
Chlorek potasu (KCl)	Sigma-Aldrich	P5405	Roztwór hipotoniczny do kariotypowania (0,075 M)
System Real-time PCR	Thermo Fisher Scientific	QuantStudio3	qPCR do weryfikacji genów markerowych
Maślan sodu (NaB)	Sigma-Aldrich	B5887	Inhibitor HDAC; 25-100 µM w celu zwiększenia efektywności reprogramowania
Przeciwciało przeciw SOX2 (mysie)	R&D Systems	MAB2018	Immunofluorescencja; jądrowy marker pluripotencji
Przeciwciało przeciw SSEA-4	BioLegend	330408	Immunofluorescencja; powierzchniowy marker pluripotencji komórek
Stereomikroskop	Nikon	SMZ745	Mechaniczny pobór kolonii pod powiększeniem
TeSR-E8	STEMCELL Technologies	05990	Pożywka do utrzymania iPSC bez komórek karmicieli
Przeciwciało przeciw TRA-1-60	Merck Millipor	MAB4360	Barwienie na pluripotencję
Trans DNA Marker II	TransGen Biotech	BM411-01	Marker wielkości DNA
Zestaw do detekcji Mycoplasma TransDetect PCR	TransGen Biotech	FM311-01	Test na obecność Mycoplasma
Enzym TrypLE Select (1x)	Thermo Fisher (Gibco)	12563011	Łagodna dysocjacja przylegających komórek AFC
Trypsyna (0,025%)	Sigma-Aldrich	T4799	Obróbka wstępna preparatów przed barwieniem G-pasmowym (30-60 s)
Termocykler VeritiPro 96-dołkowy	Thermo Fisher Scientific	A48141	PCR do weryfikacji eliminacji plazmidów episomalnych
Kąpiel wodna (37 °C)	Shanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co., Ltd.	ZX-S22	Rozmrażanie pożywek i odczynników
Y-27632 dihydrochlorowodorek (inhibitor ROCK)	Tocris	1254	Zwiększa przeżywalność iPSC po dysocjacji (10 µM)

Bibliografia

Gurdon JB. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. Development. 1962;10(4):622-640.
Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981;292(5819):154-156.
Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981;78(12):7634-7638.
Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel J, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998;282(5391):1145-1147.
Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007;131(5):861-872.
Fusaki N, Ban H, Nishiyama A, Saeki K, Hasegawa M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009;85(8):348-362.
Warren L, Manos PD, Ahfeldt T, Loh YH, Li H, et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 2010;7(5):618-630.
Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 2009;324(5928):797-801.
Hou P, Li Y, Zhang X, Liu C, Guan J, et al. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science. 2013;341(6146):651-654.
Guan J, Wang G, Wang J, Zhang Z, Fu Y, et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 2022;605(7909):325-331.
Liuyang S, Wang G, Wang Y, He H, Lyu Y, et al. Highly efficient and rapid generation of human pluripotent stem cells by chemical reprogramming. Cell Stem Cell. 2023;30(4):450-459.e9.
Wang Y, Peng F, Yang Z, Cheng L, Cao J, et al. A rapid chemical reprogramming system to generate human pluripotent stem cells. Nat Chem Biol. 2025;21(7):1030-1038.
Li C, Zhou J, Shi G, Ma Y, Yang Y, et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 2009;18(22):4340-4349.
Slamecka J, Salimova L, McClellan S, van Kelle M, Kehl D, et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 2016;15(2):234-249.
Li Q, Fan Y, Sun X, Yu Y. Generation of induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid cells by reprogramming with two factors in feeder-free conditions. J Reprod Dev. 2013;59(1):72-77.
Crosland BA, Hedges MA, Ryan KS, D'mello RJ, Mccarty OJT, Amniotic fluid: its role in fetal development and beyond. J Perinatol. 2025 Aug;45(8):1163-1170. doi: 10.1038/s41372-025-02313-1. Epub 2025 May 8. PMID: 40341778; PMCID: PMC12354197.
Liu L, et al. Amniotic fluid stem cells in birth defects: integrated roles in disease modeling, prenatal diagnosis, and therapy. Stem Cell Rev Rep. 2026. doi:10.1007/s12015-026-11161-1.
Antonucci I, Provenzano M, Rodrigues M, Pantalone A, Salini V, et al. Amniotic fluid stem cells: a novel source for modeling of human genetic diseases. Int J Mol Sci. 2016;17(4):607.
Guillot PV. Induced pluripotent stem (iPS) cells from human fetal stem cells. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2016;31:112-120. doi:10.1016/j.bpobgyn.2015.08.007.
Lu HE, Yang YC, Chen SM, Su HL, Huang PC, et al. Modeling neurogenesis impairment in Down syndrome with induced pluripotent stem cells from trisomy 21 amniotic fluid cells. Exp Cell Res. 2013;319(4):498-505.
Lee CC, et al. Establishment of a human trisomy 18 induced pluripotent stem cell line from amniotic fluid cells. Stem Cell Res. 2018;29:115-119.
D'Aurora M, et al. Modeling Klinefelter syndrome using induced pluripotent stem cells reveals impaired germ cell differentiation. Front Cell Dev Biol. 2020;8:567454.
Mali P, Chou BK, Yen J, Ye Z, Zou J, et al. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 2010;28(4):713-720.
Guo J, Lee Q, Qiu H, Wei Y, Zhu X, et al. Patient-derived neural organoids reveal developmental impairments associated with a novel GJB1 mutation in X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. Neurobiol Dis. 2026;220:107299.
Nanbo A, Sugden A, Sugden B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. EMBO J. 2007;26(19):4252-4262.
Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 2011;21(3):518-529.
Okita K, Matsumura Y, Sato Y, Okada A, Morizane A, et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 2011;8(5):409-412.
Cheng L, Wang Y, Yang Z, Cao J, Peng F, et al. p53 safeguards chemical reprogramming of human somatic cells toward pluripotency. Cell. 2026. doi:10.1016/j.cell.2026.03.038.
Akutsu SN, Miyamoto T, Oba D, Tomioka K, Ochiai H, et al. iPSC reprogramming-mediated aneuploidy correction in autosomal trisomy syndromes. PLoS One. 2022;17(3):e0264965.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aneuploidalne ludzkie iPSC markery pluripotencji przejście mezenchymalno-nabłonkowe kariotypowanie metodą prążkowania G weryfikacja eliminacji wektora metodą PCR reprogramowanie bez użycia komórek feeder modelowanie chorób biologia chromosomów

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Informuj mnie o aktualizacjach: