Izolacja mikrobioty związanej z nasionami pomidorów poprzez kontrolowane kiełkowanie i porównawcze hodowanie

Podsumowanie

Ten protokół łączy standaryzowaną sterylizację powierzchni nasion z kontrolowaną kiełkowaniem, aby umożliwić powtarzalne izolację mikrobioty związanej z nasionami pomidora podczas przejścia od nasiona do sadzonki. Podejście to poprawia odzyskiwanie hodowanych mikroorganizmów, które są niedostatecznie reprezentowane w suchych nasionach i wspiera porównawcze badania kulturowe podczas wczesnego rozwoju sadzonek.

Streszczenie

Sterylizacja powierzchniowa jest krytycznym, ale często nieoptymalizowanym etapem w badaniach mających na celu izolację mikroorganizmów związanych z nasionami, ponieważ zbyt surowocie traktowanie może zmniejszać lub zniekształcać endogenne populacje mikrobiomu. Ten protokół przedstawia powtarzalne podejście do izolacji hodowanych mikrobiomów związanych z nasionami pomidorów przy użyciu warunków sterylizacji powierzchniowej opartych na uprzednio zweryfikowanych metodologiach, w połączeniu z kontrolowaną kiełkowaniem nasion. Zamiast definiować uniwersalnie optymalne traktowanie sterylizacyjne, podejście to stosuje standaryzowane warunki, które można dostosować według cech nasion, minimalizując jednocześnie stronniczość i zachowując endogenne populacje mikrobiomu.

Aby zwiększyć odzyskiwanie hodowanych mikroorganizmów związanych z przejściem z nasion do siewek, protokół obejmuje kontrolowany etap kiełkowania przed izolacją mikrobiomu. W przeciwieństwie do konwencjonalnych podejść opartych na maceratowaniu suchych, niekiełkujących nasion, kontrolowane kiełkowanie promuje aktywację mikroorganizmów podczas przejścia z nasion do siewek w sterylnych warunkach. Porównawcze analizy jednostek tworzących kolonie (CFU) ekwiwalencyjnych replikat biologicznych, z których każda składa się ze zbiorczego materiału z 3–5 suchych nasion lub 3–5 kiełkujących siewek, ujawniły zauważalną zmianę w hodowanych społecznościach po kiełkowaniu. Rodzaje, które były słabo reprezentowane w suchych nasionach, wzbogaciły się po kiełkowaniu, podczas gdy inne taksony, które były bardziej obfite w suchych nasionach, zmniejszyły swoją względną reprezentację, co wspiera badania nad wczesnymi interakcjami roślina-mikrob w trakcie etapu rozwoju siewek.

W różnych replikatach biologicznych, rodzaje w tym Stutzerimonas, Stenotrophomonas oraz Priestia były konsekwentnie wzbogacone wśród izolaci pochodzących z kiełkujących siewek, podczas gdy Paenibacillus pozostawał obfity w różnych warunkach, ale wykazywał zauważalne zmiany w składzie na poziomie gatunków. Integrując standaryzowane warunki sterylizacji z kontrolowanym kiełkowaniem i porównawczą analizą materiału suchego i kiełkującego, ten protokół dostarcza solidnej i powtarzalnej ramy dla kulturowej izolacji mikrobiomu związanego z nasionami, o potencjalnym funkcjonalnym znaczeniu w wczesnym rozwoju siewek, i wspiera badania nad wczesnymi interakcjami roślina-mikrob w trakcie etapu rozwoju siewek.

Wprowadzenie

Nasienie zawierają zróżnicowane zespoły mikroorganizmów składające się z bakterii i grzybów związanych zarówno z tkankami wewnętrznymi, jak i zewnętrznym powierzchnią^1,2,3. Mikroorganizmy te są coraz bardziej rozpoznawane jako integralne elementy biologii roślin, ponieważ mogą wpływać na wydajność roślin od najwcześniejszych etapów rozwojowych, w tym kiełkowanie, ustabilizowanie siewek i reakcje na stres biotyczny i abiotyczny^1,2,3. Pod względem ekologicznym nasiona pełnią funkcję nie tylko jako zarodniki do rozmnażania roślin, ale także jako zbiorniki inokulum mikrobiologicznego, co sprawia, że są krytycznym punktem wejścia do zrozumienia, jak mikrobiomy związane z roślinami są inicjowane i utrzymywane w cyklu życia roślin^1,2,3.

Mikroorganizmy związane z nasionami mogą stanowić pierwsze inokulum mikrobiologiczne spotykane przez kiełkującą roślinę i mogą w związku z tym przyczyniać się do składu mikrobiomu podczas przejścia od nasiona do siewki^1,3,4. To wczesne inokulum może wpływać na społeczności mikroorganizmów, które następnie kolonizują korzenie i inne części roślin, co ma konsekwencje dla ustabilizowania roślin i późniejszych interakcji roślina-mikrob^1,4. Ponadto część mikrobioty nasion może być przekazywana pionowo przez struktury rozrodcze, takie jak kwiaty, zalążki i pyłek, co pozwala na przetrwanie populacji mikroorganizmów przez kolejne pokolenia roślin^4,5. Ta międzypokoleniowa ciągłość sugeruje, że niektóre przenoszone przez nasiona mikroorganizmy mogą konsekwentnie przyczyniać się do przystosowania i dostosowania roślin.

Funkcjonalnie, mikroorganizmy związane z nasionami mogą wpływać na wydajność żywiciela poprzez kilka mechanizmów, w tym produkcję fitohormonów, związków przeciwdrobnoustrojowych i innych bioaktywnych metabolitów, które modulują rozwój roślin lub hamowanie konkurencji i patogenów^5,6,7. Populacje mikroorganizmów przenoszone przez nasiona również wydają się współistnieć poprzez różnicowe wykorzystanie zasobów i podział ekologiczny, sugerując, że nasiona reprezentują selektywne siedlisko, a nie pasywny pojemnik na mikrobiologiczną różnorodność⁷. Łącznie te odkrycia potwierdzają ideę, że nasiona goszczą populacje mikroorganizmów, które mogą wpływać na wczesny rozwój roślin i reprezentować kandydatów do dalszej charakteryzacji funkcjonalnej^2,3,5,7.

Aby zbadać mikroorganizmy związane z nasionami w sposób funkcjonalnie informacyjny i eksperymentalnie uchwytny, konieczne jest odzyskanie żywych populacji mikroorganizmów z materiału nasiennego. W tym kontekście, izolacja mikroorganizmów zapewnia dostęp do żywych mikroorganizmów, które następnie mogą być eksperymentalnie scharakteryzowane i wycenione w dalszych badaniach dotyczących interakcji roślina-mikrob. Jest to szczególnie ważne w systemach nasiennych, gdzie mikroorganizmy związane z nasionami mogą przyczyniać się do wczesnego ustabilizowania roślin i reprezentować kandydatów do przesiewowego badania funkcjonalnego i przyszłego zastosowania praktycznego.

Odzyskanie mikroorganizmów związanych z nasionami jest bardzo wrażliwe na procedury przygotowywania próbek, szczególnie sterylizację powierzchni, przetwarzanie tkanek i etap rozwojowy pobranego materiału. Ta wrażliwość jest szczególnie istotna w systemach nasiennych, ponieważ biomasa mikroorganizmów jest często niska, a małe różnice proceduralne mogą znacząco wpływać zarówno na liczbę kolonii tworzących jednostki, jak i skład izolowanych mikroorganizmów. Wśród tych zmiennych, sterylizacja powierzchni jest jedną z najważniejszych i trudnych do zoptymalizowania. Sterylizacja jest konieczna, aby zmniejszyć zakażenie epifityczne przed izolacją mikroorganizmów, jednak nadmierne narażenie na środki sterylizujące może zmniejszyć żywotność lub zdolność do hodowli endogennych mikroorganizmów, podczas gdy niewystarczająca sterylizacja może pozwolić taksonom związanym z powierzchnią na dominowanie w kolejnych hodowlach^8,9,10. Odpowiednio, celem sterylizacji nie jest maksymalizacja narażenia na chemikalia, ale zastosowanie najłagodniejszego leczenia, które skutecznie tłumi zanieczyszczenia pochodzenia powierzchniowego, zachowując odzyskiwalne mikroorganizmy wewnętrzne^5,11.

Ponieważ efektywność sterylizacji zależy od gatunku rośliny, struktury tkankowej, właściwości łupiny nas

Protokół

1. Przygotowanie reagentów, mediów i materiałów sterylnych

1. Przygotuj 70% (v:v) roztwór etanolu za pomocą sterylnej wody destylowanej.
2. Przygotuj 20% (v:v) roztwór roboczy z komercyjnej wybielaczki zawierającej 5% dostępnego hypochlorytu sodu, rozcieńczając 20 mL wybielaczki w 80 mL sterylnej wody destylowanej.
3. Przygotuj sterylną wodę destylowaną do kroków płukania.
4. Przygotuj sterylne 0,45% NaCl do homogenizacji i rozcieńczania szeregowego, i używaj tego roztworu konsekwentnie przez cały przepływ pracy.
5. Przygotuj agarowe podłoże hodowlane Luria Bertani (LB) (na litr: 10 g tryptyznu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl i 15 g agaru) i wstępnie wylej płytki w sterylnych warunkach.
6. Sterylizuj wszystkie narzędzia, które mają kontakt z nasionami lub sadzonkami po sterylizacji, w tym pincety, tłuczki, ścieralki, nożyczki i stojaki na probówki, przez autoklawację lub zweryfikowany aseptyczny zabieg.
7. Ułóż sterylne naczynia Petriego, probówki, końcówki pipet i płytki hodowlane wewnątrz komory laminarnej przed rozpoczęciem obsługi nasion.
   UWAGA: Ponieważ biomasa mikroorganizmów związanych z nasionami może być niska, ważne jest minimalizowanie niepotrzebnego czasu obsługi i przygotowanie wszystkich materiałów przed rozpoczęciem sterylizacji. Opóźnienia między zabiegami chemicznymi, płukaniem, nasadzanie na płytki lub przygotowanie do kiełkowania mogą wpływać na zmienność odzysku. W innych systemach eksperymentalnych można używać alternatywnych sterylnych buforów, ale w danym doświadczeniu porównawczym powinien być zachowany jeden bufor. Dodatkowe media takie jak Reasoner's 2A (R2A) lub selektywne media mogą być zawarte w rozszerzonym przepływie kultur, ale agar LB był używany jako standardowe medium dla porównawczego protokołu opisany tutaj.

2. Selekcja i przydział nasion

1. Używaj nasion z jednej partii nasion pomidorów dla każdego eksperymentu, jeśli to możliwe.
   UWAGA: W opisanym tu przepływie reprezentatywnym użyto nasiona pomidorów z jednej partii cv. Money Maker na każdym etapie eksperymentu.
2. Zwizualizuj nasiona i wyrzuć uszkodzone, widoczne złamania lub zniekształcenia.
3. Podziel nasiona na grupy eksperymentalne wymagane dla badania. Co najmniej przydziel nasiona do: izolacji suchych nasion po sterylizacji i kiełkowania z następującą izolacją sadzonek.
4. Jeśli ma być przetestowanych więcej niż jeden warunek sterylizacji, przydziel nasiona losowo wśród warunków sterylizacji, aby uniknąć stronniczości leczenia spowodowane wielkością lub stanem nasion.
   UWAGA: Wszystkie porównania poniżej są silniejsze, gdy są oparte na tej samej partii nasion przetworzonych równolegle. Przepływ może być dostosowany do innych genotypów lub odmian pomidorów, ale każde porównanie w ramach eksperymentu powinno być przeprowadzone przy użyciu pojedynczej partii nasion przetworzonych równolegle.

3. Sterylizacja powierzchni nasion pomidorów

1. Przenieś 3-5 nasion do każdej sterylnej 2 mL probówki mikrocentrfużowej wewnątrz komory laminarnej.
2. Dodaj 1 mL 70% (v:v) etanolu do każdej probówki, aby całkowicie zanurzyć nasiona.
3. Inkubować probówki przez 5 min z łagodnym mieszaniem przez rotację probówek z obrotomierzem na 25 rpm.
4. Całkowicie usuń etanol za pomocą sterylnej pipety.
5. Natychmiast dodaj 1 mL 20% (v:v) roztworu roboczego hypochlorytu sodu do każdej probówki, aby całkowicie zanurzyć nasiona.
6. Inkubować probówki przez 10 min z łagodnym mieszaniem przez rotację probówek z obrotomierzem na 25 rpm.
7. Całkowicie usuń roztwór hypochlorytu sodu za pomocą sterylnej pipety.
8. Przepłucz nasiona trzykrotnie z 1 mL sterylnej wody destylowanej na przemywanie.
   1. Dla każdego przemywania dodaj sterylną wodę, delikatnie mieszaj przez 30 s, pozwól nasionom osiąść przez 30 s, jeśli to konieczne, i całkowicie usuń roztwór przemywający przed dodaniem świeżej sterylnej wody.
9. Zachowaj końcową wodę płuczącą z każdej probówki do kontroli efektywności sterylizacji.
10. Przenieś sterylizowane nasiona do sterylnych naczyń Petriego lub sterylnych probówek, w zależności od tego, czy zostaną one przetworzone natychmiast jako suche nasiona, czy będą używane do kontrolowanego kiełkowania.
    UWAGA: Obsługuj hypochloryn sodu przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej i wykonuj wszystkie kroki zgodnie z zasadami bezpieczeństwa chemicznego instytucji.
    UWAGA: Sekwencja etanol-hypochloryn sodu użyta tutaj została wybrana jako znormalizowana warunki robocze dla nasion pomidorów na podstawie wcześniej zweryfikowanych przepływów sterylizacji. Użyj takich samych warunków sterylizacji dla wszystkich próbek uwzględnionych w porównawczym eksperymencie. Jeśli ocenia się więcej niż jeden reż

Wyniki

Wydajność sterylizacji powierzchni i kontrola skażenia zewnętrznego
Sterylizacja powierzchni przy użyciu znormalizowanych warunków opartych na uprzednio zweryfikowanych metodologiach skutkowała efektywnym zmniejszeniem zewnętrznego skażenia mikrobiologicznego przy zachowaniu odzysku kulturalnych mikroorganizmów z materiału pochodzenia nasion. Ocena płyt z ostatniego wody do płukania nie wykazała wykrywalnego wzrostu kolonii, co wskazuje na efektywne usunięcie mikroorganizmów skojarzonych z powierzchnią w stosowanych warunkach.

Co ważne, brak wzrostu mikroorganizmów w kontrolach płukania nie współtowarzyszył utracie odzyskiwanych mikroorganizmów z suszonych nasion lub homogenatów z kiełkujących nasion. Oznacza to, że zastosowane warunki sterylizacji skutecznie zminimalizowały zewnętrzne skażenie bez uniemożliwienia późniejszego odzysku kulturalnych mikroorganizmów z przetworzonego materiału nasiennego. Razem wzięte, te obserwacje wskazują, że protokół osiągnął zamierzoną równowagę pomiędzy wydajnością sterylizacji a późniejszym odzyskiem mikrobiologicznym.

Ograniczony odzyskiwanie i ograniczona składowa kulturalnych mikrobiot z suchych nasion
Przetworzenie wysterylizowanych suchych, niekiełkujących nasion dawało konsekwentnie niski odzyskiwanie kulturalnych mikroorganizmów wśród replikat biologicznych. Liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) były ogólnie niskie, a płyty kulturowe były zazwyczaj zdominowanie przez ograniczoną liczbę morfotypów, co wskazuje, że tylko ograniczona frakcja mikrobioty skojarzonej z nasionami była łatwo odzyskiwana w tych warunkach.

Ocenie ilościowej dalsze wskazywało, że frakcja kulturalna odzyskana z suchych nasion była ograniczona zarówno pod względem obfitości, jak i szerokości kompozycyjnej. Tylko podzbiór taksonów był konsekwentnie odzyskiwany wśród suchych nasion, podczas gdy kilka innych było nieobecnych lub wykrywanych na bardzo niskich poziomach CFU. Ten wzorzec sugeruje, że bezpośrednie przetwarzanie suchych nasion uchwytuje tylko część kulturalnej mikrobioty skojarzonej z nasionami pomidorów i niedocenia mikroorganizmy, które są początkowo rzadkie, fizjologicznie nieaktywne lub słabo odzyskiwane przed kiełkowaniem.

Ograniczony odzyski obserwowany w suchych nasadach ustanawia ten stan jako pouczającą bazę dla analizy porównawczej. W przypadku braku kiełkowania, kulturalna społeczność skojarzona z nasionami wydaje się zarówno ilościowo ograniczona, jak i uproszczona kompozycyjnie, co wspiera pogląd, że izolacja suchych nasion sama w sobie zapewnia niekompletną reprezentację mikroorganizmów, które mogą stać się bardziej prominentne w trakcie przejścia z nasion do siewek (Rysunek 2 i Rysunek 3).

Rysunek 2: Rozkład CFU na poziomie gatunków w suchych i kiełkujących próbkach. Jednostki tworzące kolonie (CFU) odzyskane z suchych i kiełkujących próbek, pogrupowane według gatunków bakterii. (A) Absolutna obfitość CFU na replikat biologiczny. (B) Względna dystrybucja na poziomie gatunków jako procent całkowitej liczby CFU. Kolory reprezentują poszczególne gatunki bakterii. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Względna proporcja odzyskanych CFU przypisanych do poszczególnych taksonów w suchych nasadach i kiełkujących siewkach. Złożone słupki pokazują względny wkład każdego odzyskanego taksonu w całkowitą liczbę CFU wykrytych w próbkach suchych nasion i kiełkujących siewek. Wykres przedstawia proporcjonalny rozkład poszczególnych taksonów uwzględnionych w analizie porównawczej dla każdego stanu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kilkowanie promuje zwiększony odzyski mikrobiologiczny i szersze przedstawienie kompozycyjne
Kontrole kiełkowanie wysterylizowanych nasion było związane ze zwiększonym odzyskiem mikrobiologicznym. Liczby CFU uzyskane z kiełkujących siewek były wyższe niż te uzyskane z suchych nasion, co wskazuje na zwiększoną kulturalność po kiełkowaniu. Jednakże ten wzrost nie był jednolity dla wszystkich odzyskanych taksonów, lecz towarzyszył mu znaczny przesunięcie w kompozycji kulturalnej społeczności.

Oprócz zwiększonego całkowitego odzysku, kiełkujące próbki wykazywały szerszy zakres morfotypów kolonii niż próbki z suchych nasion. Płyty pochodzące od kiełkujących siewek

Dyskusja

Przedstawione tutaj wyniki pokazują, że integracja standaryzowanej sterylizacji powierzchni z kontrolowanym kiełkowaniem nasion zapewnia solidne ramy dla kulturomicznej izolacji mikrobioty związanej z nasionami. Kluczowym wynikiem tego protokołu jest zdolność do zbilansowania skutecznego usuwania zewnętrznych zanieczyszczeń z zachowaniem endogennych populacji mikroorganizmów. Bilans ten jest krytyczny w badaniach opartych na hodowlaniach, gdzie zbyt rygorystyczna sterylizacja może zmniejszyć odzyskiwanie mikroorganizmów, podczas gdy niewystarczająca sterylizacja może wprowadzeć stronniczość poprzez proliferację mikroorganizmów epifitycznych^6,16. Zamiast definiować uniwersalnie optymalne warunki sterylizacji, ten protokół przyjmuje podejście oparte na wcześniej zweryfikowanych metodykach, które można dostosować w zależności od cech nasion i celów eksperymentu⁶. Wyniki te wskazują, że standaryzowane warunki zastosowane tutaj zminimalizowały zewnętrzne zanieczyszczenia, zachowując odzyskiwanie hodowlanymi mikroorganizmów.

Nasienia stanowią krytyczne punkt wejścia dla mikrobioty związanej z roślinami, pełniąc rolę zbiorników mikroorganizmów, które mogą wpływać na rozwój roślin od najwcześniejszych etapów wzrostu i przyczyniać się do montażu mikrobiomu w cyklu życia roślin^1,2,3. Ułamek tych mikroorganizmów może być przekazywany pionowo i utrzymywać się przez pokolenia, co sugeruje, że mikrobiota związana z nasionami może odgrywać istotną rolę w sprawności roślin i wczesnym ustanawianiu się^4,5. Centralnym odkryciem tego badania jest to, że kontrolowane kiełkowanie znacząco zmienia odzyskiwanie hodowlanymi mikroorganizmów związanych z nasionami z równoważnych zbiorczych replikat biologicznych. W porównaniu z suchymi, niekiełkującymi nasionami, kiełkujące sadzonki dawały wyższe liczby CFU i szersze przedstawienie kompozycyjne hodowlanymi taksonami. Co ważniejsze, kiełkowanie doprowadziło do zauważalnych zmian w strukturze społeczności opartej na CFU, przy czym niektóre taksony stały się znacznie wzbogacone, inne zmniejszyły się, a jeszcze inne utrzymały podobne odzyskiwanie na poziomie rodzaju, podczas gdy przechodziły zauważalną restrukturyzację wewnętrzną na poziomie gatunku. Wyniki te wskazują, że kiełkowanie nie tylko zwiększa całkowitą rekolekcję mikroorganizmów, ale selektywnie kształtuje hodowlany społeczność podczas przejścia z nasion do sadzonek, zgodnie z poprzednimi obserwacjami, że mikroorganizmy związane z nasionami mogą pozostawać w stanie uśpienia lub słabo reprezentowane w suchych nasionach i stawać się bardziej wykrywalne podczas kiełkowania^2,18.

Ta restrukturyzacja związana z kiełkowaniem prawdopodobnie odzwierciedla fizjologiczne zmiany, które zachodzą podczas wczesnego rozwoju sadzonek, w tym wchłanianie wody, aktywację metaboliczną i mobilizację składników odżywczych¹⁸. Te procesy mogą stymulować proliferację i aktywność mikroorganizmów i mogą ułatwiać przejście mikroorganizmów związanych z nasionami z stanu uśpienia, niskiej obfitości lub słabo odzyskiwalnych do wykrywalnej populacji hodowlanymi^8,9,15. W tym kontekście kiełkowanie można uznać za krytyczne okno ekologiczne, w którym populacje mikroorganizmów współdziałają z rośliną żywicielem i przyczyniają się do wczesnych interakcji roślina-mikroorganizm. W niniejszym badaniu taksony takie jak Stutzerimonas, Priestia i Stenotrophomonas wykazały wyraźne wzbogacenie po kiełkowaniu, co potwierdza przydatność tego przepływu pracy do odzyskiwania mikroorganizmów związanych z wczesnym rozwojem sadzonek. Jednocześnie dane pokazują również, że wzorce na poziomie rodzaju mogą maskować znaczne wewnętrzne zmiany, jak to jest zilustrowane przez Paenibacillus, w którym całkowite odzyskiwanie CFU na poziomie rodzaju pozostało stabilne, podczas gdy skład gatunkowy zmienił się znacząco między warunkami suchymi a kiełkującymi. Ta różnica jest ważna, ponieważ wskazuje, że zmiany mikrobioty związane z kiełkowaniem mogą zachodzić zarówno między rodzajami, jak i wewnątrz rodzajów, a interpretacja na pojedynczym poziomie taksonomicznym może pominąć biologicznie istotne restrukturyzacje.

Mikroorganizmy związane z nasionami wykazano, że wpływają na kiełkowanie i rozwój sadzonek poprzez mechanizmy, w tym produkcję fitohormonów, mobilizację składników odżywczych i tłumienie patogenów^4,5,13. W tym kontekście, taksony odzyskane za pomocą tego protokołu mogą obejmować mikroorganizmy o potencjalnym znaczeniu dla wczesnego ustanawiania się roślin. Jednakże obecna metoda jest zaprojektowana do odzyskiwania hodowlanymi mikroorganizmów związanych z przejściem z nasion do sadzonek i sama w so

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	Sigma-Aldrich	01916-500G	Składnik agaru LB; 15 g/L.
Autoklaw	Lab1st	SV120H	Służy do sterylizacji instrumentów/materiałów lub walidacji sterylizacji.
Zestaw do ekstrakcji DNA bakterii	Promocell	PK-MB708-206-100	Ekstrakcja DNA
Ustawienia do liczenia/rejestrowania kolonii	OCS	B079Y5W57N	Potrzebne do rejestrowania CFU, morfotypów i różnic między płytkami; w manuskrypcie nie określono licznika/modelu.
Fiołki do kriokonserwacji	Sigma-Aldrich	Z359033	Zakładany do przechowywania szczepów glicerynowych w -80 °C; nie zostały wymienione bezpośrednio, ale są potrzebne do etapu konserwacji.
System rejestracji izolacji cyfrowych	Nie określono w manuskrypcie	Nie dotyczy	Służy do rejestracji meta danych izolacji: pochodzenie, replika, warunki, leczenie sterylizacyjne, data izolacji, środowisko płytkowe, morfologia, status identyfikacji.
Etanol	VWR	83813440	Służy do przygotowania 70% v/v roztworu etanolu do sterylizacji powierzchni nasion.
Papier filtracyjny	Fisher Scientific	11718772	Opcjonalne alternatywne podłoże do kiełkowania.
Pincety/szczypce	Sigma-Aldrich	930229	Służą do przenoszenia nasion i zbierania wykiełkowanych sadzonek.
Zestaw do ekstrakcji DNA genomowego	PromoCell	PK-MB708-206-100	Służy do ekstrakcji DNA genomowego z oczyszczonych kultur bakteryjnych; dokładny zestaw/metoda nie została określona.
Glicerol, sterylny 80%	VWR	24388364	Mieszany 1:1 v/v z kulturą płynną do przygotowania kriostocku.
Kopuła przepływu laminarnego Bio48	Faster	LAB-CAP-22	Wymagana do aseptycznego obchodzenia się z nasionami, transferów sterylizacyjnych i przygotowania sterylnych materiałów.
Medium agar LB	VWR	846495000	Standardowe medium stosowane do porównawczej hodowliwania; na litr: 10 g tryptyzy, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl, 15 g agaru.
Rurki mikrowirówkowe	Ratiolab	RATI5615000	Służą do sterylizacji nasion i przetwarzania próbek.
Medium MS	Sigma	M0404-10L	Wspomniane jako sterylne podłoże do kiełkowania w hodowli wolnej od bakterii.
NZYTaq II 2× Master mix	Nzytech	MB35803	Mieszanka PCR do amplifikacji
Parafilm	Parafilm/Merck	HS234526A	Służy do uszczelniania płytek kiełkowych, zmniejszając jednocześnie zakażenie.
Miszki Petriego	Labbox	PDIP-E9N-500	Służą do ustawienia do kiełkowania, nakładania i obsługi wysterylizowanych nasion.
Phytoagar	Duchefa Biochemie	9002-18-0	Wspomniane jako opcjonalne alternatywne sterylne podłoże do kiełkowania.
Zestaw pipet i końcówek	Merck	EP3123000918-1EA	Służą do usuwania roztworów sterylizacyjnych, mycia, rozcieńczania i nakładania.
Medium agar R2A	HI-MEDIA	M1743-500G	Opcjonalne dodatkowe medium do rozszerzonych przepływów kulturowych.
Chlorku sodu, NaCl	Fisher Chemical	10040460	Służy do przygotowania sterylnego 0,45% NaCl do homogenizacji i rozcieńczeń szeregowych; jest również częścią medium LB.
Podchloryn sodu	Carlo Erba	370323	Służy do przygotowania 20% v/v roztworu podchlorynu sodu do sterylizacji powierzchni nasion. Materiał żrący; wymaga środków ochrony osobistej.
Sterylne jednorazowe tłuczki	Eppendorf	EP0030120973	Służą do homogenizacji suchych nasion i wykiełkowanych sadzonek.
Mikser wirowy	Fisher Scientific	15901137	Służy do resuspendowania komórek mikrobiowych z homogenatów.