MiR-93-5p bezpośrednio celuje w receptor Toll-podobny 4 (TLR4) w pediatrycznym zapaleniu płuc wywołanym przez Mycoplasma pneumoniae (MPP). Jego obniżona ekspresja może przyczyniać się do progresji choroby i powiązanego z nią uszkodzenia układu pokarmowego. Wyniki te sugerują, że miR-93-5p może służyć jako potencjalny biomarker diagnostyczny dla MPP oraz MPP z uszkodzeniem układu pokarmowego.
Artykuł badawczy
Ocena roli miR-93-5p u dzieci zakażonych Mycoplasma pneumoniae z uszkodzeniem układu pokarmowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykazano, że miR-93-5p bierze udział w modulowaniu ostrego uszkodzenia płuc, jednak jego rola i wartość diagnostyczna w pediatrycznym zapaleniu płuc wywołanym przez Mycoplasma pneumoniae (MPP) z uszkodzeniem układu pokarmowego pozostają niejasne. W niniejszym badaniu oceniono rolę miR-93-5p jako potencjalnego biomarkera diagnostycznego MPP oraz towarzyszących mu powikłań ze strony układu pokarmowego u dzieci. Próbki kliniczne pobrano od pacjentów pediatrycznych z MPP oraz od zdrowych osób z grupy kontrolnej. Ekspresję miR-93-5p określono ilościowo za pomocą metody RT-qPCR. Komórki A549 zainfekowane Mycoplasma pneumoniae (MP) wykorzystano do stworzenia komórkowego modelu MPP w celu oceny zmian w żywotności komórek oraz poziomach cytokin prozapalnych. Celowanie w receptor Toll-podobny 4 (TLR4) przez miR-93-5p oceniono za pomocą testu reporterowego lucyferazy. Wydajność diagnostyczną oceniono za pomocą analizy krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC). Poziomy miR-93-5p były znacząco obniżone u pacjentów z MPP w porównaniu z grupą kontrolną (P < 0,001) i były jeszcze niższe u pacjentów z MPP z uszkodzeniem układu pokarmowego w porównaniu z pacjentami z samym MPP. Infekcja MP zmniejszyła żywotność komórek i zwiększyła poziomy IL-6 oraz TNF-α, podczas gdy nadekspresja miR-93-5p złagodziła te efekty. Ekspresja TLR4 wzrosła po infekcji MP i była regulowana negatywnie przez miR-93-5p. Klinicznie uszkodzenie układu pokarmowego u pacjentów z MPP wiązało się z niższymi poziomami miR-93-5p. Analizy krzywych ROC wykazały korzystną wydajność diagnostyczną w rozróżnianiu pacjentów z MPP od zdrowych osób z grupy kontrolnej oraz pacjentów z MPP z uszkodzeniem układu pokarmowego od pacjentów z samym MPP. MiR-93-5p bezpośrednio celuje w TLR4 w pediatrycznym MPP, a jego obniżona ekspresja może przyczyniać się do progresji choroby i towarzyszącego uszkodzenia układu pokarmowego. Wyniki te sugerują, że miR-93-5p może służyć jako potencjalny biomarker diagnostyczny MPP oraz MPP z uszkodzeniem układu pokarmowego.
Wprowadzenie
Mycoplasma pneumoniae (MP) jest dominującym patogenem odpowiedzialnym za zapalenie płuc u dzieci1, co często prowadzi do znacznej zachorowalności z powodu schorzeń układu oddechowego na całym świecie. Chociaż MP powoduje przede wszystkim zakażenia płuc, może ono również wywoływać powikłania pozapłucne obejmujące wiele układów narządowych2W przebiegu zakażenia M. pneumoniae najczęściej zgłaszanymi objawami żołądkowo-jelitowymi są nudności, wymioty, biegunka oraz ból brzucha.3Zidentyfikowano również szereg schorzeń i objawów żołądkowo-jelitowych jako element M. pneumoniaepozapłucne schorzenia związane z (MPEPDs)2Pacjenci pediatryczni z Zapalenie płuc wywołane przez M. pneumoniae (MPP) powikłane uszkodzeniem układu pokarmowego stanowią wyzwania kliniczne, które mogą nasilać ciężkość przebiegu choroby i utrudniać leczenie4Pojawiające się dowody wskazują na interakcję między zakażeniem płuc a dysfunkcją jelit, co może leżeć u podstaw tej korelacji.5,6Rozregulowanie odpowiedzi immunologicznych podczas zakażenia MP może być również związane z uszkodzeniem układu pokarmowego.7.
Mimo postępów w metodach diagnostycznych8, wczesna i dokładna identyfikacja MPP pozostaje trudna ze względu na nakładanie się objawów klinicznych z innymi infekcjami dróg oddechowych oraz zmienne zajęcie narządów pozapłucnych9. Płuca i jelita są kluczowymi elementami wspólnego błon śluzowego układu odpornościowego i organy te mogą wpływać na swoje wzajemne funkcjonowanie, co przejawia się zaburzeniami jelitowymi podczas chorób płuc oraz efektami odwrotnymi – zjawiskiem znanym jako oś płuca-jelita (lung-gut crosstalk)10. Ponadto pielęgnacja pediatryczna koncentruje się przede wszystkim na łagodzeniu objawów oddechowych11, podczas gdy objawy żołądkowo-jelitowe mogą być niedostrzegane lub przypisywane skutkom ubocznym leczenia. Ta luka podkreśla potrzebę kompleksowej oceny integrującej badanie płuc i układu pokarmowego w celu optymalizacji wspierających interwencji pielęgniarskich12. Niedawne badania molekularne wyróżniły regulatory zapalnych szlaków sygnałowych zaangażowanych zarówno w patologię płuc, jak i zapalenie jelit w przebiegu MPP12,13.
W patogenezie ostrego uszkodzenia płuc zaangażowany jest MiR-93-5p, którego obniżona ekspresja koreluje z upośledzeniem funkcji płuc oraz nasiloną odpowiedzią zapalną14,15. W oparciu o te wyniki wysunięto hipotezę, że miR-93-5p ulega podobnemu obniżeniu poziomu w surowicy dzieci z MPP. Analiza bioinformatyczna z wykorzystaniem bazy danych TargetScan zidentyfikowała receptor Toll-podobny 4 (TLR4) jako potencjalny bezpośredni cel miR-93-5p. Donoszono, że TLR4 odgrywa istotną rolę w modulowaniu osi płuca-jelito16,17, w związku z czym uznano go za potencjalnie powiązany z powikłaniami żołądkowo-jelitowymi w MPP. W związku z tym w niniejszym badaniu przeanalizowano udział miR-93-5p u pacjentów pediatrycznych z MPP z powikłaniami w postaci uszkodzenia układu pokarmowego.
Protokół
Badanie to zostało przejrzane i zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Powiązanego z Uniwersytetem w Yangzhou (nr zatwierdzenia 2023-YKL01-(16); 17 stycznia 2023 r.). Od każdego uczestnika pobrano próbki krwi żylnej obwodowej do odpowiednich analiz laboratoryjnych. Przed przystąpieniem do badania uzyskano świadomą zgodę od opiekunów prawnych wszystkich uczestników. Odczynniki, sprzęt i narzędzia użyte w niniejszym protokole są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Pobieranie próbek klinicznych
W okresie od lutego 2023 do grudnia 2024 roku w szpitalu kliNickim Uniwersytetu w Yangzhou do badania włączono łącznie 108 dzieci w wieku od 2 do 14 lat. U wszystkich 108 dzieci zdiagnozowano MPP, co potwierdzono obrazowaniem klatki piersiowej oraz testem polimerazy łańcuchowej (PCR) w kierunku DNA MP w próbkach z nosogardzieli. Obecność DNA MP w wymazach z nosogardzieli wykryto za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, celującego w specyficzny dla MP gen adhezyny P1.
Pacjentów zaklasyfikowano według stanu choroby do dwóch grup: MPP bez DSI (n = 60) oraz MPP z DSI (n = 48). DSI zdefiniowano jako występowanie co najmniej jednego objawu żołądkowo-jelitowego, w tym biegunki (≥3 luźnych lub wodnistych stolców na dobę trwających przez >24 h), nudności, wymiotów lub uporczywego bólu brzucha z objawem blaszkowania lub bez niego, którym towarzyszył co najmniej jeden nieprawidłowy parametr laboratoryjny i/lub potwierdzający wynik obrazowania jamy brzusznej. Nieprawidłowe parametry laboratoryjne obejmowały podwyższony poziom transaminaz surowiczych, amylazy lub lipazy i/lub zwiększone markery przepuszczalności jelitowej, takie jak D-mleczan i endotoksyna. Potwierdzające wyniki obrazowania jamy brzusznej obejmowały pogrubienie ściany jelita, powiększone węzły chłonne krezkowe lub wysięk do otrzewnej wykryty w badaniu ultrasonograficznym lub tomografii komputerowej. Dodatkowo, w charakterze grupy kontrolnej przyjęto 60 zdrowych dzieci poddawanych rutynowym badaniom.
- Kryteria włączenia
Do grupy DSI zaklasyfikowano pacjentów wykazujących objawy żołądkowo-jelitowe wraz z nieprawidłowościami w badaniach laboratoryjnych lub obrazowych. - Kryteria wykluczenia
Kryteria wykluczenia obejmowały wirusowe lub bakteryjne zapalenie płuc, gruźlicę, historię alergii na leki stosowane w badaniu, zaburzenia odporności, niedożywienie, niewydolność nerek, wady wrodzone układu pokarmowego oraz wcześniejsze leczenie antybiotykami przed przyjęciem do szpitala.
2. Hodowla komórek i model MPP
Mycoplasma pneumoniae szczep standardowy ATCC 15531 hodowano w bulionie PPLO. Ludzkie komórki nabłonka pęcherzyków płucnych A549 hodowano w medium RPMI-1640 zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej w warunkach zwiększonej wilgotności w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO₂.
Aby stworzyć model in vitro zapalenia płuc wywołanego przez MPP, komórki A549 zainfekowano zawiesiną M. pneumoniae przy wielokrotności infekcji (MOI) 1:10018. Po infekcji nieprzywiązane bakterie usunięto poprzez wymianę pożywki hodowlanej. Efektywność infekcji potwierdzono za pomocą qPCR, wykrywając DNA MP w nadsączach hodowli po infekcji.
3. Konstrukcja plazmidu i transfekcja
Mimetyki MiR-93-5p, plazmidy do nadekspresji TLR4 (oe-TLR4) oraz odpowiadające im kontrole negatywne zostały zsyntetyzowane komercyjnie. Komórki A549 zainfekowane MP poddano transfekcji przy użyciu odczynnika transfekcyjnego opartego na lipidach. Wydajność transfekcji oceniono 48 h po zabiegu za pomocą ilościowej reakcji polimerazy w łańcuchu z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR).
4. Analiza RT-qPCR
Całkowite RNA wyekstrahowano z komórek A549 zebranych po zakończeniu eksperymentów. Komórki poddano lizie i homogenizacji z użyciem soli fizjologicznej (PBS). Całkowite RNA oczyszczono przy użyciu odczynnika do ekstrakcji RNA opartego na fenolu. Do odwrotnej transkrypcji miR-93-5p wykorzystano zestaw do odwrotnej transkrypcji, natomiast komplementarne DNA do analizy mRNA zsyntetyzowano przy użyciu dostępnego komercyjnie odczynnika do odwrotnej transkrypcji. Analizę RT-qPCR przeprowadzono z wykorzystaniem chemii SYBR Green.
5. Test MTT
Tranfekowane komórki A549 z każdej grupy eksperymentalnej zebrano i wysiano do płytek 96-dołkowych z gęstością 2 × 103 komórek na dołek. Następnie do każdego dołka dodano 20 µL odczynnika bromku 3-(4,5-dimetyloizoksazolo[5,4-d]izoprazolium) dla tetrazoliu (MTT). Po dodatkowej inkubacji przez 2 h w temperaturze 37 °C ostrożnie usunięto nadsączniki. Powstałe kryształy formazanu, uformowane przez metabolicznie aktywne komórki, rozpuszczono zgodnie z instrukcją analizy. Żywotność komórek określono pośrednio poprzez pomiar gęstości optycznej (OD) przy 490 nm za pomocą czytnika mikro płytek.
6. Test immunoenzymatyczny (ELISA)
Do pomiaru poziomów interleukiny-6 (IL-6) oraz czynnika martwicy nowotworów-α (TNF-α) wykorzystano komercyjne zestawy do testu ELISA. Analizy przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Pomiary wykonano w trzech powtórzeniach w ramach dwóch niezależnych serii eksperymentalnych, aby zapewnić dokładność i powtarzalność wyników.
7. Dualny test reporterowy lucyferazy
Miejsca wiązania MiR-93-5p w obrębie 3′ niekodującej regionu (UTR) TLR4 zostały przewidziane przy użyciu bazy danych TargetScan. Fragmenty zawierające sekwencje typu dzikiego (WT) lub zmutowane (MUT) sklonowano do wektora reporterowego lucyferazy. Komórki A549 poddano ko-transfekcji 500 ng konstruktu WT lub MUT wraz z mimetykami miR-93-5p lub kontrolami, wykorzystując lipidowy odczynnik do transfekcji. Po 48 h zmierzono aktywność lucyferazy za pomocą podwójnego testu reporterowego lucyferazy. Aktywność lucyferazy świetlika znormalizowano względem aktywności lucyferazy Renilla, aby uwzględnić wydajność transfekcji.
8. Analiza Western blotting
Do analizy Western blot lizaty komórkowe zmieszano z buforem do nakładania próbek i odwirowano przy 10,000 × g przez 3 min. Nadpływy poddano elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu, a następnie białka przeniesiono na membrany z polifluorku winylidenu. Membrany blokowano 5% albuminą surowicy wołowej (BSA) przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc w 4 °C z przeciwciałami pierwotnymi przeciwko dehydrogenazie gliceraldo-3-fosforanowej (GAPDH) oraz inhibitorowi kappa B alpha (IκBα) w rozcieńczeniu 1:1000 w buforze TBS z Tween 20 i 5% BSA. Po trzech etapach płukania membrany inkubowano z przeciwciałami kozimi anty-króliczymi IgG sprzężonymi z HRP (1:500) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Po kolejnych etapach płukania prążki białkowe wizualizowano przy użyciu substratu do wzmocnionej chemiluminescencji i obrazowano za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego. Intensywność prążków białek docelowych oraz GAPDH ilościowo określono na podstawie trzech niezależnych eksperymentów przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.
9. Analiza statystyczna
Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej. Normalność rozkładu danych pomiarowych oceniono za pomocą testu Shapiro-Wilka. Dane o rozkładzie normalnym przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe i porównano za pomocą testów t dla prób niezależnych w przypadku dwóch grup lub jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) dla wielu grup. W sytuacjach, gdy ANOVA wykazała istotną różnicę ogólną, do porównań parzystych zastosowano test post hoc Tukeya. Dane o rozkładzie nienormalnym analizowano za pomocą testu U Manna-Whitneya. Zmienne kategoryczne wyrażono jako liczebność i procenty, a następnie porównano za pomocą testów chi-kwadrat. Analiza krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) została wykorzystana do oceny potencjału diagnostycznego miR-93-5p w przewidywaniu MPP lub MPP z DSI. W celu zidentyfikowania czynników prognostycznych związanych z MPP z DSI przeprowadzono wieloczynnikową regresję logistyczną. Zmienne wprowadzone do modelu obejmowały wiek, płeć, czas trwania gorączki, czas stosowania antybiotyków oraz ekspresję miR-93-5p z dychotomizacją według mediany. Dwustronną wartość P <0,05 uznano za statystycznie istotną.
Wyniki
Obniżony poziom MiR-93-5p w pediatrycznej MPP
Oceniono wydajność diagnostyczną miR-93-5p, aby zbadać jego potencjał jako biomarkera w pediatrycznej MPP. Jak pokazano na Rysunku 1A, ekspresja miR-93-5p była znacząco obniżona u pediatrycznych pacjentów z MPP w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych. Charakterystyka demograficzna i hematologiczna obu grup została podsumowana w Tabeli 1. Nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic w rozkładzie wieku lub płci między grupami (P > 0.05). Jednakże liczba białych krwinek w krwi obwodowej (WBC), odsetek neutrofili (Net%) oraz poziomy białka C-reaktywnego (CRP) były znacząco podwyższone w grupie MPP w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych (P < 0.001).
Przeprowadzono analizę krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), aby dalej ocenić wydajność diagnostyczną miR-93-5p w odróżnianiu pacjentów z MPP od zdrowych dzieci (Rysunek 1B). Powierzchnia pod krzywą (AUC) wyniosła 0,9009 [95% przedział ufności (CI): 0,8537–0,9482], przy czułości 80,56% i swoistości 88,33%. Wyniki te wskazują, że obniżone poziomy miR-93-5p w surowicy były powiązane z pediatric MPP.
Wpływ miR-93-5p na modele komórkowe MPP
Przeprowadzono szereg eksperymentów in vitro w celu oceny wpływu miR-93-5p w modelu komórkowym MPP. W porównaniu z komórkami kontrolnymi, ekspresja miR-93-5p była obniżona w modelu komórkowym MPP (Rycina 2A). Infekcja MP wiązała się również ze zmniejszoną żywotnością komórek A549 (Rycina 2B). Ponadto poziomy cytokin prozapalnych IL-6 i TNF-α były podwyższone w modelu MPP w porównaniu z grupami kontrolnymi (Rycina 2C).
Aby dalej ocenić efekt funkcjonalny miR-93-5p, w zakażonych MP komórkach A549 utworzono model nadekspresji miR-93-5p (Rysunek 2D). Nadekspresja miR-93-5p znacząco zwiększyła żywotność komórek w porównaniu z modelem MPP bez nadekspresji miR-93-5p (Rysunek 2E). Zgodnie z tymi wynikami, zwiększona ekspresja miR-93-5p wiązała się ze zmniejszoną produkcją IL-6 oraz TNF-α (Rysunek 2F). Wyniki te wskazują, że obniżona ekspresja miR-93-5p była powiązana ze zmniejszoną żywotnością komórek i nasiloną odpowiedzią zapalną podczas infekcji MP, podczas gdy nadekspresja miR-93-5p łagodziła te zmiany.
MiR-93-5p jest celem TLR4
Aby wyjaśnić relację regulacyjną między miR-93-5p a TLR4, przeprowadzono analizę bioinformatyczną, która zidentyfikowała przewidywaną miejsce wiązania miR-93-5p w obrębie 3′ nietranslacyjnego regionu (UTR) mRNA TLR4 (Rysunek 3A). Ekspresja TLR4 była zwiększona w modelu komórkowym MP w porównaniu z kontrolami (Rysunek 3B). Przewidywana interakcja została następnie oceniona za pomocą testu reporterowego lucyferazy. Kotransfekcja mimetykami miR-93-5p zmniejszyła aktywność lucyferazy konstruktu typu dzikiego, co wskazuje na specyficzne wiązanie w przewidywanym miejscu (Rysunek 3C).
Nadekspresja miR-93-5p w komórkach zainfekowanych MP obniżyła ekspresję TLR4 w porównaniu z zainfekowanymi kontrolami bez zastosowania mimiku (Rycina 3D). Aby dalej zbadać efekty downstream związane z modulacją TLR4, opracowano modele komórek A549 z nadekspresją TLR4 (Rycina 3E). Analiza Western blot wykazała zwiększone poziomy IκBα po nadekspresji TLR4 (Rycina 3F).
Nadekspresja TLR4 znacznie zmniejszyła żywotność komórek po zakażeniu MP w porównaniu z komórkami kontrolnymi, podczas gdy jednoczesna nadekspresja miR-93-5p odwróciła ten spadek (Rysunek 3G). Pomiar cytokin zapalnych wykazał ponadto, że nadekspresja TLR4 zwiększyła poziomy mediatorów prozapalnych, podczas gdy nadekspresja miR-93-5p złagodziła te zmiany nawet w obecności nadekspresji TLR4 (Rysunek 3H). Wyniki te wskazują, że miR-93-5p negatywnie reguluje ekspresję TLR4 i łagodzi zmiany komórkowe związane z zakażeniem MP.
Wartość diagnostyczna miR-93-5p w MPP i MPP z DSI
W poprzednich raportach opisano udział TLR4 w tkankach płuc i jelita grubego16. Dlatego w badaniu klinicznym oceniono potencjalny związek między miR-93-5p a uszkodzeniem układu pokarmowego w MPP. Jak pokazano na Rysunku 4A, ekspresja miR-93-5p była obniżona w grupie MPP+DSI w porównaniu z grupą MPP.
Charakterystyka demograficzna i hematologiczna została podsumowana w Tabeli 2. Między grupami nie zaobserwowano istotnych różnic pod względem wieku lub płci. Jednakże czas trwania gorączki oraz stosowanie antybiotyków były istotnie dłuższe u pacjentów z współistniejącą DSI (P < 0.05).
Wartość diagnostyczna miR-93-5p w rozróżnianiu przypadków MPP z DSI od tych bez DSI została oceniona za pomocą analizy krzywej ROC. Wartość AUC wyniosła 0,7866 (95% CI: 0,6889–0,8843) (Rysunek 4B), przy czułości wynoszącej 85,71% i swoistości 57,45%.
Wielowymiarowa analiza regresji logistycznej wykazała, że niska ekspresja miR-93-5p, przedłużający się czas trwania gorączki oraz długotrwałe stosowanie antybiotyków są czynnikami powiązanymi z uszkodzeniem układu pokarmowego podczas zakażenia MP (Tabela 3; P < 0.05).
Rycina 1: Ekspresja i wartość diagnostyczna miR-93-5p u zdrowych osób kontrolnych (n = 60) i pacjentów z MPP (n = 108). (A) Ekspresja miR-93-5p była obniżona u pacjentów z MPP. (B) Analiza krzywej ROC dla miR-93-5p. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Efekty funkcjonalne miR-93-5p w modelu komórkowym zakażonym MP. (A) Ekspresja miR-93-5p była obniżona w modelu zakażonym MP. (B) Żywotność komórek była obniżona w modelu zakażonym MP. (C) Poziomy TNF-α i IL-6 były podwyższone w modelu zakażonym MP. (D) Wydajność transfekcji mimiku miR-93-5p. (E) Żywotność komórek wzrosła po nadekspresji miR-93-5p. (F) Poziomy TNF-α i IL-6 uległy obniżeniu po nadekspresji miR-93-5p. n = 3. P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: MiR-93-5p bezpośrednio celuje w TLR4. (A) Przewidywane miejsce wiązania między miR-93-5p a TLR4. (B) Ekspresja TLR4 w modelu zakażonym MP. (C) Podwójny test reporterowy lucyferazy. (D) Negatywna regulacja TLR4 przez miR-93-5p. (E) Wydajność nadekspresji TLR4. (F) Analiza Western blot białka IκBα. (G) Żywotność komórek. (H) Poziomy TNF-α i IL-6. n = 3. P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Ekspresja i wartość diagnostyczna miR-93-5p u pacjentów z MPP (n = 60) oraz pacjentów z MPP z DSI (n = 48). (A) Ekspresja miR-93-5p w grupie MPP+DSI. (B) Analiza krzywej ROC dla miR-93-5p. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Zmienna | Zdrowe (n = 60) | MPP (n = 108) | P |
| wiek (lata) | 6.81± 3.14 | 7.12 ± 3.55 | 0.559 |
| płeć (mężczyzna/kobieta) | 28/32 | 49/59 | 0.872 |
| WBC ( × 109/L) | 7.27 ± 0.89 | 9.86 ± 1.36 | <0.001 |
| CRP (mg/L) | 2.35 ± 0.17 | 11.53 ± 2.01 | <0.001 |
| Neutrofile % | 42.55 ± 5.62 | 56.51 ± 15.40 | <0.001 |
Tabela 1: Porównanie charakterystyki demograficznej i rutynowych parametrów krwi między zdrową grupą kontrolną a pacjentami z MPP.Tabela ta podsumowuje charakterystykę demograficzną i rutynowe parametry hematologiczne zdrowych osób z grupy kontrolnej oraz pacjentów z MPP, w tym wiek, płeć, WBC, odsetek neutrofili, odsetek eozynofili, odsetek bazofili oraz CRP. Przedstawiono porównania między grupami oraz odpowiadające im wartości P.
| Zmienna | MPP (n = 60) | MPP+DSI (n = 48) | P |
| wiek (lata) | 6.88 ± 3.87 | 7.42 ± 3.11 | 0.441 |
| płeć (męska/żeńska) | 31/29 | 28/20 | 0.494 |
| WBC (× 10⁹/L) | 8.9 ± 0.89 | 11.05 ± 0.76 | <0.001 |
| CRP (mg/l) | 10.94 ± 1.62 | 12.27 ± 2.22 | <0.001 |
| % netto | 55.87 ± 14.75 | 57.32 ± 16.29 | 0.629 |
| Czas trwania gorączki (dni) | 4.60 ± 1.83 | 7.26 ± 1.04 | <0.001 |
| Czas stosowania antybiotyku (dzień) | 4.65 ± 1.147 | 6.29 ± 0.771 | <0.001 |
Tabela 2: Porównanie charakterystyki demograficznej i rutynowych parametrów krwi u pacjentów z MPP oraz pacjentów z MPP+DSI.Tabela ta porównuje charakterystykę demograficzną, rutynowe parametry hematologiczne oraz istotne cechy kliniczne u pacjentów z samym MPP oraz u pacjentów z MPP powikłanym przez DSI. Przedstawiono porównania międzygrupowé oraz odpowiadające im wartości P.
| Zmienna | lub | 95% CI | wartość p | |
| niższy | górny | |||
| miR-93-5p (niski vs wysoki poziom) | 6.702 | 1.487 | 30.211 | 0.013 |
| wiek | 1.126 | 0.286 | 4.437 | 0.866 |
| płeć | 1.071 | 0.27 | 4.248 | 0.923 |
| Czas trwania gorączki | 73.416 | 15.018 | 358.895 | <0.001 |
| Czas stosowania antybiotyków | 7.921 | 1.877 | 33.421 | 0.005 |
Tabela 3: Analiza regresji logistycznej u dzieci z zakażeniem MP powikłanym uszkodzeniem układu pokarmowego.Tabela ta przedstawia wyniki analizy regresji logistycznej oceniającej czynniki powiązane z uszkodzeniem układu pokarmowego u dzieci z zakażeniem MP. Analiza obejmuje OR, 95% CI oraz wartość P dla każdej zmiennej.
Skróty: Baso%, odsetek bazofili; CI, przedział ufności; CRP, białko C-reaktywne; DSI, uszkodzenie układu pokarmowego; Eos%, odsetek eozynofili; IκBα, inhibitor kappa B alfa; IL-6, interleukina-6; MP, Mycoplasma pneumoniae; MPP, zapalenie płuc wywołane Mycoplasma pneumoniae; NC, kontrola negatywna; Net%, odsetek neutrofili; oe-TLR4, nadekspresja TLR4; OR, iloraz szans; ROC, charakterystyka operacyjna odbiornika; TLR4, receptor Toll-podobny 4; TNF-α, czynnik martwicy nowotworu-α; WBC, liczba białych krwinek.
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Surowe dane liczbowe stanowiące podstawę wykresów i tabel zostały przedstawione w Tabeli uzupełniającej 1.
Tabela uzupełniająca 1: Surowe dane numeryczne do rysunków i tabel. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Choć infekcja MP jest uznawana przede wszystkim za patogen płucny, może ona powodować różnorodne powikłania pozapłucne, wpływając na wiele układów narządowych poza płucami19,20. Pojawiające się dowody sugerują istnienie interakcji wzdłuż osi płuca-jelita, w której mediatory zapalne uwalniane podczas patologii płuc zaburzają równowagę flory jelitowej21 oraz funkcje jelit22. Ta dwukierunkowa interakcja podkreśla znaczenie kompleksowej oceny pacjenta, obejmującej zarówno objawy oddechowe, jak i stan zdrowia układu pokarmowego. W związku z tym krążące biomarkery surowicze przyciągnęły coraz większą uwagę jako małoinwazyjne narzędzia o potencjalnej wartości diagnostycznej lub prognostycznej23,24. MiRNA okazały się obiecującymi kandydatami ze względu na swoją stabilność oraz rolę w regulacji ścieżek sygnalizacyjnych związanych ze stanem zapalnym, biorących udział w patogenezie MP25,26,27. Niniejsze badanie systematycznie analizowało rolę i znaczenie kliniczne miR-93-5p w pediatrycznym MPP, szczególnie w przypadku powikłań w postaci uszkodzenia układu trawiennego. Poziomy miR-93-5p były obniżone u dzieci z MPP w porównaniu z grupą kontrolną zdrowych dzieci, a jeszcze bardziej zmniejszone u osób z uszkodzeniem układu trawiennego. Wyniki te wskazują na potencjalną rolę dysregulacji miR-93-5p w patologii płuc oraz na jego możliwość zastosowania jako biomarkera objawów pozapłucnych.
MiRNA wykazują wartość diagnostyczną w ciężkim zapaleniu płuc, charakteryzując się obiecującą czułością, swoistością i ogólną dokładnością diagnostyczną28,29. W badaniach klinicznych dzieci z MPP powikłanym przez DSI miały dłuższy czas trwania gorączki i wymagały przedłużonego leczenia antybiotykami w porównaniu z pacjentami bez powikłań układu pokarmowego. W wielowymiarowej analizie regresji logistycznej niższe poziomy miR-93-5p były niezależnie powiązane z zajęciem układu pokarmowego, obok wspomnianych parametrów klinicznych. Ponadto analiza krzywej ROC wykazała korzystną wydajność diagnostyczną surowiczego miR-93-5p w rozróżnianiu pacjentów z MPP z DSI od pacjentów bez DSI. Zatem pomiar miR-93-5p może dostarczyć dodatkowej wartości w celu wczesnej identyfikacji i stratyfikacji ryzyka w pediatrycznych infekcjach MP.
W odniesieniu do wydajności diagnostycznej krążącego miR-93-5p w porównaniu z rutynowymi klinicznymi markerami zapalnymi, wyniki sugerują, że miR-93-5p może stanowić wartość uzupełniającą, a nie zastępować konwencjonalne wskaźniki. CRP oraz prokalcytonina (PCT) pozostają powszechnie stosowanymi biomarkerami w praktyce klinicznej do oceny ciężkości infekcji i kierowania antybiotykoterapią, przy czym metaanalizy wykazują, że PCT wykazuje nieco wyższą dokładność diagnostyczną w porównaniu z CRP w przypadku bakteryjnego zapalenia płuc30. Jednakże te białka ostrej fazy są w dużej mierze nieswoiste, ponieważ reagują na różnorodne bodźce zapalne i nie potrafią wiarygodnie odróżnić zakażenia MP od innych patogenów układu oddechowego ani specyficznie odzwierciedlić ryzyka powikłań pozapłucnych. W przeciwieństwie do nich miR-93-5p, jako cząsteczka regulacyjna związana z sygnalizacją TLR4/jądrowym czynnikiem kappa B (NF-κB), może dostarczać odrębnych informacji patofizjologicznych, które uzupełniają konwencjonalne markery. Wykazano, że korelacja między miR-93-5p a CRP jest stosunkowo słaba (Pearson r = 0,2698), co sugeruje, że miR-93-5p może odzwierciedlać inny aspekt odpowiedzi zapalnej niż systemowa odpowiedź ostrej fazy.
Narastające dowody z modeli zwierzęcych wykazały, że zakażenie Mycoplasma pneumoniae może indukować nie tylko patologię układu oddechowego, ale także uszkodzenia układu pokarmowego poprzez oś płuca-jelito pośredniczoną przez florę jelitową31. U myszy zakażonych MP zaobserwowano uszkodzenia patologiczne zarówno w płucach, jak i w jelicie grubym, wraz ze zmianami w składzie mikrobioty jelitowej, w tym zmniejszeniem liczebności korzystnych bakterii, takich jak Corynebacterium glutamicum, oraz zwiększeniem liczebności potencjalnych patogenów, takich jak Lachnospiraceae NK4A136 group i Escherichia-Shigella, czemu towarzyszyło podwyższone stężenie lipopolisacharydu (LPS) w treści jelita grubego i we krwi32. Poinformowano również, że baikalina łagodzi zapalenie płuc i reguluje florę jelitową u myszy z MPP poprzez szlak TLR4/NF-κB, co potwierdza udział tej kaskady sygnałowej w komunikacji między płucami a jelitami33. Wyniki te są spójne z możliwym udziałem sygnalizacji NF-κB w osi miR-93-5p/TLR4 badanej w niniejszej pracy.
Na poziomie mechanistycznym stwierdzono zwiększoną ekspresję TLR4, kluczowego mediatora odporności wrodzonej związanego z odpowiedziami prozapalnymi34,35,36,37, podczas infekcji MP. Podwyższona ekspresja TLR4 wiązała się ze zwiększonym poziomem cytokin zapalnych IL-6 i TNF-α oraz obniżoną żywotnością komórek nabłonka. Nadekspresja miR-93-5p hamowała ekspresję TLR4, łagodziła uwalnianie cytokin zapalnych i poprawiała przeżywalność komórek w warunkach infekcji. Zatem obniżenie poziomu miR-93-5p u pacjentów z MPP, szczególnie u osób z uszkodzeniem układu pokarmowego, może być związane ze zwiększonym sygnalizowaniem zapalnym zależnym od TLR4 i szerszymi systemowymi odpowiedziami zapalnymi. Niniejsze wyniki nie potwierdzają aktywacji szlaku NF-κB w dół, ponieważ nie oceniano poziomu fosforylowanej IκBα i p65.
Należy uznać kilka ograniczeń niniejszego badania. Po pierwsze, była to analiza jednocentrowa z relatywnie małą wielkością próby, szczególnie w podgrupie DSI, co może ograniczać moc statystyczną i możliwość generalizacji wyników. W celu potwierdzenia tych ustaleń i ustalenia wiarygodnych wartości odcięcia klinicznego wymagana jest zewnętrzna walidacja w większych, wieloośrodkowych kohortach. Po drugie, mimo że IκBα została wykryta za pomocą metody Western blotting, nie przeprowadzono kompleksowej walidacji innych komponentów downstream ścieżki TLR4/NF-κB, w tym MyD88, p-IκBα oraz p65. Walidacja tych komponentów sygnalizacyjnych na poziomie białka wzmocniłaby interpretację mechanistyczną. Po trzecie, obserwacyjny charakter badania wyklucza wnioskowanie przyczynowe; aby ustalić, czy miR-93-5p bezpośrednio przyczynia się do uszkodzeń układu pokarmowego związanych z MPP, konieczne są eksperymenty typu loss-of-function i gain-of-function, w tym zastosowanie mimetyków lub inhibitorów miRNA in vitro lub in vivo. Po czwarte, eksperymenty in vitro przeprowadzono na komórkach nabłonka płuc A549. Chociaż model ten jest odpowiedni do oceny przeciwzapalnych efektów miR-93-5p w kontekście płucnym, nie może on bezpośrednio modelować patologii przewodu pokarmowego. Proponowany związek między sygnalizacją miR-93-5p/TLR4 w płucach a manifestacjami gastrycznymi, potencjalnie zapośredniczony przez oś płuca-jelita, wymaga bezpośredniej walidacji w modelach komórek nabłonka jelitowego, takich jak komórki Caco-2, oraz w modelach zwierzęcych in vivo zakażeń MP. Wreszcie, wyzwania techniczne związane z detekcją miRNA, w tym stabilność RNA i strategie normalizacji, pozostają barierami dla rutynowego wdrożenia klinicznego. Pomimo tych ograniczeń, uzyskane wyniki stanowią podstawę dla przyszłych badań mechanistycznych i szeroko zakrojonych wysiłków walidacyjnych.
Podsumowując, nadekspresja miR-93-5p złagodziła indukowany przez MP stan zapalny w komórkach nabłonka płuc poprzez supresję TLR4. W badaniach klinicznych obniżone poziomy krążącego miR-93-5p były powiązane z uszkodzeniem układu pokarmowego u dzieci z MPP, co sugeruje potencjalną użyteczność tego związku jako pomocniczego biomarkera w identyfikacji pacjentów z ryzykiem wystąpienia powikłań żołądkowo-jelitowych.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ludzkie komórki nabłonka pęcherzyków płucnych A549 | ATCC, USA | Cat# CCL-185; RRID: CVCL_0023 | Linia ludzkich komórek nabłonka pęcherzyków płucnych wykorzystana do modelu MPP in vitro |
| Przeciwciało anty-GAPDH | Hangzhou XianZhi Biological Technology, China | Cat# AB-P-R001; RRID: AB_3096355 | Przeciwciało pierwszorzędowe wykorzystane do detekcji GAPDH jako kontroli załadunku w technice Western blotting |
| Przeciwciało anty-IκBα | Beyotime, China | Cat# AG2741; RRID: AB_3731391 | Przeciwciało pierwszorzędowe wykorzystane do detekcji IκBα w technice Western blotting |
| Seryjna albumina wołowa (BSA) | Solarbio, China | Cat# A8012 | Odczynnik blokujący wykorzystany podczas Western blotting |
| Wirówka | Thermo Fisher Scientific, USA | Multifuge X4 Pro; Cat# 75016066; RRID: SCR_020726 | Wirówka wykorzystana podczas hodowli komórkowej i przygotowania próbek |
| System obrazowania chemiluminescencyjnego | Tanon, China | 5200Multi; RRID: SCR_027114 | System obrazowania wykorzystany do wizualizacji sygnałów chemiluminescencyjnych w Western blot |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega, USA | Cat# E1910 | Wykorzystany do pomiaru aktywności lucyferazy świetlika i Renilla |
| Płodowa surowica wołowa (FBS) | Gibco, USA | Cat# A5256701 | Surowica jako dodatek do pożywki hodowli komórkowej |
| Kozie przeciwciało anty-królicze IgG, sprzężone z HRP | Cell Signaling Technology, USA | Cat# 7074; RRID: AB_2099233 | Drugorzędowe przeciwciało sprzężone z HRP wykorzystane do Western blotting |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 10.1.2; URL: https://www.graphpad.com | Oprogramowanie wykorzystane do analizy statystycznej i prezentacji graficznej |
| Zestaw ELISA do Interleukiny-6 (IL-6) | Elabscience, China | Cat# E-EL-H6156; RRID: AB_3665145 | Zestaw ELISA wykorzystany do ilościowego oznaczania IL-6 |
| Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | Cat# L3000015 | Odczynnik lipidowy wykorzystany do transfekcji komórek A549 |
| Czytnik mikropłytek | Tecan, Switzerland | Infinite M Plex; RRID: SCR_026522 | Czytnik mikropłytek wykorzystany do pomiaru gęstości optycznej przy 490 nm |
| Mimiki miR-93-5p | Ribobio, China | Cat# miR10000093-1-5 | Syntetyczna mimika miR-93-5p wykorzystana do nadekspresji miR-93-5p |
| Kontrola negatywna miR-93-5p | Ribobio, China | Cat# miR1N0000001-1-5 | Kontrola negatywna dla transfekcji mimiką miR-93-5p |
| Zestaw do testu proliferacji i cytotoksyczności komórek MTT | Beyotime, China | Cat# C0009S | Wykorzystany do oceny żywotności komórek |
| Standardowy szczep Mycoplasma pneumoniae ATCC 15531 | ATCC, USA | Cat# 15531 | Standardowy szczep M. pneumoniae wykorzystany do stworzenia modelu infekcji |
| Wektor reporterowy lucyferazy pGL3-Basic | Promega, USA | Cat# E1751 | Wektor reporterowy wykorzystany w podwójnym teście reporterowym lucyferazy |
| Fosforanowy bufor solny (PBS) | Solarbio, China | Cat# IP9212 | Bufor wykorzystany do przemywania komórek i przygotowania próbek |
| Substrat Western Pierce ECL | Thermo Scientific, USA | Cat# 32209 | Substrat chemiluminescencyjny wykorzystany do detekcji w Western blot |
| Pożywka PPLO (Pleuropneumonia-like organism) | BD, USA | Cat# 255420 | Pożywka hodowlana wykorzystana dla M. pneumoniae |
| Membrana z polifluorowodorku winylidenu (PVDF) | Bio-Rad | Cat# 1620177 | Membrana wykorzystana do transferu białek podczas Western blotting |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara Bio Inc., Japan | Cat# RR036A | Mieszanina reakcyjna do odwrotnej transkrypcji wykorzystana do syntezy cDNA |
| PrimeScript RT Reagent Kit | Takara Bio Inc., Japan | Cat# RR037A | Zestaw odczynników wykorzystany do odwrotnej transkrypcji |
| System Real-time PCR | Applied Biosystems, USA | QuantStudio 3 Real-Time PCR System; RRID: SCR_020238 | Instrument do Real-time PCR wykorzystany do analizy qPCR |
| Pożywka RPMI-1640 | Gibco, USA | Cat# 11875135 | Pożywka do hodowli komórkowej wykorzystana dla komórek A549 |
| SPSS | IBM | Version 27.0; RRID: SCR_016479 | Oprogramowanie wykorzystane do analizy statystycznej |
| Kontrola negatywna nadekspresji TLR4 | Ribobio, China | NA | Kontrola negatywna dla eksperymentów nadekspresji TLR4 |
| Plazmid do nadekspresji TLR4 (oe-TLR4) | Ribobio, China | NA | Plazmid wykorzystany do nadekspresji TLR4 |
| Odczynnik TRIzol | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Cat# 15596026 | Odczynnik wykorzystany do ekstrakcji całkowitego RNA |
| Zestaw ELISA do czynnika martwicy nowotworów-α (TNF-α) | Elabscience, China | Cat# E-EL-H0109; RRID: AB_3665144 | Zestaw ELISA wykorzystany do ilościowego oznaczania TNF-α |
| Universal SYBR qPCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japan | Cat# BL697A | Mieszanina reakcyjna wykorzystana do ilościowej PCR |
| System elektroforezy żelowej Western blot | Bio-Rad, USA | Mini-PROTEAN Tetra Cell; Cat# 1658004 | System elektroforezy wykorzystany do rozdziału białek |
Bibliografia
- Yan C et al. Current status of Mycoplasma pneumoniae. infection in China. World Journal of Pediatrics. 2024;20(1):1-4.
- Poddighe D. Extra-pulmonary diseases related to Mycoplasma pneumoniae. in children: recent insights into the pathogenesis. Current Opinion in Rheumatology. 2018;30(4). doi:10.1097/BOR.0000000000000494.
- Schildgen O et al. Clinical manifestations in infants and children with Mycoplasma pneumoniae. infection. PLOS ONE. 2018;13(4). doi:10.1371/journal.pone.0195288.
- Li X et al. Intestinal necrosis due to nonocclusive mesenteric ischemia in a child with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia: a case report. BMC Infectious Diseases. 2025;25(1):1049.
- Ran B, Yang Z, Li M. METTL3-mediated miR-4534 maturation promotes IVDD progression by targeting the Sirt6-mediated Nrf2/HO-1 pathway. 2024;21(6):2795-2813.
- Du B et al. The lung-gut crosstalk in respiratory and inflammatory bowel disease. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2023;13. doi:10.3389/fcimb.2023.1218565.
- Jiang Y et al. Intestinal bacteria flora changes in patients with Mycoplasma pneumoniae pneumonia. with or without wheezing. Scientific Reports. 2022;12(1):5683.
- Lin L-J et al. The diagnostic value of serological studies in pediatric patients with acute Mycoplasma pneumoniae. infection. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 2020;53(2):351-356.
- Cui J et al. Integrated microfluidic cartridge for rapid and colorimetric detection of Mycoplasma pneumoniae. Microchimica Acta. 2025;192(9):559.
- Wang X, Starodubtseva MN, Kapron CM, et al. Cadmium, von Willebrand factor and vascular aging. NPJ Aging. 2023;9(1):11.
- Chen J. Efficacy of the PDCA cyclic care model in improving lung function and speed of recovery in children with Mycoplasma pneumonia. American Journal of Translational Research. 2025;17(3):1792-1802.
- Li Y et al. Clinical significance of serum miR-98-5p in children with Mycoplasma pneumoniae. infection complicated with digestive system damage. Immunobiology. 2025;230(4):153101.
- Zhang Y, Wu ZM. LINC02605 involved in paediatric pneumonia complicated with diarrhoea via miR-539-5p/CXCL1 axis. European Journal of Clinical Investigation. 2024;54(9). doi:10.1111/eci.14234.
- Gao H et al. Knockdown of lncRNA MEG3 protects against sepsis-induced acute lung injury in mice through miR-93-5p-dependent inhibition of NF-κB signaling pathway. Pathology - Research and Practice. 2022;239:154142.
- Gao H et al. MicroRNA-93 contributes to the suppression of lung inflammatory responses in LPS-induced acute lung injury in mice via the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Int J Mol Med. 2020;46(2):561-570.
- Wedgwood S et al. Intestinal dysbiosis and the developing lung: the role of Toll-like receptor 4 in the gut-lung axis. Frontiers in Immunology. 2020;11. doi:10.3389/fimmu.2020.00357.
- Zou N et al. Transcutaneous auricular vagus nerve stimulation as a novel therapy connecting the central and peripheral systems: a review. Int J Surg. 2024;110(8):4993-5006.
- Chen Y et al. Combination of azithromycin and methylprednisolone alleviates Mycoplasma pneumoniae.-induced pneumonia by regulating miR-499a-5p/STAT3 axis. Exp Ther Med. 2022;24(3):578.
- Poddighe D. Mycoplasma pneumoniae.-related extra-pulmonary diseases and antimicrobial therapy. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 2020;53(1):188-189.
- Meyer Sauteur PM, Ramien ML, Theiler M. Mycoplasma pneumoniae.: extrapulmonary manifestations in children with focus on mucocutaneous disease. The Pediatric Infectious Disease Journal. 9900. doi:10.1097/INF.0000000000004946.
- Liu C et al. Mast cells participate in regulation of lung-gut axis during Staphylococcus aureus pneumonia. Cell Proliferation. 2019;52(2).
- Guo J et al. People are an organic unity: gut-lung axis and pneumonia. Heliyon. 2024;10(6).
- Fan F et al. Clinical characteristics and serum inflammatory markers of community-acquired mycoplasma pneumonia in children. The Clinical Respiratory Journal. 2023;17(7):607-617.
- Ding L, Jiang Y. Biomarkers associated with the diagnosis and prognosis of Mycoplasma pneumoniae. pneumonia in children: a review. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2025;15. doi:10.3389/fcimb.2025.1552144.
- Peng W et al. Comparative analysis of the efficacy and safety of different methods for injecting polidocanol in the treatment of venous malformations. Phlebology. 2024;39(9):629-635.
- Wang J et al. Peripheral blood microR-146a and microR-29c expression in children with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia and its clinical value. Italian Journal of Pediatrics. 2023;49(1):119.
- Chu C et al. High expression of miR-222-3p in children with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia. Italian Journal of Pediatrics. 2019;45(1):163.
- Powell BH, Witwer KW, Meffert MK. Cellular miRNAs and viruses: trends in miRNA sequestering and target de-repression. J Virol. 2025;99(7).
- Gan T, Yu J, He J. miRNA, lncRNA and circRNA: targeted molecules with therapeutic promises in Mycoplasma pneumoniae. infection. Arch Microbiol. 2023;205(8):293.
- Im PK et al. Hyperuricemia, gout and the associated comorbidities in China: findings from a prospective study of 0.5 million adults. The Lancet Regional Health – Western Pacific. 2025;58. doi:10.1016/j.lanwpc.2025.101572.
- Hu J et al. Insight into the pathogenic mechanism of Mycoplasma pneumoniae. Curr Microbiol. 2022;80(1):14.
- Li B et al. Cecropin AD ameliorates pneumonia and intestinal injury in mice with Mycoplasma pneumoniae. by mediating gut microbiota. BMC Vet Res. 2025;21(1):39.
- Song D et al. The mechanism of baicalin in improving pulmonary inflammatory response and injury and regulating intestinal flora in Mycoplasma pneumoniae pneumoni.a mice. Cellular Signalling. 2025;126:111530.
- Coutinho-Wolino KS et al. Bioactive compounds modulating Toll-like 4 receptor (TLR4)-mediated inflammation: pathways involved and future perspectives. Nutrition Research. 2022;107:96-116.
- Thorburn AN et al. TLR2, TLR4 and MyD88 mediate allergic airway disease (AAD) and Streptococcus pneumoniae-induced suppression of AAD. PLOS ONE. 2016;11(6).
- Tang J et al. Effect of gut microbiota on LPS-induced acute lung injury by regulating the TLR4/NF-kB signaling pathway. International Immunopharmacology. 2021;91:107272.
- Jia H et al. Pulmonary epithelial TLR4 activation leads to lung injury in neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 2016;197(3):859-871.