Izolacja mikrobioty związanej z nasionami pomidora poprzez kontrolowane kiełkowanie i hodowle porównawcze

Podsumowanie

Ten protokół łączy standaryzowaną sterylizację powierzchni nasion z kontrolowaną kiełkowaniem, aby umożliwić powtarzalne izolację mikrobioty związanej z nasionami pomidora podczas przejścia od nasiona do sadzonki. Podejście to poprawia odzyskiwanie hodowanych mikroorganizmów, które są niedostatecznie reprezentowane w suchych nasionach i wspiera porównawcze badania kulturowe podczas wczesnego rozwoju sadzonek.

Streszczenie

Sterylizacja powierzchniowa jest krytycznym, ale często nieoptymalizowanym etapem w badaniach mających na celu izolację mikroorganizmów związanych z nasionami, ponieważ zbyt surowocie traktowanie może zmniejszać lub zniekształcać endogenne populacje mikrobiomu. Ten protokół przedstawia powtarzalne podejście do izolacji hodowanych mikrobiomów związanych z nasionami pomidorów przy użyciu warunków sterylizacji powierzchniowej opartych na uprzednio zweryfikowanych metodologiach, w połączeniu z kontrolowaną kiełkowaniem nasion. Zamiast definiować uniwersalnie optymalne traktowanie sterylizacyjne, podejście to stosuje standaryzowane warunki, które można dostosować według cech nasion, minimalizując jednocześnie stronniczość i zachowując endogenne populacje mikrobiomu.

Aby zwiększyć odzyskiwanie hodowanych mikroorganizmów związanych z przejściem z nasion do siewek, protokół obejmuje kontrolowany etap kiełkowania przed izolacją mikrobiomu. W przeciwieństwie do konwencjonalnych podejść opartych na maceratowaniu suchych, niekiełkujących nasion, kontrolowane kiełkowanie promuje aktywację mikroorganizmów podczas przejścia z nasion do siewek w sterylnych warunkach. Porównawcze analizy jednostek tworzących kolonie (CFU) ekwiwalencyjnych replikat biologicznych, z których każda składa się ze zbiorczego materiału z 3–5 suchych nasion lub 3–5 kiełkujących siewek, ujawniły zauważalną zmianę w hodowanych społecznościach po kiełkowaniu. Rodzaje, które były słabo reprezentowane w suchych nasionach, wzbogaciły się po kiełkowaniu, podczas gdy inne taksony, które były bardziej obfite w suchych nasionach, zmniejszyły swoją względną reprezentację, co wspiera badania nad wczesnymi interakcjami roślina-mikrob w trakcie etapu rozwoju siewek.

W różnych replikatach biologicznych, rodzaje w tym Stutzerimonas, Stenotrophomonas oraz Priestia były konsekwentnie wzbogacone wśród izolaci pochodzących z kiełkujących siewek, podczas gdy Paenibacillus pozostawał obfity w różnych warunkach, ale wykazywał zauważalne zmiany w składzie na poziomie gatunków. Integrując standaryzowane warunki sterylizacji z kontrolowanym kiełkowaniem i porównawczą analizą materiału suchego i kiełkującego, ten protokół dostarcza solidnej i powtarzalnej ramy dla kulturowej izolacji mikrobiomu związanego z nasionami, o potencjalnym funkcjonalnym znaczeniu w wczesnym rozwoju siewek, i wspiera badania nad wczesnymi interakcjami roślina-mikrob w trakcie etapu rozwoju siewek.

Wprowadzenie

Nasiona są siedliskiem zróżnicowanych społeczności mikrobiologicznych składających się z bakterii i grzybów związanych zarówno z tkankami wewnętrznymi, jak i powierzchniami zewnętrznymi^1,2,3. Mikroorganizmy te są coraz częściej uznawane za integralne elementy biologii roślin, ponieważ mogą one wpływać na kondycję rośliny już od najwcześniejszych etapów rozwoju, w tym na kiełkowanie, zakorzenianie się siewek oraz odpowiedzi na stresy biotyczne i abiotyczne^1,2,3. Z perspektywy ekologic....

Protokół

1. Przygotowanie odczynników, pożywek i materiałów sterylnych

1. Przygotować 70% (v:v) roztwór etanolu, używając sterylnej wody destylowanej.
2. Przygotować 20% (v:v) roztwór roboczy z komercyjnego wybielacza zawierającego 5% dostępnego podchlorynu sodu poprzez rozcieńczenie 20 mL wybielacza w 80 mL sterylnej wody destylowanej.
3. Przygotować sterylną wodę destylowaną do etapów płukania.
4. Przygotować sterylną 0,45% NaCl do homogenizacji i rozcieńczeń seryjnych i konsekwentnie stosować ten roztwór w całym procesie.
5. Przygotować pożywkę agarową Luria Bertani (LB) (na litr: 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu z drożdży, ....

Wyniki

Przeprowadzenie sterylizacji powierzchniowej i kontrola kontaminacji zewnętrznej
Sterylizacja powierzchniowa w znormalizowanych warunkach, oparta na wcześniej zwalidowanych metodologiach, doprowadziła do skutecznej redukcji zewnętrznej kontaminacji mikrobiologicznej przy jednoczesnym zachowaniu możliwości odzyskania drobnoustrojów zdolnych do hodowli z materiału pochodzącego z nasion. Posiew końcowej wody płuczącej nie wykazał wykrywalnego wzrostu kolonii, co wskazuje na skuteczne usunięcie drobnoust.......

Dyskusja

Przedstawione tutaj wyniki pokazują, że integracja standaryzowanej sterylizacji powierzchni z kontrolowanym kiełkowaniem nasion zapewnia solidne ramy dla kulturomicznej izolacji mikrobioty związanej z nasionami. Kluczowym wynikiem tego protokołu jest zdolność do zbilansowania skutecznego usuwania zewnętrznych zanieczyszczeń z zachowaniem endogennych populacji mikroorganizmów. Bilans ten jest krytyczny w badaniach opartych na hodowlaniach, gdzie zbyt rygorystyczna sterylizacja może zmniejszyć odzyskiwanie mikroorganizmów,.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	Sigma-Aldrich	01916-500G	Składnik agaru LB; 15 g/L.
Autoklaw	Lab1st	SV120H	Służy do sterylizacji instrumentów/materiałów lub walidacji sterylizacji.
Zestaw do ekstrakcji DNA bakterii	Promocell	PK-MB708-206-100	Ekstrakcja DNA
Ustawienia do liczenia/rejestrowania kolonii	OCS	B079Y5W57N	Potrzebne do rejestrowania CFU, morfotypów i różnic między płytkami; w manuskrypcie nie określono licznika/modelu.
Fiołki do kriokonserwacji	Sigma-Aldrich	Z359033	Zakładany do przechowywania szczepów glicerynowych w -80 °C; nie zostały wymienione bezpośrednio, ale są potrzebne do etapu konserwacji.
System rejestracji izolacji cyfrowych	Nie określono w manuskrypcie	Nie dotyczy	Służy do rejestracji meta danych izolacji: pochodzenie, replika, warunki, leczenie sterylizacyjne, data izolacji, środowisko płytkowe, morfologia, status identyfikacji.
Etanol	VWR	83813440	Służy do przygotowania 70% v/v roztworu etanolu do sterylizacji powierzchni nasion.
Papier filtracyjny	Fisher Scientific	11718772	Opcjonalne alternatywne podłoże do kiełkowania.
Pincety/szczypce	Sigma-Aldrich	930229	Służą do przenoszenia nasion i zbierania wykiełkowanych sadzonek.
Zestaw do ekstrakcji DNA genomowego	PromoCell	PK-MB708-206-100	Służy do ekstrakcji DNA genomowego z oczyszczonych kultur bakteryjnych; dokładny zestaw/metoda nie została określona.
Glicerol, sterylny 80%	VWR	24388364	Mieszany 1:1 v/v z kulturą płynną do przygotowania kriostocku.
Kopuła przepływu laminarnego Bio48	Faster	LAB-CAP-22	Wymagana do aseptycznego obchodzenia się z nasionami, transferów sterylizacyjnych i przygotowania sterylnych materiałów.
Medium agar LB	VWR	846495000	Standardowe medium stosowane do porównawczej hodowliwania; na litr: 10 g tryptyzy, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl, 15 g agaru.
Rurki mikrowirówkowe	Ratiolab	RATI5615000	Służą do sterylizacji nasion i przetwarzania próbek.
Medium MS	Sigma	M0404-10L	Wspomniane jako sterylne podłoże do kiełkowania w hodowli wolnej od bakterii.
NZYTaq II 2× Master mix	Nzytech	MB35803	Mieszanka PCR do amplifikacji
Parafilm	Parafilm/Merck	HS234526A	Służy do uszczelniania płytek kiełkowych, zmniejszając jednocześnie zakażenie.
Miszki Petriego	Labbox	PDIP-E9N-500	Służą do ustawienia do kiełkowania, nakładania i obsługi wysterylizowanych nasion.
Phytoagar	Duchefa Biochemie	9002-18-0	Wspomniane jako opcjonalne alternatywne sterylne podłoże do kiełkowania.
Zestaw pipet i końcówek	Merck	EP3123000918-1EA	Służą do usuwania roztworów sterylizacyjnych, mycia, rozcieńczania i nakładania.
Medium agar R2A	HI-MEDIA	M1743-500G	Opcjonalne dodatkowe medium do rozszerzonych przepływów kulturowych.
Chlorku sodu, NaCl	Fisher Chemical	10040460	Służy do przygotowania sterylnego 0,45% NaCl do homogenizacji i rozcieńczeń szeregowych; jest również częścią medium LB.
Podchloryn sodu	Carlo Erba	370323	Służy do przygotowania 20% v/v roztworu podchlorynu sodu do sterylizacji powierzchni nasion. Materiał żrący; wymaga środków ochrony osobistej.
Sterylne jednorazowe tłuczki	Eppendorf	EP0030120973	Służą do homogenizacji suchych nasion i wykiełkowanych sadzonek.
Mikser wirowy	Fisher Scientific	15901137	Służy do resuspendowania komórek mikrobiowych z homogenatów.