Nowa metoda biopsji za pomocą skali pozwala na pobieranie komórek białaczki limfoblastycznej z żywych ryb zebrafish. Wyniki pokazują obfitość limfocytów w łuskach ryb typu dzikiego (WT), oraz znacznie zwiększoną ilość limfocytów w łuskach ryb z OLL (ostra białaczka limfoblastyczna). Ta technika umożliwia minimalnie inwazyjne badanie normalnych i złośliwych limfocytów naskórka.
Artykuł metodologiczny
Nowatorska metoda biopsji skalpelowej do pobierania złośliwych i niezłośliwych limfocytów u danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rybki zebra (Danio rerio) są potężnym modelem do badania limfopoezy i chłoniaka limfocytów, ponieważ ryby zebra i ludzie mają podobne układy odpornościowe, w tym komórki B i T. Opisano kilka modeli ostrej białaczki limfoblastycznej T-komórek (T-ALL) u ryb zebra, w tym ryby ekspresujące ludzki MYC specyficzny dla limfoblastów (hMYC). Doniesiono, że ryby rag2:hMYC również rozwijają ostrą białaczkę limfoblastyczną B-komórek (B-ALL), co sprawia, że są przydatne do badania obu typów ALL. Ograniczeniem modeli ALL u ryb zebra jest to, że nie istnieją nieszkodliwe metody do seryjnego pobierania próbek ALL. Aby temu zaradzić, opracowałeśmy nową metodę ‘biopsji łuski’ do pobierania komórek ALL z żywych ryb zebra. Jednak wiedza na temat tego, które limfocyty znajdują się w normalnych łuskach ryb zebra, jest niewielka. Dlatego, aby zdefiniować normalne tożsamości limfocytów naskórka, przeprowadziliśmy biopsje łusek na liniach transgennych z oznakowaną limfocytami i bez rag2:hMYC. Za pomocą konwencjonalnej i konfokalnej mikroskopi zbadałyśmy łuski, ujawniając obfitość limfocytów naskórka. Przeanalizowaliśmy również łuski ryb z T- i B-ALL, które wykazały znaczne wzmożenie limfocytów w skupiskowym limfocytów ALL w wielu łuskach. Następnie użyliśmy sortowania komórek aktywowanej fluorescencyjnie (FACS) do oczyszczenia niezłośliwych i ALL limfocytów z łusek na potrzeby badań ex vivo. Analizy cytometryczne przepływowe i ekspresji komórek ALL z łusek lub innych tkanek tej samej ryby wykazały, że ekspresja genów komórek ALL ze łusek przypominała ekspresję komórek ALL w innych miejscach. Policzyliśmy również liczbę normalnych komórek T, B, T-ALL i B-ALL, które można wyodrębnić na jedną łuskę. Ogólnie rzecz biorąc, biopsja łusek zapewnia nietrwały, minimalnie inwazyjny technikę do badania limfocytów naskórka ryb zebra, umożliwiając badania ex vivo, w tym analizy złośliwych próbek.
Wprowadzenie
Funkcja barierowa skóry ssaków i jej role w odporności są ustalone1,2,3. Limfocyty ssaków przyczyniają się do odporności skóry, przy czym cytotoksyczne limfocyty T znajdują się w naskórku, a B, T i naturalne komórki zabójcze (NK) są obecne w skórze właściwej1,3,4,5. Rybki zebra mają te limfocyty, z powierzchniowymi immunoglobulinami, receptorami limfocytów T, receptorami głównego układu zgodności tkankowej (MHC), cytokinami i ich receptorami oraz innymi cząsteczkami immunologicznymi, dzieląc więc większość cech immunologicznych ssaków6,7,8,9. Ostatnie badania nad skórą i łuskami rybek zebra wykazały różne populacje limfocytów skóry, w tym komórki T i B nabłonkowe10,11, oraz sieć limfoidów ułatwiającą przemieszczanie się limfocytów T i obserwację antygenów12. Podobieństwa między limfocytami ryb kostnoszkieletowych i ssaków sprawiają, że D. rerio jest potężnym modelem in vivo do badania limfopoezy, funkcji limfocytów i chorób limfoidowych, w tym ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL)8,10,13,14,15,16,17,18,19,20.
Nasze wcześniejsze prace wykazały, że zarówno T-, jak i B-liniowe ALL (T-ALL, B-ALL) powstają w transgennych rybkach zebra rag2:hMYC, co sprawia, że ta linia jest przydatna do badania obu typów ALL13,15,21,22. Główną wadą modeli ALL D. rerio, szczególnie w badaniach ekspresji w czasie i badaniach dotyczących testowania leków, jest brak metod pozyskiwania seryjnych próbek ALL od pojedynczych zwierząt. Poprzednie metody, takie jak pobieranie krwi z okołoorbitalnego żyły, są technicznie trudne ze względu na małą wielkość D. rerio, co sprawia, że seryjne pobieranie krwi jest trudne23. Dlatego większość badaczy niszczy rybki zebra, aby uzyskać komórki ALL. Było to powszechną praktyką w laboratorium i większości laboratoriów w tej dziedzinie, ale wyklucza możliwość przeprowadzania badań podłużnych na żywych zwierzętach. Aby temu zaradzić, ostatnio opisaliśmy nabłonkowe limfocyty T i B w łuskach rybek zebra, które zostały pobrane za pomocą nieniszczącej strategii biopsji łusek10. Inne niedawne badanie wykazało rezerwuar komórek T na/w pobliżu powierzchni rybki zebra, między sąsiednimi łuskami12. D. rerio posiada setki łusek, które szybko się regenerują zaledwie kilka dni po usunięciu24. Razem te odkrycia i cechy wskazują, że łuski rybek zebra są źródłem limfocytów, które nie wymagają niszczenia, umożliwiając badania podłużne na żywych rybach.
Tutaj opisujemy metodę biopsji łusek do pobierania limfocytów naskórkowych rybek zebra od ryb z fluoroforowymi markerami specyficznymi dla limfocytów, z ALL lub bez. Aby badać komórki linii T, użyliśmy dobrze ugruntowanych rybek lck:GFP i podobnej linii lck:mCherry; oba te markery oznaczają komórki T i T-ALL10,13,15,20. Aby badać komórki linii B, użyliśmy transgennych rybek cd79a:GFP i cd79b:GFP z fluorescencyjnie oznaczonymi komórkami B i B-ALL10,13,17. Każda z tych linii umożliwia wizualizację za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i sortowania komórek przez cytometrię przepływową13. Badaliśmy łuski po biopsji, generując wysokorozdzielcze obrazy limfocytów w łuskach, identyfikując ekspresję genów limfocytów naskórkowych za pomocą qRT-PCR, porównując ją z ekspresją limfocytów z innych tkanek limfoidowych tej samej ryby oraz ilościowo oznaczając limfocyty na łuskę za pomocą cytometrii przepływowej/sortowania komórek fluorescencyjnego. Podsumowując, protokół opisuje prostą i praktyczną metodę pozyskiwania limfocytów z żywych rybek zebra, w tym pobieranie próbek od pojedynczych zwierząt podłużnie w wielu punktach czasowych w sekwencji eksperymentu. Ta metoda ma na celu
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt w Uniwersytecie Oklahoma Health Sciences Center (protokoły 24-028-EAH i 25-068-EACHIR). Ten protokół przedstawia podejście do izolowywania i analizowania normalnych i/lub złośliwych limfocytów ze łusek żywych rybek zebrzy, z szczegółami dotyczącymi celu, realizacji i zasad leżących u podstaw tych procedur.
OSTRZEŻENIE: MS-222 jest niebezpiecznym środkiem znieczulającym i musi być przechowywany z odpowiednią odzieżą ochronną (PPE), taką jak rękawiczki laboratoryjne, osłony oczu i fartuch laboratoryjny. Wyrzucaj roztwory MS-222 zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi odpadów chemicznych. Zachowaj ostrożność podczas obsługi igieł i kleszczyków, aby zapobiec obrażeniom ostrymi przedmiotami. Uważaj, że wszystkie próbki biologiczne mogą być potencjalnie niebezpieczne i wyrzucaj odpady zgodnie z instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa biologicznego.
1. Przygotowanie mediów do sortowania
- Uzupełnij 1× RPMI 1640 z 1% surowicą wołową (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną.
UWAGA: RPMI 1640 utrzymuje żywotność limfocytów ex vivo. RPMI 1640 można zastąpić 0,9× PBS. Surowice wołowe (FBS) dostarczają czynników wzrostu, które promują żywotność komórek. Penicylina i streptomycyna ogranicza zanieczyszczenie bakteryjne. - Podziel medium na 1,5 ml mikroprobówki w objętościach 500 μL, przy czym każda probówka jest przeznaczona dla 10-20 łusek. Przechowuj probówki z mediem do sortowania na lodzie.
2. Znieczulenie ryb zebrzy, przesiewanie mikroskopowe fluorescencyjne i obrazowanie
- Znieczulić D. rerio z buforowanym 0,02% tricaine methanesulfonate (MS-222) przygotowanym zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami, przy użyciu wody z systemu ryb.
- Po uspokojeniu, delikatnie umieść rybę w naczyniu do hodowli komórkowej z wystarczającą ilością wody z systemu (oraz 0,02% MS-222), aby utrzymać wilgotność podczas dalszej obsługi.
- Zbadaj i przeprowadź obrazowanie znieczulonych ryb za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, aby wykryć fluorescencje z transgenów. Ten krok identyfikuje fluorescencyjne łuski do biopsji.
UWAGA: Linie bez fluorescencyjnych transgenów można oglądać za pomocą standardowej mikroskopii świetlnej. - Użyj fluorescencji do identyfikacji limfocytów T (lck:GFP lub lck:mCherry ryby) lub T-ALL (rag2:hMYC + lck:GFP lub lck:mCherry ryby). Komórki linii T są jasno fluorescencyjne w tych liniach; komórki B-ALL są słabo fluorescencyjne w tłach lck:GFP i lck:mCherry13,15,21.
- Przesiej ryby z linii B-oznaczonych cd79a:GFP lub cd79b:GFP (z lub bez rag2:hMYC) na komórki B z naskórka i/lub B-ALL, używając GFP do wyboru łusek do biopsji.
- Praktykuj pozycjonowanie ryb zebrzy i dostosowywanie ustawień mikroskopu przed biopsją, jeśli pożądane jest obrazowanie
UWAGA: Obrazowanie i biopsja wymagają 5-7 min znieczulenia za pomocą 0,02% MS-222. Ciągle monitoruj ruch operculum. Jeśli ruch operculum znacząco zwolni lub ustąpi, natychmiast przenieś rybę do systemu wody bez anestetyków i przerwij biopsję. Co 1-2 min podczas obrazowania i biopsji nakładaj ~50-100 μL wody z anestetykami na skórę, operculum i skrzele, aby utrzymać wilgotność powierzchni.
3. Zbieranie i przygotowanie łusek
- Aby pozycjonować rybę do biopsji, umieść uspokojeną rybę na boku w naczyniu do hodowli komórkowej.
- Aby zapobiec zsuwaniu się ryby podczas biopsji, użyj wilgotnej gąbki z liniowym lub V-kształtnym wycięciem i umieść ją w naczyniu do hodowli komórkowej, aby podtrzymywać rybę.
- Alternatywnie, upewnij się, że poziom wody z systemu ledwo pokrywa dno naczynia do hodowli komórkowej (wystarczająco, aby utrzymać wilgotność powierzchni), aby napięcie powierzchniowe mogło ustabilizować rybę.
- Okresowo nakładaj ~50-100 μL 0,02% MS-222 przygotowanego w wodzie z systemu na operculum i skrzele, aby utrzymać wilgotność i utrzymać znieczulenie podczas obrazowania i biopsji.
- Przeprowadź biopsję za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej, aby wybrać wysoce fluorescencyjne łuski wzbogacone w limfocyty lub komórki ALL.
- Zbierz 10-20 sąsiednich łusek z pojedynczego wysoce fluorescencyjnego obszaru, najlepiej w pierwszym lub drugim poziomym opasie
Wyniki
Postępując zgodnie z powyższymi krokami, poddano dorosłe rybki zebrafish znieczuleniu i przeskanowano je pod mikroskopem w celu wykrycia fluorescencyjnych limfocytów lub ALL. Ryby typu dzikiego (WT) lck:GFP wykazywały fluorescencję głównie w obszarze grasicy, podczas gdy ryby cd79b:GFP przejawiały fluorescencję w okolicy głowy i skrzeli, co jest zgodne z wcześniejszymi obserwacjami10 (Rysunek 1A, po lewej). W przeciwieństwie do nich, podwójnie transgeniczne ryby rag2:hMYC; lck:GFP/lck:mCherry z T-ALL lub ryby rag2:hMYC+cd79b:GFP z B-ALL wykazywały intensywną, rozproszoną fluorescencję w całym ciele (Rysunek 1A, po prawej), co dostarcza wielu silnie fluorescencyjnych łusek do biopsji.
Po usunięciu łuski pozostały nienaruszone, z tkanką epidermalną przylegającą do ich powierzchni. Konwencjonalne obrazowanie oraz obrazowanie konfokalne zamontowanych łusek wykazały rozproszone limfocyty GFP+ w naskórku łusek ryb WT lck:GFP oraz cd79b:GFP, podczas gdy ryby z białaczką często posiadały gęste skupiska lub zlewające się płaty komórek GFP+/mCherry+ na powierzchni łusek (Rysunek 1B). Aby potwierdzić limfoidalną morfologię komórek odzyskanych z łusek, przeprowadzono barwienie Wrighta-Giemsy komórek uzyskanych z różnych miejsc anatomicznych ryby WT lck:GFP. Limfocyty pochodzące z łusek wykazywały morfologię podobną do limfocytów z tymusu, szpiku i krwi, w tym wysoki stosunek jądra do cytoplazmy oraz gęsto barwiące się jądra (Rysunek 1C, góra). Barwienie Wrighta-Giemsy łuski od ryby z T-ALL dodatkowo wykazało obecność wielu komórek o wyglądzie limfoblastów w pobliżu powierzchni łuski (Rysunek 1C, dół). Te znaleziska morfologiczne potwierdzają dane z mikroskopii fluorescencyjnej i dowodzą, że gęste gromady fluorescencyjnych komórek na łuskach w przypadku T-ALL składają się z limfoblastów. Wyniki mikroskopowe te stanowią jakościowy odczyt, z potwierdzeniem morfologicznym, że łuski zawierają limfocyty epidermalne (lub limfoblasty białaczkowe) dostępne do dysocjacji łusek. Ryby WT podwójnie transgeniczne lck:mCherry+cd79a:GFP pozwoliły na jednoczesną wizualizację komórek linii T mCherry+ oraz komórek linii B GFP+ (Rysunek 1D, 1E).
Do analizy cytometry przepływowej oraz sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) łuski zostały zdysocjowane i przefiltrowane w celu otrzymania zawiesin jednokomórkowych. Zidentyfikowano bramkę limfoidalną10,25 i odfiltrowano limfocyty/blasty na podstawie rozproszenia światła w przód (forward scatter) oraz rozproszenia bocznego (side scatter). Barwienie jodkiem propidyny (PI) wykazało, że większość komórek w bramce limfoidalnej pozostała żywa po dysocjacji i procesowaniu łusek, przy średniej żywotności wynoszącej ~92% (n = 16 ryb). Bramki fluorescencji ustalono przy użyciu nietransgenicznych kontroli negatywnych względem fluoroforów oraz linii transgenicznych GFP+ i mCherry+ (Rysunek 2A). W łuskach WT lck:GFP (tj. ryb pozbawionych rag2:hMYC) większość komórek fluorescencyjnych była GFPlo (Rysunek 2B, panel górny), natomiast łuski ryb rag2:hMYC + lck:GFP z T-ALL zawierały wyraźne populacje GFPhi, co jest spójne z obecnością złośliwych limfoblastów (Rysunek 2B, panel środkowy). Łuski z oznakowaniem linii B cd79b:GFP dostarczyły populacji zarówno GFPlo, jak i GFPhi (Rysunek 2B, panel dolny), co umożliwiło izolację odrębnych podzbiorów linii B.
Aby zwalidować tożsamość linii komórkowych fluorescencyjnych komórek z łusek, przeprowadzono oczyszczanie za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS), ekstrakcję RNA, a następnie analizę qRT-PCR dla komórek GFPlo z łusek WT lck:GFP, komórek GFPhi z łusek T-ALL rag2:hMYC+ lck:GFP oraz komórek GFP+ z łusek cd79b:GFP. Komórki z łusek cd79b:GFP wykazywały ekspresję transkryptów linii B (pax5, cd79b, ighm oraz ighz; Rysunek 2C, górny panel), natomiast komórki z łusek lck:GFP wykazywały ekspresję genów linii T (cd4, cd8 oraz lck; Rysunek 2C, środkowy panel), co jest zgodne z naszymi wcześniejszymi profilami limfocytów epidermalnych zebrafish uzyskanych z biopsji łusek, gdzie komórki T z łusek WT wykazywały wyższą ekspresję cd4 niż cd810. Komórki z łusek T-ALL wykazywały ekspresję transkryptów linii T z wyższym poziomem ekspresji rag2 niż nieleukemiczne komórki z łusek (Rysunek 2C, dolny panel), co odpowiada ich tożsamości jako limfoblastów. Komórki T-ALL wykazywały również niemal identyczne poziomy cd4 i cd8, co jest zgodne z ich statusem niedojrzałych limfoblastów T podwójnie dodatnich.
Aby ustalić, czy komórki ALL z łusek są reprezentatywne dla komórek nowotworowych w innych częściach organizmu zwierzęcia, porównaliśmy limfocyty oczyszczone za pomocą sortowania komórkowego w cytometrii przepływowej, pochodzące z łusek lub tkanek ciała tych samych ryb, a następnie poddaliśmy je analizie qRT-PCR. Komórki GFP+ z łusek lub tkanek ciała ryb z T-ALL rag2:hMYC + lck:GFP wykazały niemal identyczne profile ekspresji genów, z wyższą ekspresją genów limfocytów T (cd4, lck), genów wzbogaconych w limfoblastach (rag1, rag2) oraz onkogenu hMYC w stosunku do genów limfocytów B (pax5, ighm, ighz) (Rysunek 2D). Ogólnie te dane oraz nasze wcześniejsze prace10 potwierdzają zasadność stosowania biopsji łusek do pobierania komórek niezłośliwych i ALL do dalszych badań. Aby ocenić przydatność leukemicznych komórek pochodzących z łusek do późniejszych analiz molekularnych, wyizolowano RNA z dopasowanych komórek T-ALL pochodzących z ciała i łusek po oczyszczaniu za pomocą sortowania komórkowego w cytometrii przepływowej. Po posortowaniu 50 000 komórek GFPhi, próbki T-ALL z łusek dały średnią wydajność RNA na poziomie ~82 ng, w porównaniu do ~106 ng z komórek T-ALL pochodzących z ciała (n = 4 ryby). Pomimo nieco niższej wydajności z próbek pochodzących z łusek, skuteczna amplifikacja transkryptyów związanych z linią komórkową i białaczką metodą qRT-PCR wykazała, że RNA z łusek nadaje się do dalszych analiz ekspresji genów.
Biopsje z ryb nieobjętych białaczką zazwyczaj dostarczały 50–65 fluorescencyjnych limfocytów na łuskę (Rycina 3), co pozwala na zebranie >1 000 limfocytów z 20 łusek, co jest wystarczające do analizy cytometrycznej przepływowej oraz celowanych testów ekspresji. U ryb z ALL uzyski była znacznie wyższa, przy czym łuski w przypadku T-ALL zawierały ~20 000 komórek GFPhi/łuskę (ryby WT lck:GFP miały ~65 komórek/łuskę; Rycina 3, góra). B-ALL z łusek rag2:hMYC + cd79b:GFP zawierały ~4 000 komórek GFP+/łuskę (ryby WT cd79b:GFP miały ~50 komórek GFP+/łuskę; Rycina 3, dół). Duża liczba komórek możliwych do odzyskania z ryb z ALL stanowi praktyczną podstawę do podłużnego pobierania próbek komórek ALL z poszczególnych ryb w wielu punktach czasowych. Potwierdzając wykonalność powtarzalnego pobierania próbek, wszystkie 24 danio przeżebrowane w poprzednim badaniu podłużnym przeżyły seryjne biopsje, co jest rzadkością, a biopsje mogły być kontrolowane i wykonywane wielokrotnie po tej samej stronie w ciągu dwóch tygodni10. Ponadto analizy podłużne u ośmiu ryb wykazały regenerację łusek, limfocytów łuskowych oraz fluorescencji w miejscu biopsji do 10 dni po pobraniu próbki. Wyniki te sugerują, że 10-dniowy odstęp jest odpowiedni dla powtórnego pobierania próbek z tego samego miejsca biopsji. Łącznie odkrycia te potwierdzają zdolność regeneracyjną biopsjowanych łusek i ustanawiają biopsję łusek jako praktyczne podejście do badań podłużnych żywych danio przeżebrowanych.
Suboptymalne wyniki często charakteryzują się niską odzyskaną liczbą komórek oraz nadmiarem zanieczyszczeń w próbkach biopsyjnych. Niski odzysk może wystąpić, jeśli łuski są pobierane z obszarów ciała o niskiej fluorescencji lub jeśli naskórek zostanie przypadkowo usunięty podczas ekstrakcji łusek. Aby tego uniknąć, przed usunięciem pęsetą odchylamy łuski do przodu (w kierunku głowy). Usuwanie łusek z przyległych regionów o wysokiej fluorescencji również wydaje się zwiększać wydajność. W kwestii nadmiaru zanieczyszczeń, agresywna homogenizacja może zwiększyć ścinanie komórek, co redukuje liczbę komórek dostępnych do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją lub cytometrii przepływowej. Delikatna dysocjacja aż do momentu, gdy naskórek nie będzie już widocznie przytwierdzony do fragmentów łusek, a następnie filtracja przez siatkę 35 µm, zazwyczaj pozwala uzyskać odpowiednią zawiesinę pojedynczych komórek. Słaba żywotność jest najczęściej powiązana z przedłużonym przetwarzaniem lub nadmierną dysocjacją mechaniczną; dlatego łuski powinny być natychmiast przenoszone do schłodzonego na lodzie medium sortującego i bezzwłocznie przetwarzane. Agregacja komórek może utrudniać analizę cytometryczną i sortowanie, ale można ją zminimalizować poprzez wielokrotną filtrację przez siatkę 35 µm bezpośrednio przed analizą. Uporczywe krwawienie w miejscach biopsji jest rzadkie i można je opanować, wywierając nacisk pęsetą i płucząc roztworem zawierającym środek znieczulający. Słabe sygnały fluorescencyjne mogą wynikać z pobierania łusek spoza regionów wzbogaconych w fluorescencyjne limfocyty/komórki ALL; dlatego przed biopsją zaleca się obrazowanie fluorescencyjne całej ryby w celu zidentyfikowania optymalnych obszarów pobierania próbek.
Rycina 1: Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej ryb transgenicznych oraz łusek znakowanych dla linii T (typ dziki [WT] lck:GFP, ostra białaczka limfoblastyczna T [T-ALL] lck:GFP + rag2:hMYC oraz T-ALL lck:mCherry + rag2:hMYC), linii B (WT cd79b:GFP oraz ostra białaczka limfoblastyczna B [B-ALL] cd79b:GFP + rag2:hMYC) oraz linii podwójnej (WT lck:mCherry;cd79a:GFP). (A) Obrazy w jasnym polu (górny rząd) i fluorescencyjne (dolny rząd) dorosłych rybek daniowych z linii znakowanych dla linii T WT (lck:GFP) i linii B WT (cd79b:GFP), a także przykłady ryb z T-ALL (lck:GFP lub lck:mCherry + rag2:hMYC) i B-ALL (cd79b:GFP + rag2:hMYC). Żółte koło oznacza obszar grasicy. Paski skali, 2 mm. (B) Reprezentatywne łuski dla każdego genotypu. Górny rząd: obrazy w jasnym polu; środkowy rząd: obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej komórek GFP+/mCherry+ w naskórku łuski. Dolny rząd: obrazy konfokalne obszarów zaznaczonych ramkami w środkowym rzędzie, pokazujące pojedyncze limfocyty w łuskach WT oraz skupiska/arkusze komórek w łuskach ALL. Paski skali, 200 µm (rząd jasnego pola i niskiego powiększenia) oraz 20 µm (rząd wysokiego powiększenia). (C) Obrazy komórek barwionych metodą Wrighta-Giemsy pobranych z grasicy, szpiku, łuski i krwi rybki daniowej WT lck:GFP oraz obrazy łusek barwionych metodą Wrighta-Giemsy pobranych od rybki daniowej T-ALL (lck:GFP + rag2:hMYC). Cztery górne panele pod lck:GFP: obrazy przy wysokim powiększeniu barwionych komórek z narządów limfatycznych tej samej rybki. Górny panel pod T-ALL: obraz przy niskim powiększeniu barwionej łuski wykazujący komórki adherentne. Dolny panel pod T-ALL: obraz przy wyższym powiększeniu obszaru zaznaczonego ramką w górnym panelu, wykazujący komórki o wyglądzie limfoblastów z wysokim stosunkiem jądra do cytoplazmy i gęsto barwiącymi się jądrami. Paski skali: 10 µm (góra, obrazy pojedynczych limfocytów), 200 µm (środek; niskie powiększenie) i 20 µm (dół; wysokie powiększenie). (D) Obrazy w jasnym polu (BF), GFP, mCherry i nałożone (merged) dorosłych podwójnie transgenicznych rybek daniowych WT lck:mCherry;cd79a:GFP. (E) Obrazy w jasnym polu, GFP, mCherry i nałożone łuski z tej samej ryby, jednocześnie wykazujące komórki mCherry+ linii T oraz komórki GFP+ linii B. Paski skali, 2 mm w (D) i 200 µm w (E). Obrazy fluorescencyjne wykonano przy identycznych ustawieniach ekspozycji dla wszystkich kanałów, z wyjątkiem panelu E, gdzie zostały one dostosowane w celu umożliwienia jednoczesnej wizualizacji sygnałów GFP i mCherry. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Cytometria przepływowa i qRT-PCR limfocytów z łusek oraz porównanie komórek ALL z organizmu i łusek. (A) Przykład schematu analizy cytometrycznej z cytometrią przepływową wykazujący komórki limfoidalne (rozproszenie światła w przód, FSC; rozproszenie światła pod kątem prostym, SSC) oraz komórki GFP⁻, GFP⁺lo, oraz GFPWitaj bramkowanie komórek z lck:GFP skala. (BPrzykładowe obrazy fluorescencyjne (po lewej) oraz histogramy GFP komórek łusek (po prawej) z typu WT lck:GFP (góra), T-ALL lck:GFP + rag2:hMYC ryba (środek) oraz WT cd79b:GFP (na dole) ryba. Żółte koło oznacza obszar grasicy. Paski skali, 2 mm. (C) qRT-PCR oczyszczonego za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek GFP+ skalowanie komórek dla linii B specyficznych dla linii i stadium (pax5, cd79b, ighm, ighz; góra), linia T (CD4, CD8, lck; środek), oraz wzbogacony w limfoblasty (igic1s1, rag2; dół) transkrypty. (D) qRT-PCR dopasowanych limfocytów pochodzących z organizmu i z łusek, wyizolowanych z tej samej T-ALL lck:GFP + rag2:hMYC danio pręgowany (n = 2). Ekspresja limfocytów B (pax5, ighm, ighz), limfocyt T (CD4, lck), oraz wzbogaconych w limfoblasty (igic1s1, rag1, rag2) geny, oraz hMYC, przedstawiono dla próbek ciała i łusek. 2-ΔCt metodę (ΔCt = Ct_doświadczalny − Ct_genu referencyjnego) wykorzystano do obliczenia ekspresji względem dwóch genów referencyjnych: eef1a1l1 (ef1a) i rpl13aWyniki przedstawiono jako średnie ± SD. Każda grupa reprezentuje dane z dwóch powtórzeń biologicznych. Dane w panelach C i D są ilustracjami opisowymi demonstrującymi wzorce ekspresji genów specyficzne dla danej linii. Porównania między częścią ciała a skalą nie zostały poddane analizie statystycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 3: Łuski z D. rerio z ALL wykazują wyraźnie wyższą liczbę limfocytów. Góra: Liczba komórek fluorescencyjnych na łuskę u ryb typu dzikiego (WT) lck:GFP (GFPlo) oraz ryb z ostrą białaczką limfoblastyczną T (T-ALL) lck:GFP;rag2:hMYC i cd79b:GFP;rag2:hMYC(GFPhi). Dół: Liczba komórek fluorescencyjnych na łuskę u ryb WT cd79b:GFP oraz ryb z ostrą białaczką limfoblastyczną B (B-ALL) cd79b:GFP;rag2:hMYC . Każdy punkt reprezentuje jedną łuskę. Łuski pobrano od dwóch ryb z każdej grupy (grupy linii T: łącznie n = 10 łusek, 5 łusek na rybę; grupy linii B: łącznie n = 8 łusek, 4 łuski na rybę). Symbole oznaczają łuski pobrane od różnych ryb. Słupki odzwierciedlają średnie grupowe wraz z SD (odchyleniem standardowym). Dane te reprezentują przykładowe ilości limfocytów fluorescencyjnych odzyskanych z łusek ryb nieleukemicznych i leukemicznych. Wiele łusek pochodzi z tej samej ryby i mogą być one traktowane jako powtórzenia techniczne, a nie biologiczne. Nie przeprowadzono porównań statystycznych, ponieważ do biopsji wybrano nielosowo najbardziej fluorescencyjne łuski z ALL. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Niniejszy protokół opisuje nieinwazyjną metodę biopsji łusek w celu pobrania limfocytów naskórka u ryb zebrafish, w tym zarówno niezłośliwych limfocytów, jak i komórek białaczki limfoblastycznej o ostrej postaci (ALL). Zebrafish są dobrze ugruntowanymi modelami dla limfopoezy i nowotworów limfoidalnych, ale większość podejść do pozyskania limfocytów wymaga unieruchomienia i przecinania tkanek, co uniemożliwia przeprowadzanie badań podłużnych na pojedynczych zwierzętach8,10,13,15. Łuski oferują eksperymentalnie dostępny nabłonkowy kompartment z obfitością limfocytów i mogą być pobieranie wielokrotnie, ponieważ dorosłe ryby zebrafish mają setki łusek, które szybko się regenerują po usunięciu10,24. Zatem biopsje łusek są praktyczną strategią do seryjnego monitorowania limfocytów (takich jak obciążenie białaczkowe) i generowania pojedynczych zawiesin komórek dla dalszych badań bez konieczności unieruchomienia zwierząt eksperymentalnych.
Kilka kroków jest kluczowych dla osiągnięcia wysokiego, powtarzalnego poziomu odzysku komórek. Po pierwsze, odpowiednie znieczulenie i utrzymanie wilgotności powierzchni podczas obrazowania i biopsji (0,02% MS-222 w wodzie systemowej) zmniejszają stres i ograniczają wysychanie. Po drugie, pobieranie 10–20 sąsiednich łusek z pojedynczego pigmentowanego paska poprawia powtarzalność i minimalizuje zmienność regionalną. Po trzecie, obrócenie łusek do przodu (ku głowie) przed wyjęciem i natychmiastowe przeniesienie ich do lodowatego medium sortującego zachowuje tkankę naskórkową i żywotność limfocytów. Chociaż limfocyty łuskowe wykazywały wysoką żywotność i zostały zweryfikowane dla testów końcowych, takich jak mikroskopia, cytometria przepływowa/sortowanie komórek z aktywacją fluorescencji i qRT-PCR, maksymalny czas, przez jaki łuski mogą pozostać na lodzie i ich przydatność do długotrwałej kultury ex vivo nie zostały zbadane i wymagają dalszych badań. Wreszcie, dysocjacja musi być wystarczająco silna, aby oderwać komórki naskórka, ale nie tak agresywna, aby rozdrobnić macierz łusek, zwiększając w ten sposób zanieczyszczenia i kompromitując sortowanie cytometryczne. Pomimo tych środków ostrożności, procedura prawdopodobnie pozyskuje tylko podzbiór limfocytów obecnych w każdej łusce, ponieważ mikroskopia łusek (Rysunek 1B) pokazuje, że każda łuska zawiera znacznie więcej niż 50–65 fluorescencyjnych komórek/łuska, które możemy wykryć za pomocą cytometrii przepływowej/sortowania komórek z aktywacją fluorescencji (Rysunek 3). Nie testowaliśmy trypsynizacji ani innych metod trawienia w celu uwolnienia komórek z łusek, a takie lub inne modyfikacje protokołu mogłyby zwiększyć wydajność komórek. Mimo to, ta metoda zapewnia prostą technikę pobierania ponad 1000 limfocytów z ryb dzikiego typu i dziesiątek do setek tysięcy komórek złośliwych z ryb z rozsianymi ALL.
Nasza metoda może być łatwo dostosowana do innych planów eksperymentów i tła transgenicznego. Fluorescencyjnie oznakowane linie umożliwiają zarówno odczyty oparte na mikroskopii, jak i sortowanie i czyszczenie komórek z aktywacją fluorescencji różnych typów komórek, takich jak podzbiory GFPlo vs. GFPhi. Jeśli potrzebne są próbki podłużne, łuski mogą być pobierane z przeciwległych boków w różnych punktach czasowych, aby umożliwić ponowne wyrośnięcie łusek i zmniejszyć stan zapalny, co wcześniej wdrożyliśmy do seryjnego pobierania łusek u ryb leczonych deksametazonem10. Chociaż niniejsze badanie koncentrowało się na limfocytach, nabłonek łuski zawiera dodatkowe populacje komórek odpornościowych, w tym makrofagi i neutrofile11, które mogą być również podatne na badania przy użyciu tego podejścia.
Ograniczenia dotyczące biopsji należy wziąć pod uwagę przy planowaniu eksperymentu. U ryb dzikiego typu liczba limfocytów na łuskę jest niewielka (mniej niż 100 komórek na łuskę), co może być niewystarczające dla niektórych testów, chyba że używane są liczne łuski i/lub wiele ryb10. Ponadto, biopsja zakłóca naskórek i może powodować stan zapalny lub przebudowę tkanek; dlatego badania z seryjnymi próbkami powinny uwzględniać kontrole z biopsją z fiktywnym leczeniem i, gdy jest to możliwe, przestrzenne oddzielenie miejsc. U ryb z ALL łuski oferują wygodne, wzbogacone źródło komórek złośliwych. Jednak należy wziąć pod uwagę, że obciążenie chorobowe może się różnić w różnych regionach ciała i w czasie. Zalecamy fluorescencyjne obrazowanie całej ryby przed biopsją, aby zidentyfikować reprezentatywne regiony pobierania próbek i zminimalizować potencjalne uprzedzenia pobierania. Ograniczeniem niniejszego badania jest to, że nie przeprowadzono porównań między normalnym
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Ameerze Hasan, M.B.B.S., Ph.D., oraz Brashé Wood za ich wkład w ten projekt. Badania były wspierane przez OUHSC Stephenson Cancer Center Pilot Grant Program, Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research (OCASCR), Presbyterian Health Foundation Team Science and Seed Grant Programs oraz W.J. Jones Family Foundation. FACS przez OUHSC Stephenson Cancer Center Molecular Biology and Cytometry Research Core zostało sfinansowane przez NCI Cancer Center Support Grant Award P30 CA225520. To badanie było częściowo wspierane przez fundusze American Cancer Society (ACS-POST-BACC-23-1156971-01-DPBACC). Iman Owens jest stypendystką programu ACS post-baccalaureate "STRONG".
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Czynniki chemiczne & Materiały eksploatacyjne: | |||
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | Środek znieczulający |
| RPMI 1640 medium | ThermoFisher | 11875093 | Środowisko dla żywotności limfocytów |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Dla żywotności komórkowej |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | Ograniczanie zakażenia bakteryjnego |
| 70% ethanol | ThermoScientific | T038181000 | Do sterylizacji forceps |
| CellPro 1x PBS | VWR | 104027-280 | Rozcieńczyć do 0.9x sterylną wodą |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MMP | Rozróżnianie żywych/martwych komórek do flow/FACS |
| Cut Goods Misc-Pn; Size: 12 x 12 IN. 35um filter paper Lab Pak 03-35/16 | Sefar | Do sortowania komórek Referencja: Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Izolowanie złośliwych i niezłośliwych komórek B z lck:Egfp zebrafish. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019). | |
| Alternatywa dla papieru filtracyjnego: EASYstrainer Cell Sieves, Greiner Bio-One | Greiner | 89508-342 | Do sortowania komórek |
| Eppendorf® Flex-Tubes® Microtubes, 1.5 ml | Eppendorf® | 20901-551 | mikrocentryfużer do sortowania komórek |
| UltiCare VetRx U-100 Insulin Syringes 3/10cc 31G x 5/16" Half Unit Marking | UltiCare | 9436 | Do biopsji skali |
| 100 x 25 mm Deep Petri Dish | USA Scientific | 8609-0625 | Do biopsji skali |
| Bel-Art® Disposable Pestles | Bel-Art® | BAF199230001 | Do dysocjacji skali |
| E-Z Pik 6-Piece Tweezer Set | Aven | 18480EZ | Do biopsji skali |
| Corning® microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25 | Do obrazowania |
| Cover glasses | Sigma-Aldrich | C8181 | Do obrazowania |
| SlowFade™ Glass Soft-set Antifade Mountant, with DAPI | ThermoFisher | S36920 | Do montażu skali na szkle |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Do ekstrakcji RNA |
| Urządzenia: | |||
| Nikon AZ100 microscope and DS-Qi1MC camera | Nikon | Mikroskop fluorescencyjny & kamera | |
| CFX96 Touch-PCR System | Bio-Rad | 3600037 | |
| CytoFLEX | Beckman-Coulter | Analizy cytometrii przepływowej | |
| Leica SP8 | Leica | Mikroskop konfokalny | |
| Oprogramowanie: | |||
| Kaluza Analysis software version 2.1 | Beckman-Coulter | Analizy cytometrii przepływowej Referencja: https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads | |
| LAS-X software version 3.7.4.23463 | Leica | Mikroskop konfokalny Referencja: https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ |
Bibliografia
- Egawa G, Kabashima K. Skin as a peripheral lymphoid organ: revisiting the concept of skin-associated lymphoid tissues. J Invest Dermatol. 2011;131(11):2178–85.
- Matejuk A. Skin immunity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2018;66(1):45–54.
- Zhang C, Merana GR, Harris-Tryon T, Scharschmidt TC. Skin immunity: dissecting the complex biology of our body's outer barrier. Mucosal Immunol. 2022;15(4):551–61.
- Kupper TS, Fuhlbrigge RC. Immune surveillance in the skin: mechanisms and clinical consequences. Nat Rev Immunol. 2004;4(3):211–22.
- Lafouresse F, Groom JR. A task force against local inflammation and cancer: lymphocyte trafficking to and within the skin. Front Immunol. 2018;9:2454. doi:10.3389/fimmu.2018.02454
- Danilova N, Bussmann J, Jekosch K, Steiner LA. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nat Immunol. 2005;6(3):295–302.
- Hansen JD, Landis ED, Phillips RB. Discovery of a unique Ig heavy-chain isotype (IgT) in rainbow trout: implications for a distinctive B cell developmental pathway in teleost fish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(19):6919–24.
- Page DM, et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 2013;122(8)–e11.
- Sunyer JO. Evolutionary and functional relationships of B cells from fish and mammals: insights into their novel roles in phagocytosis and presentation of particulate antigen. Infect Disord Drug Targets. 2012;12(3):200–12.
- Park G, et al. Diverse epithelial lymphocytes in zebrafish revealed using a novel scale biopsy method. J Immunol. 2024;213(12):1902–14.
- Zhou Q, et al. Cross-organ single-cell transcriptome profiling reveals macrophage and dendritic cell heterogeneity in zebrafish. Cell Rep. 2023;42(7):112793. doi:10.1016/j.celrep.2023.112793
- Robertson TF, et al. A tessellated lymphoid network provides whole-body T cell surveillance in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(20). doi:10.1073/pnas.2301137120
- Park G, et al. Zebrafish B cell acute lymphoblastic leukemia: new findings in an old model. Oncotarget. 2020;11(15):1292–305.
- Ferrero G, et al. The macrophage-expressed gene (mpeg) 1 identifies a subpopulation of B cells in the adult zebrafish. J Leukoc Biol. 2020;107(3):431–43.
- Borga C, et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. 2019;33(2):333–47.
- Tian Y, et al. The first wave of T lymphopoiesis in zebrafish arises from aorta endothelium independent of hematopoietic stem cells. J Exp Med. 2017;214(11):3347–60.
- Liu X, et al. Zebrafish B cell development without a pre-B cell stage, revealed by CD79 fluorescence reporter transgenes. J Immunol. 2017;199(5):1706–15.
- Wan F, et al. Characterization of gamma delta T cells from zebrafish provides insights into their important role in adaptive humoral immunity. Front Immunol. 2016;7:675. doi:10.3389/fimmu.2016.00675
- Moore FE, et al. Single-cell transcriptional analysis of normal, aberrant, and malignant hematopoiesis in zebrafish. J Exp Med. 2016;213(6):979–92.
- Langenau DM, et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(19):7369–74.
- Burroughs-Garcia J, et al. Isolating malignant and non-malignant B cells from lck zebrafish. J Vis Exp. 2019;(144):59191. https://www.jove.com/t/59191/isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish
- Borga C, et al. Molecularly distinct models of zebrafish Myc-induced B cell leukemia. Leukemia. 2019;33(2):559–62.
- Pugach EK, Li P, White R, Zon L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. 2009;(34):1645. https://www.jove.com/t/1645/retro-orbital-injection-in-adult-zebrafish
- Iwasaki M, Kuroda J, Kawakami K, Wada H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 2018;437(2):105–19.
- Traver D, et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 2003;4(12):1238–46.
Przedruki i uprawnienia
