Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nowatorska metoda biopsji skalpelowej do pobierania złośliwych i niezłośliwych limfocytów u danio pręgowanego

190 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72153

⸱

7 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Division of Pediatric Hematology-Oncology, Department of Pediatrics, Stephenson Cancer Center, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

W tym artykule

Podsumowanie

Nowa metoda biopsji za pomocą skali pozwala na pobieranie komórek białaczki limfoblastycznej z żywych ryb zebrafish. Wyniki pokazują obfitość limfocytów w łuskach ryb typu dzikiego (WT), oraz znacznie zwiększoną ilość limfocytów w łuskach ryb z OLL (ostra białaczka limfoblastyczna). Ta technika umożliwia minimalnie inwazyjne badanie normalnych i złośliwych limfocytów naskórka.

Streszczenie

Rybki zebra (Danio rerio) są potężnym modelem do badania limfopoezy i chłoniaka limfocytów, ponieważ ryby zebra i ludzie mają podobne układy odpornościowe, w tym komórki B i T. Opisano kilka modeli ostrej białaczki limfoblastycznej T-komórek (T-ALL) u ryb zebra, w tym ryby ekspresujące ludzki MYC specyficzny dla limfoblastów (hMYC). Doniesiono, że ryby rag2:hMYC również rozwijają ostrą białaczkę limfoblastyczną B-komórek (B-ALL), co sprawia, że są przydatne do badania obu typów ALL. Ograniczeniem modeli ALL u ryb zebra jest to, że nie istnieją nieszkodliwe metody do seryjnego pobierania próbek ALL. Aby temu zaradzić, opracowałeśmy nową metodę ‘biopsji łuski’ do pobierania komórek ALL z żywych ryb zebra. Jednak wiedza na temat tego, które limfocyty znajdują się w normalnych łuskach ryb zebra, jest niewielka. Dlatego, aby zdefiniować normalne tożsamości limfocytów naskórka, przeprowadziliśmy biopsje łusek na liniach transgennych z oznakowaną limfocytami i bez rag2:hMYC. Za pomocą konwencjonalnej i konfokalnej mikroskopi zbadałyśmy łuski, ujawniając obfitość limfocytów naskórka. Przeanalizowaliśmy również łuski ryb z T- i B-ALL, które wykazały znaczne wzmożenie limfocytów w skupiskowym limfocytów ALL w wielu łuskach. Następnie użyliśmy sortowania komórek aktywowanej fluorescencyjnie (FACS) do oczyszczenia niezłośliwych i ALL limfocytów z łusek na potrzeby badań ex vivo. Analizy cytometryczne przepływowe i ekspresji komórek ALL z łusek lub innych tkanek tej samej ryby wykazały, że ekspresja genów komórek ALL ze łusek przypominała ekspresję komórek ALL w innych miejscach. Policzyliśmy również liczbę normalnych komórek T, B, T-ALL i B-ALL, które można wyodrębnić na jedną łuskę. Ogólnie rzecz biorąc, biopsja łusek zapewnia nietrwały, minimalnie inwazyjny technikę do badania limfocytów naskórka ryb zebra, umożliwiając badania ex vivo, w tym analizy złośliwych próbek.

Wprowadzenie

Funkcja barierowa skóry ssaków i jej role w odporności są ustalone1,2,3. Limfocyty ssaków przyczyniają się do odporności skóry, przy czym cytotoksyczne limfocyty T znajdują się w naskórku, a B, T i naturalne komórki zabójcze (NK) są obecne w skórze właściwej1,3,4,5. Rybki zebra mają te limfocyty, z powierzchniowymi immunoglobulinami, receptorami limfocytów T, receptorami głównego układu zgodności tkankowej (MHC), cytokinami i ich receptorami oraz innymi cząsteczkami immunologicznymi, dzieląc więc większość cech immunologicznych ssaków6,7,8,9. Ostatnie badania nad skórą i łuskami rybek zebra wykazały różne populacje limfocytów skóry, w tym komórki T i B nabłonkowe10,11, oraz sieć limfoidów ułatwiającą przemieszczanie się limfocytów T i obserwację antygenów12. Podobieństwa między limfocytami ryb kostnoszkieletowych i ssaków sprawiają, że D. rerio jest potężnym modelem in vivo do badania limfopoezy, funkcji limfocytów i chorób limfoidowych, w tym ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL)8,10,13,14,15,16,17,18,19,20.

Nasze wcześniejsze prace wykazały, że zarówno T-, jak i B-liniowe ALL (T-ALL, B-ALL) powstają w transgennych rybkach zebra rag2:hMYC, co sprawia, że ta linia jest przydatna do badania obu typów ALL13,15,21,22. Główną wadą modeli ALL D. rerio, szczególnie w badaniach ekspresji w czasie i badaniach dotyczących testowania leków, jest brak metod pozyskiwania seryjnych próbek ALL od pojedynczych zwierząt. Poprzednie metody, takie jak pobieranie krwi z okołoorbitalnego żyły, są technicznie trudne ze względu na małą wielkość D. rerio, co sprawia, że seryjne pobieranie krwi jest trudne23. Dlatego większość badaczy niszczy rybki zebra, aby uzyskać komórki ALL. Było to powszechną praktyką w laboratorium i większości laboratoriów w tej dziedzinie, ale wyklucza możliwość przeprowadzania badań podłużnych na żywych zwierzętach. Aby temu zaradzić, ostatnio opisaliśmy nabłonkowe limfocyty T i B w łuskach rybek zebra, które zostały pobrane za pomocą nieniszczącej strategii biopsji łusek10. Inne niedawne badanie wykazało rezerwuar komórek T na/w pobliżu powierzchni rybki zebra, między sąsiednimi łuskami12. D. rerio posiada setki łusek, które szybko się regenerują zaledwie kilka dni po usunięciu24. Razem te odkrycia i cechy wskazują, że łuski rybek zebra są źródłem limfocytów, które nie wymagają niszczenia, umożliwiając badania podłużne na żywych rybach.

Tutaj opisujemy metodę biopsji łusek do pobierania limfocytów naskórkowych rybek zebra od ryb z fluoroforowymi markerami specyficznymi dla limfocytów, z ALL lub bez. Aby badać komórki linii T, użyliśmy dobrze ugruntowanych rybek lck:GFP i podobnej linii lck:mCherry; oba te markery oznaczają komórki T i T-ALL10,13,15,20. Aby badać komórki linii B, użyliśmy transgennych rybek cd79a:GFP i cd79b:GFP z fluorescencyjnie oznaczonymi komórkami B i B-ALL10,13,17. Każda z tych linii umożliwia wizualizację za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i sortowania komórek przez cytometrię przepływową13. Badaliśmy łuski po biopsji, generując wysokorozdzielcze obrazy limfocytów w łuskach, identyfikując ekspresję genów limfocytów naskórkowych za pomocą qRT-PCR, porównując ją z ekspresją limfocytów z innych tkanek limfoidowych tej samej ryby oraz ilościowo oznaczając limfocyty na łuskę za pomocą cytometrii przepływowej/sortowania komórek fluorescencyjnego. Podsumowując, protokół opisuje prostą i praktyczną metodę pozyskiwania limfocytów z żywych rybek zebra, w tym pobieranie próbek od pojedynczych zwierząt podłużnie w wielu punktach czasowych w sekwencji eksperymentu. Ta metoda ma na celu

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt w Uniwersytecie Oklahoma Health Sciences Center (protokoły 24-028-EAH i 25-068-EACHIR). Ten protokół przedstawia podejście do izolowywania i analizowania normalnych i/lub złośliwych limfocytów ze łusek żywych rybek zebrzy, z szczegółami dotyczącymi celu, realizacji i zasad leżących u podstaw tych procedur.

OSTRZEŻENIE: MS-222 jest niebezpiecznym środkiem znieczulającym i musi być przechowywany z odpowiednią odzieżą ochronną (PPE), taką jak rękawiczki laboratoryjne, osłony oczu i fartuch laboratoryjny. Wyrzucaj roztwory MS-222 zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi odpadów chemicznych. Zachowaj ostrożność podczas obsługi igieł i kleszczyków, aby zapobiec obrażeniom ostrymi przedmiotami. Uważaj, że wszystkie próbki biologiczne mogą być potencjalnie niebezpieczne i wyrzucaj odpady zgodnie z instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa biologicznego.

1. Przygotowanie mediów do sortowania

  1. Uzupełnij 1× RPMI 1640 z 1% surowicą wołową (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną.
    UWAGA: RPMI 1640 utrzymuje żywotność limfocytów ex vivo. RPMI 1640 można zastąpić 0,9× PBS. Surowice wołowe (FBS) dostarczają czynników wzrostu, które promują żywotność komórek. Penicylina i streptomycyna ogranicza zanieczyszczenie bakteryjne.
  2. Podziel medium na 1,5 ml mikroprobówki w objętościach 500 μL, przy czym każda probówka jest przeznaczona dla 10-20 łusek. Przechowuj probówki z mediem do sortowania na lodzie.

2. Znieczulenie ryb zebrzy, przesiewanie mikroskopowe fluorescencyjne i obrazowanie

  1. Znieczulić D. rerio z buforowanym 0,02% tricaine methanesulfonate (MS-222) przygotowanym zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami, przy użyciu wody z systemu ryb.
  2. Po uspokojeniu, delikatnie umieść rybę w naczyniu do hodowli komórkowej z wystarczającą ilością wody z systemu (oraz 0,02% MS-222), aby utrzymać wilgotność podczas dalszej obsługi.
  3. Zbadaj i przeprowadź obrazowanie znieczulonych ryb za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, aby wykryć fluorescencje z transgenów. Ten krok identyfikuje fluorescencyjne łuski do biopsji.
    UWAGA: Linie bez fluorescencyjnych transgenów można oglądać za pomocą standardowej mikroskopii świetlnej.
  4. Użyj fluorescencji do identyfikacji limfocytów T (lck:GFP lub lck:mCherry ryby) lub T-ALL (rag2:hMYC + lck:GFP lub lck:mCherry ryby). Komórki linii T są jasno fluorescencyjne w tych liniach; komórki B-ALL są słabo fluorescencyjne w tłach lck:GFP i lck:mCherry13,15,21.
  5. Przesiej ryby z linii B-oznaczonych cd79a:GFP lub cd79b:GFP (z lub bez rag2:hMYC) na komórki B z naskórka i/lub B-ALL, używając GFP do wyboru łusek do biopsji.
  6. Praktykuj pozycjonowanie ryb zebrzy i dostosowywanie ustawień mikroskopu przed biopsją, jeśli pożądane jest obrazowanie
    UWAGA: Obrazowanie i biopsja wymagają 5-7 min znieczulenia za pomocą 0,02% MS-222. Ciągle monitoruj ruch operculum. Jeśli ruch operculum znacząco zwolni lub ustąpi, natychmiast przenieś rybę do systemu wody bez anestetyków i przerwij biopsję. Co 1-2 min podczas obrazowania i biopsji nakładaj ~50-100 μL wody z anestetykami na skórę, operculum i skrzele, aby utrzymać wilgotność powierzchni.

3. Zbieranie i przygotowanie łusek

  1. Aby pozycjonować rybę do biopsji, umieść uspokojeną rybę na boku w naczyniu do hodowli komórkowej.
  2. Aby zapobiec zsuwaniu się ryby podczas biopsji, użyj wilgotnej gąbki z liniowym lub V-kształtnym wycięciem i umieść ją w naczyniu do hodowli komórkowej, aby podtrzymywać rybę.
  3. Alternatywnie, upewnij się, że poziom wody z systemu ledwo pokrywa dno naczynia do hodowli komórkowej (wystarczająco, aby utrzymać wilgotność powierzchni), aby napięcie powierzchniowe mogło ustabilizować rybę.
  4. Okresowo nakładaj ~50-100 μL 0,02% MS-222 przygotowanego w wodzie z systemu na operculum i skrzele, aby utrzymać wilgotność i utrzymać znieczulenie podczas obrazowania i biopsji.
  5. Przeprowadź biopsję za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej, aby wybrać wysoce fluorescencyjne łuski wzbogacone w limfocyty lub komórki ALL.
  6. Zbierz 10-20 sąsiednich łusek z pojedynczego wysoce fluorescencyjnego obszaru, najlepiej w pierwszym lub drugim poziomym opasie

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Postępując zgodnie z powyższymi krokami, poddano dorosłe rybki zebrafish znieczuleniu i przeskanowano je pod mikroskopem w celu wykrycia fluorescencyjnych limfocytów lub ALL. Ryby typu dzikiego (WT) lck:GFP wykazywały fluorescencję głównie w obszarze grasicy, podczas gdy ryby cd79b:GFP przejawiały fluorescencję w okolicy głowy i skrzeli, co jest zgodne z wcześniejszymi obserwacjami10 (Rysunek 1A, po lewej). W przeciwieństwie do nich, podwójnie transg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje nieinwazyjną metodę biopsji łusek w celu pobrania limfocytów naskórka u ryb zebrafish, w tym zarówno niezłośliwych limfocytów, jak i komórek białaczki limfoblastycznej o ostrej postaci (ALL). Zebrafish są dobrze ugruntowanymi modelami dla limfopoezy i nowotworów limfoidalnych, ale większość podejść do pozyskania limfocytów wymaga unieruchomienia i przecinania tkanek, co uniemożliwia przeprowadzanie badań podłużnych na pojedynczych zwierzętach8,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Ameerze Hasan, M.B.B.S., Ph.D., oraz Brashé Wood za ich wkład w ten projekt. Badania były wspierane przez OUHSC Stephenson Cancer Center Pilot Grant Program, Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research (OCASCR), Presbyterian Health Foundation Team Science and Seed Grant Programs oraz W.J. Jones Family Foundation. FACS przez OUHSC Stephenson Cancer Center Molecular Biology and Cytometry Research Core zostało sfinansowane przez NCI Cancer Center Support Grant Award P30 CA225520. To badanie było częściowo wspierane przez fundusze American Cancer Society (ACS-POST-BACC-23-1156971-01-DPBACC). Iman Owens jest stypendystką programu ACS post-baccalaureate "STRONG".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czynniki chemiczne & Materiały eksploatacyjne:
Tricaine methanesulfonate (MS-222)Sigma-AldrichE10521Środek znieczulający
RPMI 1640 mediumThermoFisher11875093Środowisko dla żywotności limfocytów
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442Dla żywotności komórkowej
Penicillin-StreptomycinThermoFisher15140122Ograniczanie zakażenia bakteryjnego
70% ethanolThermoScientificT038181000Do sterylizacji forceps
CellPro 1x PBSVWR104027-280Rozcieńczyć do 0.9x sterylną wodą
Propidium IodideInvitrogenP1304MMPRozróżnianie żywych/martwych komórek do flow/FACS
Cut Goods Misc-Pn; Size: 12 x 12 IN. 35um filter paper
Lab Pak 03-35/16		SefarDo sortowania komórek
Referencja: Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Izolowanie złośliwych i niezłośliwych komórek B z lck:Egfp zebrafish. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019).
Alternatywa dla papieru filtracyjnego: EASYstrainer Cell Sieves, Greiner Bio-OneGreiner89508-342Do sortowania komórek
Eppendorf® Flex-Tubes® Microtubes, 1.5 mlEppendorf®20901-551mikrocentryfużer do sortowania komórek
UltiCare VetRx U-100 Insulin Syringes 3/10cc 31G x 5/16" Half Unit MarkingUltiCare9436Do biopsji skali
100 x 25 mm Deep Petri DishUSA Scientific8609-0625Do biopsji skali
Bel-Art® Disposable PestlesBel-Art® BAF199230001Do dysocjacji skali
E-Z Pik 6-Piece Tweezer SetAven18480EZDo biopsji skali
Corning® microscope slides, frosted one side, one endSigma-AldrichCLS294875X25Do obrazowania
Cover glassesSigma-AldrichC8181Do obrazowania
SlowFade™ Glass Soft-set Antifade Mountant, with DAPIThermoFisherS36920Do montażu skali na szkle
RNeasy Mini Kit Qiagen74104Do ekstrakcji RNA
Urządzenia:
Nikon AZ100 microscope and DS-Qi1MC cameraNikonMikroskop fluorescencyjny & kamera
CFX96 Touch-PCR SystemBio-Rad3600037
CytoFLEXBeckman-CoulterAnalizy cytometrii przepływowej
Leica SP8LeicaMikroskop konfokalny
Oprogramowanie:
Kaluza Analysis software version 2.1Beckman-CoulterAnalizy cytometrii przepływowej
Referencja: https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads
LAS-X software version 3.7.4.23463LeicaMikroskop konfokalny
Referencja: https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/

Bibliografia

  1. Egawa G, Kabashima K. Skin as a peripheral lymphoid organ: revisiting the concept of skin-associated lymphoid tissues. J Invest Dermatol. 2011;131(11):2178–85.
  2. Matejuk A. Skin immunity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2018;66(1):45–54.
  3. Zhang C, Merana GR, Harris-Tryon T, Scharschmidt TC. Skin immunity: dissecting the complex biology of our body's outer barrier. Mucosal Immunol. 2022;15(4):551–61.
  4. Kupper TS, Fuhlbrigge RC. Immune surveillance in the skin: mechanisms and clinical consequences. Nat Rev Immunol. 2004;4(3):211–22.
  5. Lafouresse F, Groom JR. A task force against local inflammation and cancer: lymphocyte trafficking to and within the skin. Front Immunol. 2018;9:2454. doi:10.3389/fimmu.2018.02454
  6. Danilova N, Bussmann J, Jekosch K, Steiner LA. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nat Immunol. 2005;6(3):295–302.
  7. Hansen JD, Landis ED, Phillips RB. Discovery of a unique Ig heavy-chain isotype (IgT) in rainbow trout: implications for a distinctive B cell developmental pathway in teleost fish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(19):6919–24.
  8. Page DM, et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 2013;122(8)–e11.
  9. Sunyer JO. Evolutionary and functional relationships of B cells from fish and mammals: insights into their novel roles in phagocytosis and presentation of particulate antigen. Infect Disord Drug Targets. 2012;12(3):200–12.
  10. Park G, et al. Diverse epithelial lymphocytes in zebrafish revealed using a novel scale biopsy method. J Immunol. 2024;213(12):1902–14.
  11. Zhou Q, et al. Cross-organ single-cell transcriptome profiling reveals macrophage and dendritic cell heterogeneity in zebrafish. Cell Rep. 2023;42(7):112793. doi:10.1016/j.celrep.2023.112793
  12. Robertson TF, et al. A tessellated lymphoid network provides whole-body T cell surveillance in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(20). doi:10.1073/pnas.2301137120
  13. Park G, et al. Zebrafish B cell acute lymphoblastic leukemia: new findings in an old model. Oncotarget. 2020;11(15):1292–305.
  14. Ferrero G, et al. The macrophage-expressed gene (mpeg) 1 identifies a subpopulation of B cells in the adult zebrafish. J Leukoc Biol. 2020;107(3):431–43.
  15. Borga C, et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. 2019;33(2):333–47.
  16. Tian Y, et al. The first wave of T lymphopoiesis in zebrafish arises from aorta endothelium independent of hematopoietic stem cells. J Exp Med. 2017;214(11):3347–60.
  17. Liu X, et al. Zebrafish B cell development without a pre-B cell stage, revealed by CD79 fluorescence reporter transgenes. J Immunol. 2017;199(5):1706–15.
  18. Wan F, et al. Characterization of gamma delta T cells from zebrafish provides insights into their important role in adaptive humoral immunity. Front Immunol. 2016;7:675. doi:10.3389/fimmu.2016.00675
  19. Moore FE, et al. Single-cell transcriptional analysis of normal, aberrant, and malignant hematopoiesis in zebrafish. J Exp Med. 2016;213(6):979–92.
  20. Langenau DM, et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(19):7369–74.
  21. Burroughs-Garcia J, et al. Isolating malignant and non-malignant B cells from lck zebrafish. J Vis Exp. 2019;(144):59191. https://www.jove.com/t/59191/isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish
  22. Borga C, et al. Molecularly distinct models of zebrafish Myc-induced B cell leukemia. Leukemia. 2019;33(2):559–62.
  23. Pugach EK, Li P, White R, Zon L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. 2009;(34):1645. https://www.jove.com/t/1645/retro-orbital-injection-in-adult-zebrafish
  24. Iwasaki M, Kuroda J, Kawakami K, Wada H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 2018;437(2):105–19.
  25. Traver D, et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 2003;4(12):1238–46.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Badania nad rakiemNumer 234Numer 234Wartość pustaNumerlimfocytALLnabłonkibiałaczkanaskórek

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.