Izolacja mikrobioty związanej z nasionami pomidora poprzez kontrolowane kiełkowanie i hodowle porównawcze

Podsumowanie

Ten protokół łączy standaryzowaną sterylizację powierzchni nasion z kontrolowaną kiełkowaniem, aby umożliwić powtarzalne izolację mikrobioty związanej z nasionami pomidora podczas przejścia od nasiona do sadzonki. Podejście to poprawia odzyskiwanie hodowanych mikroorganizmów, które są niedostatecznie reprezentowane w suchych nasionach i wspiera porównawcze badania kulturowe podczas wczesnego rozwoju sadzonek.

Streszczenie

Sterylizacja powierzchniowa jest krytycznym, ale często nieoptymalizowanym etapem w badaniach mających na celu izolację mikroorganizmów związanych z nasionami, ponieważ zbyt surowocie traktowanie może zmniejszać lub zniekształcać endogenne populacje mikrobiomu. Ten protokół przedstawia powtarzalne podejście do izolacji hodowanych mikrobiomów związanych z nasionami pomidorów przy użyciu warunków sterylizacji powierzchniowej opartych na uprzednio zweryfikowanych metodologiach, w połączeniu z kontrolowaną kiełkowaniem nasion. Zamiast definiować uniwersalnie optymalne traktowanie sterylizacyjne, podejście to stosuje standaryzowane warunki, które można dostosować według cech nasion, minimalizując jednocześnie stronniczość i zachowując endogenne populacje mikrobiomu.

Aby zwiększyć odzyskiwanie hodowanych mikroorganizmów związanych z przejściem z nasion do siewek, protokół obejmuje kontrolowany etap kiełkowania przed izolacją mikrobiomu. W przeciwieństwie do konwencjonalnych podejść opartych na maceratowaniu suchych, niekiełkujących nasion, kontrolowane kiełkowanie promuje aktywację mikroorganizmów podczas przejścia z nasion do siewek w sterylnych warunkach. Porównawcze analizy jednostek tworzących kolonie (CFU) ekwiwalencyjnych replikat biologicznych, z których każda składa się ze zbiorczego materiału z 3–5 suchych nasion lub 3–5 kiełkujących siewek, ujawniły zauważalną zmianę w hodowanych społecznościach po kiełkowaniu. Rodzaje, które były słabo reprezentowane w suchych nasionach, wzbogaciły się po kiełkowaniu, podczas gdy inne taksony, które były bardziej obfite w suchych nasionach, zmniejszyły swoją względną reprezentację, co wspiera badania nad wczesnymi interakcjami roślina-mikrob w trakcie etapu rozwoju siewek.

W różnych replikatach biologicznych, rodzaje w tym Stutzerimonas, Stenotrophomonas oraz Priestia były konsekwentnie wzbogacone wśród izolaci pochodzących z kiełkujących siewek, podczas gdy Paenibacillus pozostawał obfity w różnych warunkach, ale wykazywał zauważalne zmiany w składzie na poziomie gatunków. Integrując standaryzowane warunki sterylizacji z kontrolowanym kiełkowaniem i porównawczą analizą materiału suchego i kiełkującego, ten protokół dostarcza solidnej i powtarzalnej ramy dla kulturowej izolacji mikrobiomu związanego z nasionami, o potencjalnym funkcjonalnym znaczeniu w wczesnym rozwoju siewek, i wspiera badania nad wczesnymi interakcjami roślina-mikrob w trakcie etapu rozwoju siewek.

Wprowadzenie

Nasiona kryją różnorodne społeczności drobnoustrojów składające się z bakterii i grzybów związanych zarówno z tkankami wewnętrznymi, jak i powierzchniami zewnętrznymi^1,2,3. Mikroorganizmy te są coraz częściej uznawane za integralne składniki biologii roślin, ponieważ mogą one wpływać na rozwój rośliny od najwcześniejszych etapów, w tym na kiełkowanie, rozwój siewek oraz reakcje na stresy biotyczne i abiotyczne^1,2,3. Z perspektywy ekologicznej nasiona pełnią funkcję nie tylko propagul rozprzestrzeniających rośliny, ale także rezerwuarów inokulum drobnoustrojowego, co czyni je kluczowym punktem wyjścia do zrozumienia, w jaki sposób mikrobiomy związane z roślinami są inicjowane i utrzymywane w całym cyklu życiowym rośliny^1,2,3.

Mikroorganizmy związane z nasionami mogą stanowić pierwsze inokulum mikrobiologiczne, z którym styka się wyrastająca roślina, a tym samym mogą przyczyniać się do formowania mikrobiomu podczas przejścia z fazy nasiona do siewki^1,3,4. To wczesne inokulum może wpływać na społeczności mikrobiologiczne, które następnie kolonizują korzenie i inne części rośliny, co ma konsekwencje dla zakorzenienia się rośliny i późniejszych interakcji między rośliną a mikroorganizmami^1,4. Ponadto część mikrobioty nasion może być przekazywana pionowo poprzez struktury rozrodcze, takie jak kwiaty, zalążki i pyłek, co pozwala populacjom mikrobiologicznym przetrwać przez kolejne pokolenia roślin^4,5. Ta ciągłość międzypokoleniowa sugeruje, że niektóre mikroorganizmy przenoszone przez nasiona mogą w stały sposób przyczyniać się do kondycji i adaptacji rośliny.

Pod względem funkcjonalnym mikroorganizmy związane z nasionami mogą wpływać na kondycję gospodarza poprzez kilka mechanizmów, w tym produkcję fitohormonów, związków przeciwdrobnoustrojowych i innych aktywnych biologicznie metabolitów, które modulują rozwój roślin lub hamują rozwój konkurentów i patogenów^5,6,7. Populacje drobnoustrojów przenoszone przez nasiona zdają się również współistnieć dzięki różnicowaniu wykorzystania zasobów i partycjonowaniu ekologicznemu, co sugeruje, że nasiono stanowi środowisko selektywne, a nie pasywny zbiornik różnorodności mikrobiologicznej⁷. Wspólnie wyniki te wspierają tezę, że nasiona goszczą populacje drobnoustrojów, które mogą wpływać na wczesny rozwój roślin i stanowią kandydatów do dalszej charakterystyki funkcjonalnej^2,3,5,7.

Aby zbadać mikroorganizmy związane z nasionami w sposób funkcjonalnie informatywny i eksperymentalnie wykonalny, konieczne jest odzyskanie żywych populacji drobnoustrojów z materiału nasiennego. W tym kontekście izolacja mikrobiologiczna umożliwia dostęp do żywych mikroorganizmów, które mogą być następnie scharakteryzowane eksperymentalnie i ocenione w dalszych analizach istotnych dla interakcji roślina–mikrob. Jest to szczególnie ważne w systemach nasiennych, gdzie mikroorganizmy związane z nasionami mogą przyczyniać się do wczesnego zakorzenienia się rośliny i stanowić kandydatów do przesiewania funkcjonalnego oraz przyszłego zastosowania praktycznego.

Odzyskiwanie mikroorganizmów związanych z nasionami jest niezwykle wrażliwe na procedury przygotowania próbek, w szczególności na sterylizację powierzchniową, przetwarzanie tkanek oraz stadium rozwojowe pobranego materiału. Wrażliwość ta jest szczególnie istotna w systemach nasiennych, ponieważ biomasa mikrobiologiczna jest często niska, a niewielkie różnice proceduralne mogą silnie wpływać zarówno na liczbę jednostek tworzących kolonie, jak i na skład izolatów. Wśród tych zmiennych sterylizacja powierzchniowa jest jednym z najbardziej krytycznych i najtrudniejszych do zoptymalizowania etapów. Sterylizacja jest niezbędna w celu ograniczenia zanieczyszczeń epifitycznych przed izolacją mikrobiologiczną, jednak nadmierna ekspozycja na środki sterylizujące może obniżyć żywotność lub zdolność do hodowli mikroorganizmów endogennych, podczas gdy niewystarczająca sterylizacja może doprowadzić do dominacji taksonów związanych z powierzchnią w późniejszych kulturach^8,9,10. W związku z tym celem sterylizacji nie jest maksymalizacja ekspozycji chemicznej, lecz zastosowanie najłagodniejszej obróbki, która skutecznie hamuje zanieczyszczenia pochodzące z powierzchni, zachowując jednocześnie możliwość odzyskania mikroorganizmów wewnętrznych^5,11.

Ponieważ efektywność sterylizacji zależy od gatunku rośliny, struktury tkanki, właściwości łupiny nasion oraz towarzyszącej im społeczności mikrobowej, protokoły powinny być dobierane spośród wcześniej zwalidowanych metodologii, a następnie ostrożnie adaptowane do badanego układu^8,12,13. W materiałach o niskiej biomasie, takich jak nasiona pomidora, równowaga ta jest szczególnie istotna: nadmierna sterylizacja może gwałtownie zmniejszyć odzysk mikroorganizmów, natomiast niewystarczająca sterylizacja zwiększa prawdopodobieństwo, że szybko rosnące zanieczyszczenia powierzchniowe zdominują uzyskane izolaty. Z tego powodu efektywność sterylizacji powinna być rutynowo weryfikowana, a nie przyjmowana za pewnik. Wysiew końcowej wody płuczącej stanowi praktyczną kontrolę pozostałego zanieczyszczenia zewnętrznego, jednak kontrolę tę należy zawsze interpretować łącznie z odzyskiem mikroorganizmów z homogenatów nasion lub siewek. Protokół, który daje sterylne kontrole płukania, ale niewielki lub żaden odzysk wewnętrznej mikrobioty, może być nieodpowiedni, gdy celem jest porównawcza izolacja drobnoustrojów, a nie maksymalna dekontaminacja^6,8,10,14.

W związku z tym, aby porównania były miarodajne, wymagana jest ścisła standaryzacja procedur. W próbkach o niskiej biomasie niespójności w płukaniu, przenoszeniu, homogenizacji, rozcieńczaniu, wysiewaniu lub inkubacji mogą zmienić zarówno całkowitą odzyskaną liczbę drobnoustrojów, jak i pozorną reprezentację poszczególnych taksonów. Jest to szczególnie istotne przy porównywaniu materiału suchego i wykiełkowanego, gdzie różnice metodologiczne mogą zostać łatwo pomylone ze zmianami biologicznymi.

Głównym ograniczeniem wielu protokołów mikrobiologicznych dotyczących nasion jest to, że opierają się one wyłącznie na suchych, niekiełkujących nasionach jako materiale wyjściowym. Chociaż pozwala to na uzyskanie przydatnej wartości bazowej dla frakcji mikrobiologicznej obecnej przed aktywacją nasion, może to prowadzić do niedoszacowania mikroorganizmów, które są w stanie uśpienia, metabolicznie nieaktywne, poddane stresowi lub początkowo występują przy niskiej liczności względnej^2,15.

W stanie suchym nasiona stanowią fizjologicznie uśpione środowisko, w którym zarówno tkanki gospodarza, jak i towarzyszące im mikroorganizmy mogą pozostawać stosunkowo nieaktywne. W konsekwencji populacje drobnoustrojów wyizolowane bezpośrednio z suchych nasion mogą nie w pełni reprezentować te, które stają się łatwiej możliwe do odzyskania po rozpoczęciu kiełkowania.

Podczas kiełkowania nasion zachodzi pobór wody, reaktywacja metaboliczna, mobilizacja składników odżywczych oraz reorganizacja tkanek, co zmienia lokalne środowisko dostępne dla powiązanych z nimi mikroorganizmów^11,16. Zmiany te mogą stymulować wzrost drobnoustrojów, zmieniać relatywną reprezentację populacji mikrobiologicznych oraz ułatwiać wykrywanie lub izolację taksonów, które wcześniej występowały rzadko lub były słabo odzyskiwane z suchych nasion. Dodatkowo wyłonienie się korzenia zakotwiczenia tworzy nowy przedział roślinny, który może sprzyjać proliferacji i redystrybucji drobnoustrojów, co sprawia, że przejście od nasiona do siewki jest szczególnie informacyjnym etapem dla analiz mikrobiologicznych^1,17.

Z tego powodu równoległe przetwarzanie suchych nasion i wykiełkowanych siewek zapewnia bardziej informacyjny projekt doświadczalny niż analiza samych suchych nasion. Suche nasiona ustanawiają punkt odniesienia dla populacji zdolnych do hodowli obecnych przed aktywacją, podczas gdy materiał wykiełkowany pozwala na porównawczą ocenę taksonów, które stają się łatwiej odzyskiwalne podczas wczesnego rozwoju. Takie podejście jest szczególnie użyteczne, gdy celem jest nie tylko skatalogowanie odzyskiwalnych mikroorganizmów, ale także zidentyfikowanie taksonów związanych z przejściem z nasiona do siewki oraz priorytetyzacja izolatów do dalszej charakterystyki (Rycina 1).

Rysunek 1: Koncepcyjny i proceduralny przegląd porównawczego schematu izolacji. (A) Koncepcyjna reprezentacja stanu suchego nasiona pomidora przed kiełkowaniem. (B) Koncepcyjna reprezentacja stanu wykiełkowanego nasiona pomidora podczas przejścia z nasiona w siewkę. (C) Schematyczny przebieg protokołu, obejmujący sterylizację powierzchni nasion, ocenę kontrolną płukania, bezpośrednią obróbkę suchych nasion lub kontrolowane kiełkowanie, homogenizację połączonych powtórzeń biologicznych, rozcieńczenia seryjne i wysiewanie, ilościowe oznaczenie na podstawie CFU, odzyskiwanie izolatów, identyfikację taksonomiczną oraz analizę porównawczą materiału suchego i wykiełkowanego. Krytyczne punkty kontrolne wyróżnione w schemacie obejmują wydajność sterylizacji, równoważne powtórzenia biologiczne oraz spójność wysiewania i analizy CFU. Panele A i B zostały przygotowane jako koncepcyjne ilustracje wspomagane przez AI wyłącznie w celu wizualnej reprezentacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Ponieważ protokół ma na celu porównanie odzyskiwania drobnoustrojów z materiału suchego i wykiełkowanego, niezbędna jest ścisła spójność metodologiczna. Wszystkie porównania należy przeprowadzać z użyciem tej samej partii nasion, identycznych warunków sterylizacji, tych samych pożywek oraz równoważnych procedur rozcieńczania, wysiewania i inkubacji. Bez takiego poziomu standaryzacji pozorne różnice między próbkami suchymi a wykiełkowanymi mogą odzwierciedlać zmienność techniczną, a nie biologicznie istotne wzbogacenie. Jest to szczególnie ważne w procesach izolacji, gdzie odzyskana frakcja jest kształtowana zarówno przez próbkę biologiczną, jak i przez selektywne efekty samej procedury eksperymentalnej^4,15.

Równie niezbędne są powtórzenia biologiczne. Taksony o niskiej liczności mogą różnić się między partiami nasion, a odzysk drobnoustrojów z próbek o niskiej biomasie jest z natury stochastyczny, nawet w ściśle kontrolowanych warunkach. W celu uzyskania wiarygodnego porównania zaleca się wykonanie co najmniej pięciu niezależnych powtórzeń biologicznych dla każdego wariantu. W niniejszym schemacie pracy każde powtórzenie biologiczne składa się z materiału połączonego z 3–5 suchych nasion lub 3–5 wykiełkowanych siewek, przetworzonych jako jedna próbka. Ponadto wszystkie czynności po sterylizacji powinny być wykonywane w warunkach aseptycznych, aby zminimalizować wtórne zanieczyszczenia i zachować interpretowalność otrzymanego zestawu izolatów.

Czas trwania kiełkowania należy również starannie dobrać. Musi on być wystarczająco długi, aby umożliwić wyłonienie się korzenia zakiełkowego i wczesny rozwój siewki, ale nie na tyle przedłużony, aby późniejszy wzrost rośliny wprowadził dodatkową złożoność ekologiczną niezwiązaną z bezpośrednim przejściem z nasiona w siewkę. W przypadku pomidora okres kiełkowania do 5 dni w warunkach sterylnych zapewnia praktyczne okno czasowe, w którym siewka pozostaje ściśle powiązana ze środowiskiem nasiona, podczas gdy może już zachodzić wczesna aktywacja i redystrybucja drobnoustrojów. Spójne ramy czasowe we wszystkich eksperymentach są niezbędne, ponieważ różnice w stadium rozwoju mogą same w sobie wpływać na wzorce odzyskiwania drobnoustrojów. Niniejszy schemat postępowania jest najbardziej odpowiedni do porównawczego odzyskiwania hodowlanych mikrobiot z systemów nasion o niskiej biomasie, gdy celem jest ocena przesunięć związanych z kiełkowaniem w standaryzowanych warunkach. Jest on mniej odpowiedni do bezpośredniej oceny całkowitej różnorodności mikrobiomu nasion lub dla systemów eksperymentalnych, w których wymagane są podejścia niezależne od hodowli w celu uchwycenia szerszej społeczności mikrobiologicznej.

Celem niniejszego protokołu jest zapewnienie powtarzalnych ram dla izolacji kulturowalnej mikrobioty związanej z nasionami pomidora poprzez zintegrowanie zestandaryzowanej sterylizacji powierzchniowej z kontrolowanym kiełkowaniem nasion. Metoda ta umożliwia analizę porównawczą suchych nasion i wykiełkowanych siewek przy użyciu równoważnych powtórzeń biologicznych, z których każde składa się z połączonego materiału z 3–5 suchych nasion lub 3–5 wykiełkowanych siewek, w celu oceny zależnych od kiełkowania zmian w odzyskiwaniu jednostek tworzących kolonie (CFU) oraz w składzie taksonomicznym. Poprzez minimalizację błędów sterylizacji i promowanie odzyskiwania mikroorganizmów podczas przejścia z nasiona w siewkę, podejście to ułatwia izolację mikroorganizmów o potencjalnym znaczeniu funkcjonalnym podczas wczesnego rozwoju siewek i wspiera dalsze badania nad wczesnymi interakcjami między rośliną a mikroorganizmami.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników, pożywek i materiałów sterylnych

1. Przygotować 70% (v:v) roztwór etanolu, używając sterylnej wody destylowanej.
2. Przygotować 20% (v:v) roztwór roboczy z komercyjnego wybielacza zawierającego 5% dostępnego podchlorynu sodu poprzez rozcieńczenie 20 mL wybielacza w 80 mL sterylnej wody destylowanej.
3. Przygotować sterylną wodę destylowaną do etapów płukania.
4. Przygotować sterylną 0,45% NaCl do homogenizacji i rozcieńczeń seryjnych i konsekwentnie stosować ten roztwór w całym procesie.
5. Przygotować pożywkę agarową Luria Bertani (LB) (na litr: 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu z drożdży, 10 g NaCl i 15 g agaru) i wcześniej przygotować płytki w warunkach sterylnych.
6. Zsterylizować wszystkie instrumenty, które będą miały kontakt z nasionami lub siewkami po sterylizacji, w tym pincety, tłuczki, rozdzielacze, nożyczki i statywy na probówki, poprzez autoklawowanie lub zwalidowaną obróbkę aseptyczną.
7. Przed rozpoczęciem pracy z nasionami przygotować sterylne szalki Petriego, probówki, końcówki do pipet i płytki z pożywką wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza.
   UWAGA: Ponieważ biomasa mikrobowa związana z nasionami może być niewielka, ważne jest zminimalizowanie niepotrzebnego czasu manipulacji i przygotowanie wszystkich materiałów przed rozpoczęciem sterylizacji. Opóźnienia między zabiegami chemicznymi, płukaniem, wysiewaniem lub przygotowaniem do kiełkowania mogą wprowadzić zmienność w odzysku. W innych systemach eksperymentalnych można stosować alternatywne bufory sterylne, jednak w ramach jednego eksperymentu porównawczego należy zachować jeden rodzaj buforu. W rozszerzonych procesach kulturomicznych można uwzględnić dodatkowe pożywki, takie jak Reasoner's 2A (R2A) lub pożywki selektywne, ale w opisanym tutaj protokole porównawczym jako standardową pożywkę zastosowano agar LB.

2. Wybór i przydział nasion

1. W miarę możliwości do każdego eksperymentu należy używać nasion z jednej partii nasion pomidora.
   UWAGA: W reprezentatywnym schemacie postępowania opisanym w niniejszym materiale, w każdym eksperymencie stosowano nasiona pomidora z jednej partii odmiany cv. Money Maker.
2. Nasiona należy poddać inspekcji wizualnej i odrzucić nasiona uszkodzone, widocznie pęknięte lub zdeformowane.
3. Nasiona należy podzielić na grupy eksperymentalne wymagane do badania. W minimalnym zakresie nasiona należy przydzielić do: izolacji suchych nasion po sterylizacji oraz do kiełkowania z późniejszą izolacją siewek.
4. Jeśli planowane jest przetestowanie więcej niż jednego warunku sterylizacji, nasiona należy przypisać losowo do poszczególnych zabiegów sterylizacji, aby uniknąć błędu systematycznego wynikającego z wielkości lub stanu nasion.
   UWAGA: Wszystkie dalsze porównania są bardziej wiarygodne, gdy opierają się na tej samej partii nasion przetwarzanej równolegle. Schemat postępowania można dostosować do innych genotypów lub odmian pomidora, jednak każde porównanie w ramach jednego eksperymentu powinno być przeprowadzane z wykorzystaniem jednej partii nasion przetwarzanej równolegle.

3. Sterylizacja powierzchniowa nasion pomidora

1. Przenieś 3–5 nasion do każdej sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza.
2. Dodaj 1 mL 70% (v:v) etanolu do każdej probówki, aby w pełni zanurzyć nasiona.
3. Inkubuj probówki przez 5 min, delikatnie mieszając za pomocą rotatora do probówek z prędkością 25 rpm.
4. Całkowicie usuń etanol za pomocą sterylnej pipety.
5. Natychmiast dodaj 1 mL 20% (v:v) roztworu roboczego podchlorynu sodu do każdej probówki, aby w pełni zanurzyć nasiona.
6. Inkubuj probówki przez 10 min, delikatnie wstrząsając za pomocą rotatora do probówek z prędkością 25 rpm.
7. Całkowicie usuń roztwór podchlorynu sodu za pomocą sterylnej pipety.
8. Przemyj nasiona trzykrotnie, używając 1 mL sterylnej wody destylowanej na każde płukanie.
   1. Przy każdym płukaniu dodaj sterylną wodę, delikatnie mieszaj przez 30 s, w razie potrzeby odczekaj 30 s aż nasiona opadną, a następnie całkowicie usuń roztwór płuczący przed dodaniem świeżej sterylnej wody.
9. Zachowaj wodę z ostatniego płukania z każdej probówki w celu kontroli efektywności sterylizacji.
10. Przenieś wysterylizowane nasiona do sterylnych szalek Petriego lub sterylnych probówek, w zależności od tego, czy będą one przetwarzane natychmiast jako nasiona suche, czy wykorzystane do kontrolowanego kiełkowania.
    OSTROŻNIE: Podchloryn sodu należy obsługiwać przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej i wykonywać wszystkie czynności zgodnie z instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa chemicznego.
    UWAGA: Zastosowana tutaj sekwencja etanol-podchloryn sodu została wybrana jako znormalizowany warunek roboczy dla nasion pomidora na podstawie wcześniej zwalidowanych procedur sterylizacji. Stosuj te same warunki sterylizacji dla wszystkich próbek uwzględnionych w eksperymencie porównawczym. Jeśli oceniano więcej niż jeden reżim sterylizacji, przetwarzaj każdą próbę równolegle i oceniaj efektywność sterylizacji niezależnie dla każdego warunku. Zminimalizuj czas między ostatnim płukaniem a dalszym przetwarzaniem, aby zmniejszyć zmienność w odzyskiwaniu drobnoustrojów.

4. Weryfikacja skuteczności sterylizacji

1. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia szeregowe końcowej wody do płukania w sterylnym 0,45% NaCl, przenosząc 100 µL wody do płukania do 900 µL rozcieńczalnika i powtarzając ten krok sekwencyjnie aż do rozcieńczenia 10^-4. Wysiać 100 µL każdego rozcieńczenia na agar LB, stosując tę samą metodę wysiewu, która została zastosowana do homogenatów suchych nasion i wykiełkowanych siewek.
2. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C przez 24–48 h.
3. Po inkubacji sprawdzić płytki pod kątem wzrostu kolonii.
4. Odnotować obecność lub brak kolonii dla każdego rozcieńczenia. W przypadku obecności kolonii zapisać stopień rozcieńczenia, przybliżoną liczbę kolonii oraz widoczną morfologię kolonii.
   UWAGA: Przez cały czas trwania eksperymentu należy stosować tę samą objętość wysiewu i format wysiewu, aby umożliwić bezpośrednie porównanie między kontrolami płukania a próbkami biologicznymi. Jeśli na płytkach z niezycieńczoną wodą do płukania lub najniższym rozcieńczeniem kontrolnym nie wykryto kolonii, próbkę należy zapisać jako nie wykazującą wykrywalnego wzrostu w zastosowanych warunkach hodowli.

5. Obróbka suchych (niewykiełkowanych) nasion

1. Przenieś połączone zestawy 3–5 wysterylizowanych suchych nasion, odpowiadające jednej replice biologicznej, do sterylnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL zawierających 1 mL sterylnego 0,45% NaCl.
2. Uhomogenizuj nasiona za pomocą sterylnego jednorazowego tłuczka, aż tkanki nasion zostaną widocznie rozbite i nie pozostaną żadne nienaruszone struktury nasion.
3. Mieszaj homogenat na vortexie przez 30 s, aby równomiernie resuspenderować komórki mikrobiologiczne.
4. Przygotuj 10-krotne rozcieńczenia seryjne homogenatu w sterylnym 0,45% NaCl, przenosząc 100 µL homogenatu do 900 µL rozcieńczalnika dla pierwszego rozcieńczenia i powtarzając ten sam stosunek sekwencyjnie aż do 10^-6.
5. Wysiej 100 µL wybranych rozcieńczeń na agar LB metodą posiewu powierzchniowego.
6. Inkubuj płytki w temperaturze 28 °C przez 24–72 h.
7. Wybierz płytki odpowiadające zakresowi rozcieńczeń, które dają odizolowane i możliwe do policzenia kolonie, w celu późniejszej oceny CFU i izolacji szczepów.
8. Zanotuj całkowitą liczbę kolonii, widoczne morfotypy kolonii oraz wszelkie różnice w wzorcu wzrostu pomiędzy replikami.
   UWAGA: Przetwarzanie suchych nasion należy przeprowadzić równolegle z próbkami wykiełkowanych siewek, stosując to samo medium hodowlane, schemat rozcieńczeń, objętość posiewu oraz warunki inkubacji. Agar LB został użyty jako standardowe medium dla opisanego tutaj porównawczego schematu postępowania. W rozszerzonych protokołach izolacji można zastosować dodatkowe media, gdy wymagana jest szersza izolacja taksonów wolno rosnących.

6. Aksenic kiełkowanie wysterylizowanych nasion

1. Umieść sterylne nasiona na sterylnym podłożu do kiełkowania, takim jak płytki z agarem Murashige i Skoog (MS).
2. Rozmieść nasiona równomiernie, aby uniknąć kontaktu między wyrastającymi siewkami.
3. Uszczelnij płytki laboratoryjną folią uszczelniającą lub równoważnym materiałem, który ogranicza kontaminację zewnętrzną, umożliwiając jednocześnie normalne kiełkowanie.
4. Inkubuj płytki w pozycji poziomej w temperaturze 25 °C w ciemności.
5. Pozostaw nasiona do wykiełkowania w warunkach sterylnych, aż do momentu, gdy wyraźnie widoczny będzie wczesny rozwój korzenia głównego; w eksperymencie reprezentatywnym odpowiadało to 5 dniom inkubacji.
6. Regularnie sprawdzaj płytki pod kątem oznak kontaminacji, nieprawidłowego kiełkowania lub nadmiernej kondensacji.
   UWAGA: Warunki kiełkowania powinny być stałe dla wszystkich powtórzeń. Zróżnicowanie czasu kiełkowania lub stadium siewki może zmienić odzysk mikroorganizmów niezależnie od badanego efektu. W dostosowanych procedurach można zastosować inne sterylne podłoża do kiełkowania, w tym płytki z Phytoagarem lub sterylną wilgotną papierową filtracyjną, pod warunkiem, że podłoże pozostanie stałe w obrębie każdego eksperymentu. W zależności od pojemnika do kiełkowania podczas inkubacji można zastosować alternatywne orientacje płytek, jednak orientacja powinna być stała w ramach eksperymentu. (Punkt przerwy) W razie potrzeby wykiełkowane siewki można krótko przechowywać w temperaturze 4 °C przed przetwarzaniem, jednak zaleca się niezwłoczne przystąpienie do dalszych etapów.

7. Izolacja mikroorganizmów z wykiełkowanych siewek

1. Zebrać wykiełkowane siewki za pomocą sterylnej pęsety wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza.
2. Przenieść połączony materiał z 3–5 wykiełkowanych siewek, odpowiadający jednej powtórce biologicznej, do sterylnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL.
3. Do każdej probówki dodać 1 mL sterylnego 0,45% NaCl.
4. Dokładnie zhomogenizować połączony materiał z siewek za pomocą sterylnego jednorazowego tłuczka, upewniając się, że uwzględniono zarówno wyrastający korzeń, jak i powiązaną z nim pozostałą tkankę nasienną, aż do widocznego rozbicia tkanek.
5. Wymieszać homogenat na wortexie przez 30 s, aby uwolnić i równomiernie resuspenderć komórki mikrobiologiczne.
6. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne homogenatu w sterylnym 0,45% NaCl, przenosząc 100 µL homogenatu do 900 µL rozcieńczalnika dla pierwszego rozcieńczenia i powtarzając ten sam stosunek sekwencyjnie do 10^-4.
7. Wyasiać 100 µL wybranych rozcieńczeń na agar LB, stosując metodę kropelkową w sektorach.
8. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C przez 24–72 h. Odnotować całkowitą liczbę kolonii, widoczne morfotypy kolonii oraz różnice w stosunku do próbek z suchych nasion.
   UWAGA: Jedną powtórkę biologiczną definiuje się jako połączony materiał z 3–5 wykiełkowanych siewek; wszystkie powtórki należy przetwarzać równolegle, stosując ten sam schemat rozcieńczeń, objętość wysiewu, pożywkę oraz warunki inkubacji. W homogenacie należy uwzględnić zarówno pozostałą tkankę nasienną, jak i wyrastający korzeń, aby zachować spójność między próbkami wykiełkowanych siewek.

8. Liczenie kolonii i odzyskiwanie izolatów

1. Po inkubacji wybierz płytki z rozcieńczeniami, które zawierają policzalne i dobrze odseparowane kolonie. Do szacowania CFU należy używać płytek zawierających od 30 do 300 kolonii.
2. Policz kolonie na wybranych płytkach i oblicz CFU na jedną powtórzoną próbkę biologiczną, korzystając z następującego wzoru:
   ​CFU na powtórzenie = (liczba kolonii × czynnik rozcieńczenia)/objętość posiewu (mililitry)
   1. Jeśli użyto więcej niż jednej płytki z tego samego rozcieńczenia, przed zastosowaniem wzoru oblicz średnią liczbę kolonii dla tego rozcieńczenia.
3. Zapisz morfologię kolonii, korzystając ze zstandardyzowanych opisów, obejmujących rozmiar, kształt, kolor, brzeg, wypukłość i przezroczystość.
4. Wybierz kolonie do dalszej izolacji. Aby zminimalizować błąd próbkowania, wybierz wszystkie rozróżnialne morfotypy w przypadku małej liczby kolonii lub wybierz losowo wiele kolonii z różnych płytek w przypadku ich dużej liczby.
5. Przesiej wybrane kolonie na świeże płytki z agarem LB, aby uzyskać czyste kultury.
6. Powtarzaj przesiewanie do momentu, aż każdy izolat wykaże jednolitą morfologię kolonii na płytce.
   UWAGA: Wyraźnie określ, czy wartości CFU są podane na jedną powtórzoną próbkę biologiczną, na jednostkę biomasy, czy z zastosowaniem innego podejścia do normalizacji. Jeśli zastosowano dodatkowe metody normalizacji, w tym normalizację w oparciu o biomasę, szczegółowo opisz metodę obliczeń w sekcji Analiza danych.

9. Przechowywanie oczyszczonych izolatów

1. Zaszczep czyste kolonie do płynnej pożywki LB i inkubuj do momentu uzyskania widocznego wzrostu.
2. Wymieszaj kulturę (1:1, v:v) ze sterylnym 80% glicerolem zgodnie ze standardową praktyką mikrobiologiczną.
3. Przechowuj zapasy kriogeniczne w temperaturze -80 °C.
4. Prowadź cyfrową dokumentację dla każdego izolatu, zawierającą pochodzenie próbki, numer powtórzenia, stan (suche nasiono lub wykiełkowana siewka), zastosowaną sterylizację, datę izolacji, rodzaj pożywki na płytce, morfologię kolonii oraz status późniejszej identyfikacji.
   UWAGA: Dokładne metadane izolatów są niezbędne, jeśli wzorce wzbogacenia mają zostać powiązane z etapem nasion, zastosowaną obróbką lub powtórzeniem biologicznym.

10. Identyfikacja molekularna izolatów

1. Wyizolować genomowe DNA z oczyszczonych kultur bakteryjnych, używając zestawu do ekstrakcji bakteryjnego DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Amplifikować bakteryjny gen 16S rRNA, wykorzystując albo hiperzmienny region V5-V8, albo niemal pełną długość genu 16S rRNA.
   1. Do amplifikacji regionu V5–V8 (~700 bp) użyć starterów 799F (5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′) oraz 1392R (5′- ACGGGCGGTGTGTRC-3′).
   2. Do amplifikacji niemal pełnej długości genu 16S rRNA (~1500 bp) użyć starterów 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) oraz 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′).
   3. Przygotować każdą reakcję polimerazy łańcuchowej (PCR) w końcowej objętości 25 µL, używając PCR master mix, 0.4 µM każdego startera oraz 1 µL matrycowego DNA.
   4. Przeprowadzić reakcję w termocyklerze zgodnie z następującymi warunkami: denaturacja wstępna przy 95 °C przez 2 min; 40 cykli obejmujących denaturację przy 95 °C przez 3 s, przyłączanie przy 45 °C przez 30 s oraz elongację przy 72 °C przez 2 min; a następnie elongacja końcowa przy 72 °C przez 7 min. W każdym przebiegu PCR uwzględnić kontrolę bez matrycy.
3. Zweryfikować produkty PCR za pomocą elektroforezy na 1% żelu agarozowym i zwizualizować amplikony, korzystając z systemu elektroforezy żelowej i obrazowania.
4. Oczyścić produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania produktów PCR zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie przekazać oczyszczone amplikony do sekwencjonowania metodą Sangera.
5. Przeprowadzić kontrolę jakości, przyciąć i złożyć uzyskane sekwencje w razie potrzeby.
   1. Porównać każdą sekwencję z bazą nukleotydową National Center for Biotechnology Information (NCBI) za pomocą narzędzia BLASTn (ustawienia Megablast dla sekwencji o wysokim podobieństwie).
   2. Użyć najlepiej dopasowanego trafienia do przypisania taksonomii. Przypisać izolaty do poziomu rodzaju, gdy najlepsze trafienie wykazuje odpowiedni stopień pokrycia dopasowania i co najmniej 94.5% tożsamości sekwencji.
   3. Stosować wstępne przypisanie na poziomie gatunku tylko wtedy, gdy najlepsze trafienie wykazuje co najmniej 98.7% tożsamości sekwencji, wysokie pokrycie zapytania oraz brak sprzecznych wyników wśród najwyższych trafień dla gatunków blisko spokrewnionych.
   4. Jeśli wielokrotna amplifikacja nie powiedzie się lub jakość sekwencji będzie niewystarczająca, oznaczyć izolat jako niezidentyfikowany (Unidentified). Ponieważ samo podobieństwo 16S rRNA może nie pozwolić na rozróżnienie blisko spokrewnionych gatunków bakterii, traktować wszystkie przypisania na poziomie gatunku jako tymczasowe i potwierdzić je analizami filogenetycznymi lub genomowymi, jeśli jest to wymagane.
6. Zgłosić tożsamość izolatu na najwyższym możliwym poziomie rozdzielczości taksonomicznej. Wykorzystać te identyfikacje do walidacji grup opartych na morfologii oraz do wyboru reprezentatywnych izolatów do dalszych analiz genomicznych i funkcjonalnych.
   UWAGA: Ten etap identyfikacji molekularnej ma na celu wsparcie klasyfikacji izolatów i wybór reprezentatywnych szczepów. Nie należy go używać do wnioskowania o strukturze społeczności lub ilościowych wzorcach liczebności w różnych wariantach badawczych.

11. Analiza danych

1. Przeprowadź eksperyment z co najmniej pięcioma powtórzeniami biologicznymi dla każdego stanu.
   ​UWAGA: W tym schemacie każde powtórzenie biologiczne składa się z materiału połączonego z 3–5 suchych nasion lub 3–5 wykiełkowanych siewek przetworzonych jako jedna próbka.
2. Dla każdego stanu określ ilościowo: (i) całkowity odzysk CFU, (ii) liczbę widocznych morfotypów kolonii, (iii) liczbę oczyszczonych izolatów oraz (iv) skład taksonomiczny odzyskanej hodowlanej mikrobioty na poziomie rodzaju, a w stosownych przypadkach na poziomie gatunku.
3. Porównaj próbki suchych nasion i wykiełkowanych siewek, aby ocenić zmiany w całkowitym odzysku i składzie taksonomicznym zależne od kiełkowania.
4. Oblicz względną reprezentację każdego taksonu jako procent całkowitych odzyskanych CFU dla każdego stanu. Oblicz krotność zmian (fold changes), korzystając z bezwzględnych wartości CFU.
5. Przeanalizuj dane ilościowe przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy statystycznej (np. GraphPad Prism [v11.0.2]). Przedstaw dane jako średnią ± odchylenie standardowe (SD).
   1. W przypadku porównań parzystych między próbkami suchych nasion i wykiełkowanych siewek zastosuj obustronny test t Studenta, gdy dane spełniają założenia normalności.
   2. Gdy założenia te nie są spełnione, zastosuj test U Manna-Whitneya. Różnice uznaj za istotne statystycznie przy p < 0.05.
6. Wyraźnie zaznacz, czy każda przedstawiona wartość odpowiada bezwzględnej liczbie CFU, względnym procentom pochodzącym z CFU, czy krotności zmian obliczonej z bezwzględnych wartości CFU.
   UWAGA: Przez całe badanie stosuj te same kryteria obliczeniowe, aby umożliwić bezpośrednie porównanie próbek suchych nasion i wykiełkowanych siewek. Prezentując skład taksonomiczny, wskaż wyraźnie, czy wartości są przedstawione na poziomie rodzaju, czy na poziomie gatunku.

12. Krytyczne punkty kontroli jakości i rozwiązywanie problemów

1. Sterylny końcowy płukanie samo w sobie nie dowodzi, że wybrany reżim sterylizacji jest optymalny dla celu eksperymentalnego. Należy ograniczyć zanieczyszczenia zewnętrzne, zachowując jednocześnie odzysk drobnoustrojów zdolnych do hodowli z frakcji wewnętrznej lub ściśle związanej z nasionem. Wyniki kontroli płukania należy interpretować łącznie z odzyskiem mikrobiologicznym z homogenatów suchych nasion i wykiełkowanych siewek.
2. Niski odzysk zarówno z próbek suchych, jak i wykiełkowanych może wskazywać na nadmierną sterylizację, zbyt agresywną homogenizację, niewłaściwe warunki hodowli lub opóźnione przetworzenie próbek. W takich przypadkach należy zweryfikować, czy czasy sterylizacji były stosowane konsekwentnie, potwierdzić, że rozdrabnianie tkanek było wystarczające, ale nie nadmierne, oraz upewnić się, że rozcieńczanie, wysiewanie i inkubacja zostały przeprowadzone niezwłocznie i w tych samych warunkach dla wszystkich próbek.
3. Wysoki poziom zanieczyszczeń w kontrolach płukania lub szybki przerost niewielkiej liczby typów kolonii mogą wskazywać na niewystarczającą sterylizację lub zanieczyszczenie wprowadzone podczas manipulacji po sterylizacji. W takich przypadkach należy przeanalizować czas sterylizacji, etapy płukania, techniki aseptyczne oraz organizację materiałów wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza przed powtórzeniem eksperymentu.
4. Różnice między próbkami suchymi a wykiełkowanymi należy interpretować biologicznie tylko wtedy, gdy stadium kiełkowania, struktura powtórzeń biologicznych, pożywka, schemat rozcieńczeń, objętość wysiewu i warunki inkubacji zostały ustandaryzowane w całym eksperymencie.
5. Podczas pracy z materiałem nasion o niskiej biomasie pozorne brak określonych taksonów w jednym wariancie może odzwierciedlać niedostateczną liczbę próbek, a nie rzeczywisty brak. Z tego powodu należy przeprowadzać konsekwentne przetwarzanie powtórzeń oraz identyfikację na poziomie izolatów, aby rzetelnie interpretować zmiany związane z kiełkowaniem.

13. Przechowywanie próbek do innych metod

1. Po weryfikacji skuteczności sterylizacji i przed wysiewaniem, przenieś dodatkową porcję 200 µL każdego homogenatu z suchych nasion lub wykiełkowanych siewek do sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
2. Każdą probówkę opisz, podając typ próbki, numer replikatu biologicznego, warunki traktowania oraz datę pobrania.
3. Natychmiast zamroź porcje i przechowuj je w temperaturze -80 °C do czasu wykorzystania w dalszych analizach.
4. Przechowywany materiał z homogenatu wykorzystaj do uzupełniających metod, takich jak analizy oparte na DNA, badania mikroskopowe lub eksperymenty potwierdzające, wymagające tego samego replikatu biologicznego.
   UWAGA: Przechowuj porcje przed rozcieńczeniem seryjnym i wysiewaniem, aby zachować pierwotny skład homogenatu. Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania poprzez przygotowanie oddzielnych porcji w przypadku planowania wielu dalszych analiz.

Wyniki

Przeprowadzenie sterylizacji powierzchniowej i kontrola kontaminacji zewnętrznej
Sterylizacja powierzchniowa w znormalizowanych warunkach, oparta na wcześniej zwalidowanych metodologiach, doprowadziła do skutecznej redukcji zewnętrznej kontaminacji mikrobiologicznej, przy jednoczesnym zachowaniu odzysku drobnoustrojów zdolnych do hodowli z materiału pochodzącego z nasion. Posiew końcowej wody płuczącej nie wykazał wykrywalnego wzrostu kolonii, co wskazuje na skuteczne usunięcie mikroorganizmów zwią...

Dyskusja

Przedstawione tutaj wyniki pokazują, że integracja standaryzowanej sterylizacji powierzchni z kontrolowanym kiełkowaniem nasion zapewnia solidne ramy dla kulturomicznej izolacji mikrobioty związanej z nasionami. Kluczowym wynikiem tego protokołu jest zdolność do zbilansowania skutecznego usuwania zewnętrznych zanieczyszczeń z zachowaniem endogennych populacji mikroorganizmów. Bilans ten jest krytyczny w badaniach opartych na hodowlaniach, gdzie zbyt rygorystyczna sterylizacja może zmniejszyć odzyskiwanie mikroorganizmów,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	Sigma-Aldrich	01916-500G	Składnik agaru LB; 15 g/L.
Autoklaw	Lab1st	SV120H	Służy do sterylizacji instrumentów/materiałów lub walidacji sterylizacji.
Zestaw do ekstrakcji DNA bakterii	Promocell	PK-MB708-206-100	Ekstrakcja DNA
Ustawienia do liczenia/rejestrowania kolonii	OCS	B079Y5W57N	Potrzebne do rejestrowania CFU, morfotypów i różnic między płytkami; w manuskrypcie nie określono licznika/modelu.
Fiołki do kriokonserwacji	Sigma-Aldrich	Z359033	Zakładany do przechowywania szczepów glicerynowych w -80 °C; nie zostały wymienione bezpośrednio, ale są potrzebne do etapu konserwacji.
System rejestracji izolacji cyfrowych	Nie określono w manuskrypcie	Nie dotyczy	Służy do rejestracji meta danych izolacji: pochodzenie, replika, warunki, leczenie sterylizacyjne, data izolacji, środowisko płytkowe, morfologia, status identyfikacji.
Etanol	VWR	83813440	Służy do przygotowania 70% v/v roztworu etanolu do sterylizacji powierzchni nasion.
Papier filtracyjny	Fisher Scientific	11718772	Opcjonalne alternatywne podłoże do kiełkowania.
Pincety/szczypce	Sigma-Aldrich	930229	Służą do przenoszenia nasion i zbierania wykiełkowanych sadzonek.
Zestaw do ekstrakcji DNA genomowego	PromoCell	PK-MB708-206-100	Służy do ekstrakcji DNA genomowego z oczyszczonych kultur bakteryjnych; dokładny zestaw/metoda nie została określona.
Glicerol, sterylny 80%	VWR	24388364	Mieszany 1:1 v/v z kulturą płynną do przygotowania kriostocku.
Kopuła przepływu laminarnego Bio48	Faster	LAB-CAP-22	Wymagana do aseptycznego obchodzenia się z nasionami, transferów sterylizacyjnych i przygotowania sterylnych materiałów.
Medium agar LB	VWR	846495000	Standardowe medium stosowane do porównawczej hodowliwania; na litr: 10 g tryptyzy, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl, 15 g agaru.
Rurki mikrowirówkowe	Ratiolab	RATI5615000	Służą do sterylizacji nasion i przetwarzania próbek.
Medium MS	Sigma	M0404-10L	Wspomniane jako sterylne podłoże do kiełkowania w hodowli wolnej od bakterii.
NZYTaq II 2× Master mix	Nzytech	MB35803	Mieszanka PCR do amplifikacji
Parafilm	Parafilm/Merck	HS234526A	Służy do uszczelniania płytek kiełkowych, zmniejszając jednocześnie zakażenie.
Miszki Petriego	Labbox	PDIP-E9N-500	Służą do ustawienia do kiełkowania, nakładania i obsługi wysterylizowanych nasion.
Phytoagar	Duchefa Biochemie	9002-18-0	Wspomniane jako opcjonalne alternatywne sterylne podłoże do kiełkowania.
Zestaw pipet i końcówek	Merck	EP3123000918-1EA	Służą do usuwania roztworów sterylizacyjnych, mycia, rozcieńczania i nakładania.
Medium agar R2A	HI-MEDIA	M1743-500G	Opcjonalne dodatkowe medium do rozszerzonych przepływów kulturowych.
Chlorku sodu, NaCl	Fisher Chemical	10040460	Służy do przygotowania sterylnego 0,45% NaCl do homogenizacji i rozcieńczeń szeregowych; jest również częścią medium LB.
Podchloryn sodu	Carlo Erba	370323	Służy do przygotowania 20% v/v roztworu podchlorynu sodu do sterylizacji powierzchni nasion. Materiał żrący; wymaga środków ochrony osobistej.
Sterylne jednorazowe tłuczki	Eppendorf	EP0030120973	Służą do homogenizacji suchych nasion i wykiełkowanych sadzonek.
Mikser wirowy	Fisher Scientific	15901137	Służy do resuspendowania komórek mikrobiowych z homogenatów.