Kompleksowy, dwuplatformowy i pełny przepływ pracy dla profilowania metabolicznego mikropróbek zasuszonej krwi

Podsumowanie

Niniejszy protokół przedstawia kompleksowy, pełny proces niecelowanej metabolomiki z wykorzystaniem urządzeń do objętościowego mikropróbkowania absorpcyjnego (VAMS). Celem jest efektywna analiza próbki przy użyciu pojedynczej ekstrakcji na dwóch komplementarnych platformach analitycznych (RP-LC-MS oraz GC-MS), co tworzy solidne ramy dla zdecentralizowanych badań klinicznych na dużą skalę.

Streszczenie

Mikropróbkowanie krwi (BµS) stało się solidną, małoinwazyjną alternatywą dla tradycyjnego nakłucia żyły, umożliwiając pobieranie próbek o małej objętości poza konwencjonalnymi warunkami klinicznymi. Dzięki wspieraniu zdecentralizowanego próbkowania i poprawie przestrzegania zaleceń przez pacjentów, urządzenia te mogą być integrowane z zaawansowanymi technologiami omicznymi, co ułatwia projektowanie szeroko zakrojonych i podłużnych badań. Jednakże pomyślne wdrożenie wymaga optymalizacji wielu krytycznych etapów, od pobierania i przechowywania próbek, po ekstrakcję i przygotowanie analityczne. W niniejszej pracy proponujemy kompleksowy, kompleksowy proces analityczny (workflow) dla nietargetowanej metabolomiki w BµS, ze szczególnym uwzględnieniem kluczowych parametrów wpływających na przygotowanie próbek i wydajność analityczną. Urządzenia do wolumetrycznego absorpcyjnego mikropróbkowania (VAMS) zostały ocenione przy użyciu dwóch komplementarnych platform: chromatografii cieczowej w fazie odwróconej sprzężonej ze spektrometrią mas oraz chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Zastosowanie zoptymalizowanego procesu wykazało szeroki zakres metabolomiczny obejmujący różnorodne klasy chemiczne, co podkreśla potencjał próbkowania opartego na VAMS w wspieraniu skalowalnych, zdecentralizowanych badań metabolomicznych przy zachowaniu solidności analitycznej, powtarzalności i istotności biologicznej.

Wprowadzenie

Metabolomika, czyli systematyczne badanie cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej w matrycach biologicznych, zyskała znaczącą popularność jako kluczowe narzędzie służące do wyjaśniania fenotypów komórkowych i dynamicznych stanów metabolicznych^1,2. W zastosowaniach klinicznych metabolomika krwi daje duże nadzieje poprzez zwiększenie wydajności diagnostycznej i umożliwienie bardziej kompleksowej oceny ryzyka chorób, często uzupełniając luki pozostawione przez konwencjonalną diagnostykę. Jednakże uchwycenie pełnego metabolomu jest z natury trudne. Ze względu na ogromną złożoność chemiczną i zróżnicowane zakresy stężeń endogennych metabolitów, żadna pojedyncza platforma analityczna nie jest w stanie zapewnić całkowitego pokrycia, co sprawia, że zastosowanie komplementarnych technik analitycznych jest niezbędne dla maksymalizacji przeglądu metabolicznego.

Mikropróbkowanie krwi (BµS) jest małoinwazyjną techniką pobierania próbek, która polega na pobraniu kilku µL krwi. Uproszczony sposób pozyskiwania materiału eliminuje konieczność przeprowadzania flebotomii, co umożliwia pobieranie próbek w warunkach domowych i zwiększa komfort pacjenta. Ponadto wykazano, że przejście z matrycy ciekłej na wysuszoną zwiększa stabilność wielu labilnych metabolitów oraz upraszcza logistykę transportu i przechowywania, ponieważ nie są wymagane niskie temperatury^3,4,5. Choć BµS jest stosowane od dziesięcioleci, głównie w formie suchych kropli krwi (DBS) do diagnostyki wrodzonych błędów metabolizmu, ta klasyczna technika posiada pewne wady analityczne. Procedura pobierania nie pozwala na ilościowe pobranie próbki, co sprawia, że technika jest podatna na tzw. „efekt hematokrytu”, w którym zmienność lepkości krwi zmienia rozkład krwi, tym samym obniżając dokładność ilościową. Aby pokonać to ograniczenie, opracowano urządzenia do ilościowego BµS. Wolumetryczne absorpcyjne mikropróbkowanie (VAMS) to nowoczesna technologia BµS, która wykorzystuje polimerową końcówkę zaprojektowaną do pobierania dokładnej objętości krwi, co pozwala przełamać ograniczenia tradycyjnej metody DBS^6,7,8.

W konsekwencji globalny profil metaboliczny BµS budził coraz większe zainteresowanie w ostatnich latach^{9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}. Opublikowane prace porównujące BµS z tradycyjnymi macierzami wykorzystują kilka technik analitycznych, obejmujących szeroki zakres polarności: od elektroforezy kapilarnej¹⁷ (CE) i chromatografii cieczowej z oddziaływaniem hydrofilowym^18,19 (HILIC) sprzężonej ze spektrometrią mas (MS) dla związków polarnych, po spektrometrię mas w odwróconej fazie^18,19,21 (RP-MS) dla metabolitów o średniej polarności i lipidów. Tradycyjne metody ekstrakcji napotykają zasadną barierę: optymalizacja pod kątem jednego instrumentu często oznacza odrzucenie kluczowych frakcji chemicznych i utratę danych metabolicznych. W przypadku bardzo ograniczonej objętości próbek przeprowadzenie wielu oddzielnych analiz jest utrudnione. Zatem opracowanie pojedynczego protokołu ekstrakcji kompatybilnego z wieloma platformami analitycznymi pozostaje znacznym wyzwaniem.

Niniejszy schemat opisuje procedury podwójnej analizy urządzeń VAMS przy użyciu RP-LC-MS oraz chromatografii gazowej (GC). Z tego, co nam wiadomo, jest to pierwszy schemat niecelowanego profilowania metabolicznego BµS, który łączy te dwie ortogonalne platformy z wykorzystaniem jednej procedury ekstrakcji próbki. Ponadto podkreślono w nim najważniejsze kroki niezbędne do zapewnienia niezawodnego i powtarzalnego pozyskania kompleksowego, niecelowanego profilu metabolicznego.

Protokół

Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Badań Uniwersytetu Arystotelesa w Salonikach (#306272/2022).

1. Pobieranie próbek

1. Umyj dłonie badanego ciepłą wodą, aby usunąć potencjalne zanieczyszczenia i zwiększyć przepływ krwi.
2. Oczyść palec za pomocą 70% roztworu etanolu. Odczekaj, aż roztwór naturalnie odparuje.
   UWAGA: Stosowanie środków dezynfekujących na bazie jodu lub mydła może zakłócać analizy LC-MS.
3. Odkręć nakrętkę sterylnego, jednorazowego lancetu aktywowanego przez kontakt (głębokość 1,5 mm). Przyłóż go do środka opuszki palca i naciśnij.
4. Zetrzyj pierwszą kroplę krwi i poczekaj, aż uformuje się nowa kropla.
   UWAGA: Ze względu na możliwe zanieczyszczenie miejscowym płynem pozakomórkowym, pierwsza kropla może nie odzwierciedlać systemowych poziomów krążenia.
5. Nie wyjmując urządzenia z uchwytu, dotknij końcówki 20 µL urządzenia VAMS kropli krwi. Urządzenie powinno być ustawione pionowo nad próbką. Unikaj całkowitego zanurzenia końcówki w krwi, ponieważ może to prowadzić do pobrania nadmiaru próbki.
   UWAGA: Podczas pobierania próbek z probówki zawierającej krew żylną, co może być konieczne w warunkach laboratoryjnych, upewnij się, że końcówka dotyka tylko powierzchni cieczy, bez zanurzania, aby uniknąć pobrania nadmiaru próbki.
6. Po nasyceniu końcówki, co następuje w momencie całkowitego zabarwienia jej na czerwono, przytrzymaj ją w tym miejscu przez dodatkowe dwie sekundy, a następnie wyjmij z próbki krwi.
7. Umieść próbki w oryginalnych pudełkach na płaskiej, czystej powierzchni, z dala od bezpośredniego światła słonecznego lub ciepła, zapobiegając dotykaniu końcówki jakiegokolwiek zewnętrznego przedmiotu, i pozostaw je do wyschnięcia na 2 h w temperaturze pokojowej i wilgotności otoczenia.
8. Przechowuj próbki w worku z osuszaczem w temperaturze −80 °C do czasu analizy. Transport musi odbywać się w suchym lodzie.
   UWAGA: W przypadku ukierunkowanej analizy BµS, w której stabilność analitycznego została już zbadana, próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej przez sugerowany czas. Jednak w przypadku analizy nieukierunkowanej zaleca się przechowywanie w temperaturze –80 °C, ponieważ niektóre analityki pozostają podatne na degradację nawet w wysuszonej matrycy. Tabela rozwiązywania najczęstszych problemów podczas pobierania próbek przedstawiona jest w Tabeli 1.

2. Procedura ekstrakcji metabolitów

1. Odczep cały końcówkę od plastikowego uchwytu i umieść ją w probówce do mikrowirówki z okrągłym dnem (do odczepienia końcówki od uchwytu należy użyć zakrętki probówki do mikrowirówki).
2. Rehydratyzuj, dodając 50 µL ultraczystej wody bezpośrednio na końcówkę.
3. Dodaj 400 µL metanolu zawierającego mieszaninę IS (np. izotopowo znakowany kwas D-mirystynowy), aby wyekstrahować metabolity i wspomóc wytrącanie białek.
   UWAGA: OSTROŻNIE: Metanol jest toksyczny i bardzo łatwopalny. Należy z nim pracować pod wyciągiem/dygestorium.
4. Poddaj próbki sonikacji w kąpieli lodowej przez 10 min w trybie ciągłym (zalecana moc 215/860 W, częstotliwość 35 kHz).
5. Ostrożnie wyjmij końcówkę pęsetą, czyszcząc ją metanolem pomiędzy próbkami.
6. Wiruj przy 6720 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
7. Przenieś 150 µL supernatantu do nowych probówek. Dla każdej próbki użyj tej samej objętości. Do analizy RPLC użyj nowej probówki do mikrowirówki, a do analizy GC nowej szklanej fiolki o pojemności 1,5 mL.
8. Przenieś po 50 µL supernatantu z każdej próbki do jednej wspólnej fiolki, aby przygotować zpoolowaną próbkę QC dla danego badania.
9. Krótko wymieszaj w wortexie, aby zapewnić całkowitą homogenizację, a następnie podziel na kilka aliquotów o objętości takiej samej jak próbki badawcze. Do analizy RPLC użyj nowej probówki do mikrowirówki, a do analizy GC nowej szklanej fiolki o pojemności 1,5 mL.
10. Odparuj supernatanty do suchości za pomocą koncentratora próżniowego w trybie odparowywania wodnego, przy poziomie próżni −600 mmHg (−800 mbar) i prędkości obrotowej 1400 rpm, w temperaturze pokojowej. Próbki wysychają w około 2 h.
    UWAGA: Uważnie monitoruj odparowywanie i wyjmij fiolki z koncentratora, aby zapobiec utracie związków lotnych po całkowitym odparowaniu rozpuszczalnika. Punkt przerwania: Próbki w formie wysuszonej mogą być mrożone w temperaturze −80 °C przez noc aż do momentu analizy.

3. Procedura przed analizą LC-MS

1. Rozpuścić wysuszoną pozostałość w 100 µL rozpuszczalnika do rekonstytucji, takiego jak początkowa faza ruchoma (np. 5–10% metanolu w wodzie).
   UWAGA: Objętość oraz rozpuszczalnik do rekonstytucji mogą zostać dostosowane do warunków chromatograficznych.
2. Rekonstytuować próbkę QC w tym samym rozpuszczalniku i objętości co próbkę badaną (zawsze zachowując ten sam stosunek objętości próbki do rozpuszczalnika).
3. Krótko wymieszać w wortexie, a następnie wirować przez 10 min przy 6720 x g w temperaturze 4 °C.
4. Przenieść nadsącz do fiolki do autosamplera z wkładką.

4. Procedura poprzedzająca analizę GC-MS

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki należy przeprowadzić w dygestorium.

1. Przygotować odczynnik do metoksyaminacji, rozpuszczając 40 mg chlorowodorku metoksyaminy w 1 mL pirydyny.
   UWAGA: OSTROŻNIE: Pirydyna jest toksyczna. Należy z nią pracować w dygestorium.
2. Przygotować odczynnik do derywatyzacji, dodając 10 µL trimetylochlorosilanu (TMCS) do 1 mL N-metylo-N-(trimetylisilylo)trifluoroacetamidu (MSTFA).
   UWAGA: OSTROŻNIE: Zarówno TMCS, jak i MSTFA są toksyczne. Należy z nimi pracować w dygestorium.
3. Dodać 10 µL odczynnika do metoksyaminacji (chlorowodorek metoksyaminy 40 mg/mL w pirydynie) do wysuszonych osadów z próbek badawczych i próbek kontroli jakości (QC).
4. Krótko wymieszać próbki na wirówce typu vortex, aby zapewnić dokładne wymieszanie odczynnika.
5. Inkubować próbki w temperaturze 30 °C przez 90 min. Inkubację przeprowadza się statycznie.
6. Odczekać do ochłodzenia się próbek do temperatury pokojowej, a następnie dodać 90 µL odczynnika do derywatyzacji (MSTFA 1% TMCS).
7. Wymienić zakrętki fiolek na nowe i mieszać próbki na wirówce typu vortex przez 30 s w celu uzyskania homogenicznej mieszaniny.
8. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 30 min. Inkubację przeprowadza się statycznie.
9. Odczekać do ochłodzenia się próbek do temperatury pokojowej, a następnie dodać 10 µL standardu wstrzykiwanego (np. pentadekan 6,25 mg/L w pirydynie) do każdej próbki.
10. Wymienić zakrętki fiolek na nowe, krótko wymieszać na wirówce typu vortex i przenieść końcową mieszaninę do szklanych fiolek chromatograficznych z mikroinsertami.
11. Umieścić fiolki w tacy autosamplera.
12. Pozostawić próbki w autosamplerze na 4 h w temperaturze pokojowej przed pierwszym wstrzyknięciem w celu ich wyrównania.
    UWAGA: Derywatyzacja kończy się po 4 h, a metabolity są stabilne w temperaturze pokojowej do 24 h po pełnej derywatyzacji. Odpowiednio dostosować liczbę próbek w każdej serii, aby próbki nie pozostawały w autosamplerze dłużej niż 28 h (od momentu dodania MSTFA 1% TMCS). Schematy metod przygotowania próbek przedstawiono na Rysunku 1A–C.

5. Konfiguracja RP-LC-MS

1. Przygotować eluenty RP oraz roztwory do płukania zgodnie z Tabelą 2.
   UWAGA: OSTROŻNIE: Kwas mrówkowy i izopropanol są łatwopalne. Kwas mrówkowy jest również toksyczny. Obie substancje należy obsługiwać w dygestorium.
2. Zainstalować kolumnę HSS T3 C18 (100 mm x 2.1 mm, 1.7 µm) w termostacie kolumny.
3. Umieścić wszystkie linie w odpowiednich kanałach i odpowiednio przepłukać każdy kanał.
4. Ustawić temperaturę kolumny na 40 °C.
5. Rozpocząć płukanie kolumny roztworem 100% A:0% B z szybkością przepływu 0.1 mL/min.
6. Zwiększać szybkość przepływu w krokach co 0.1 mL/min, oczekując na stabilizację ciśnienia kolumny pomiędzy krokami, aż do osiągnięcia przepływu 0.35 mL/min. Sprawdzić szczelność układu.
7. Równoważyć kolumnę w warunkach początkowych gradientu (0% B) przez około 30 min.
   UWAGA: Monitorować ciśnienie kolumny i upewnić się, że pozostaje ono w oczekiwanym zakresie (5000–6000 psi).
8. Uruchomić sekwencję próbek.

6. Konfiguracja GC-MS

1. Zainstaluj kolumnę kapilarną DB-5 (5% – fenylometylopolysiloksanu) w termostacie kolumny.
2. Ustaw początkową temperaturę kolumny na 60 °C.
3. Ustaw początkową temperaturę wtryskiwacza PTV na 110 °C.
4. Uruchom sekwencję próbek.

Wyniki

Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki analizy nietargetowanej urządzeń VAMS, przeprowadzonej zgodnie z opisaną powyżej procedurą.

Oceniono dane z analizy potrójnej próbki zbiorczej przygotowanej z krwi żylnej 10 osób, pobranej za pomocą VAMS, i przedstawiono charakterystykę otrzymanych odcisków metabolicznych. Jakość danych oraz informacje pozyskane z urządzeń VAMS oceniono w oparciu o dwa główne kryteria: całkowitą liczbę wykrytych cech chemicznych oraz powtarzalność tych cech (n = 3), wyrażoną jako procentowe odchylenie standardowe (%RSD). Całkowitą liczbę cech wykorzystano do oceny zakresu ekstrakcji i pokrycia chemicznego rozpuszczalnika, natomiast monitorowano %RSD, aby zapewnić precyzję techniczną i odporność metody; niższa wartość %RSD wskazuje na wysoką powtarzalność procesu ekstrakcji, co minimalizuje szum analityczny.

Po ekstrakcji i przetwarzaniu surowych danych uzyskano macierz cech m/z-czas retencji (RT) wraz z ich intensywnościami. Po odpowiednim wstępnym przetwarzaniu i etapach filtrowania próbek ślepych uwzględniono jedynie cechy z wykrywalnym sygnałem w dwóch z trzech powtórzeń. Rysunek 2A,B przedstawia wykresy m/z w funkcji RT dla tej samej próbki analizowanej zgodnie z opisanymi protokołami dla LC-MS oraz GC-MS.

Wysoka liczba cech eluowanych wczesną fazą przebiegu RPLC wynika z obecności silnie hydrofilowych metabolitów, które zostały wyekstrahowane zgodnie z zastosowanym protokołem, lecz słabo zatrzymują się na kolumnie fazy odwróconej. Choć wcześnie eluowane metabolity stanowią wyzwanie w procesie identyfikacji, precyzyjne adnotacje są wciąż możliwe dzięki wykorzystaniu danych fragmentacji MS/MS oraz porównaniom z bazami danych widm i wewnętrznymi wzorcami referencyjnymi. Ponadto oczekuje się, że znaczna część tej frakcji hydrofilowej zostanie uchwycona podczas analizy GC-MS. W ostatecznym rozrachunku stanowi to immanentne ograniczenie tej dziedziny, gdyż ogromna złożoność metabolomu wymusza stosowanie wielu platform analitycznych.

Wieloplatformowa ocena ekstraktów metanolowych wyraźnie wykazuje wysoce komplementarny charakter analitycznych przepływów pracy LC i GC, a wskaźniki wydajności mieszczą się w zakresie oczekiwanym dla kompleksowego profilowania metabolomicznego. Rycina 3A,B przedstawia całkowitą liczbę cech oraz rozkład RSD% dla każdej platformy. Platforma LC zapewniła szeroki zakres pokrycia chemicznego, rozdzielając 4169 cech, co jest zgodne z jej uznaną zdolnością do wychwytywania szerokiego spektrum związków polarnych, półpolarnych i nielotnych. Równocześnie platforma GC wykazała mniejszy podzbiór cech, wynoszący 187. Było to oczekiwane, ponieważ GC może wykrywać jedynie związki lotne podatne na derywatyzację.

W odniesieniu do powtarzalności, jak pokazano na wykresie skrzypcowym, ogólny rozkład i rozpiętość wartości RSD% są niezwykle podobne dla LC-MS i GC-MS. Średnia wartość %RSD była typowa dla obu platform i wynosiła około 29,7% dla LC (2 655 z 4 169 miało %RSD poniżej 30%) oraz 32,3% dla GC (114 z 187 miało %RSD poniżej 30%). Chociaż niewielka liczba cech wykazywała wyższe wartości RSD w obu przypadkach, taka zmienność jest powszechna i oczekiwana w nietargetowanej metabolomice. Wyższe wartości te zazwyczaj dotyczą metabolitów o niskim stężeniu, które znajdują się blisko granicy wykrywalności instrumentu. Ogólnie, wąskie profile rozkładu potwierdzają satysfakcjonującą powtarzalność dla obu konfiguracji analitycznych.

Przestrzeń chemiczną metabolitów uchwyconych za pomocą tego protokołu można przeanalizować na podstawie adnotacji metabolitów. Zgodnie z oczekiwaniami, wynikającymi z naturalnej komplementarności obu platform, za pomocą LC-MS i GC-MS wykryto różne związki. Pełna lista adnotacji metabolitów dla urządzeń VAMS znajduje się w Tabeli uzupełniającej 1 oraz Tabeli uzupełniającej 2. Łącznie za pomocą tego protokołu i obu technik wykryto i zidentyfikowano 97 metabolitów (poziom 1 i 2, zgodnie z propozycją Sumnera i wsp. (2007)²²), oprócz innych związków przypuszczalnie scharakteryzowanych na poziomie 3. Adnotacje GC zostały dodatkowo potwierdzone poprzez porównanie eksperymentalnych indeksów retencji – uzyskanych w porównaniu z FAMES – z wartościami tabelarycznymi²³. Rycina 4A,B przedstawia rozkład podklas zidentyfikowanych metabolitów dla obu metod, natomiast Rycina 4C pokazuje nakładanie się obu technik, co podkreśla ich komplementarność. Kilka kluczowych metabolitów pośrednich może zostać zweryfikowanych krzyżowo obiema technikami, podczas gdy cechy strukturalnie unikalne lub specyficzne dla danej platformy mogą uzupełniać luki w głównych szlakach metabolicznych węgla i szlakach metabolizmu wtórnego. Choć aminokwasy i peptydy stanowią główne klasy chemiczne w obu analizach, tylko nieliczne metabolity są wspólne dla obu technik. Wiele klas metabolitów jest specyficznych dla konkretnego urządzenia, np. acylo karnityny w LC-MS i heksozy w GC-MS.

Aby zademonstrować wydajność metanolu jako rozpuszczalnika do ekstrakcji w obu technikach, przeprowadzono próby porównawcze na próbkach VAMS z wykorzystaniem różnych układów rozpuszczalników, a następnie wykonano analizy LC-MS i GC-MS. Trzy różne układy rozpuszczalników porównano z metanolem w trzech powtórzeniach: czystym acetonitrylem (ACN), mieszaniną metanol–woda (60:40, v/v) oraz mieszaniną acetonitryl–metanol (70:30, v/v). Wybór tych rozpuszczalników i mieszanin był podyktowany wstępnymi eksperymentami przeprowadzonymi przez nasz zespół, a także wcześniej opublikowaną literaturą^13,14,24,25. Wydajność ekstrakcji każdego układu oceniono za pomocą trzech kluczowych parametrów: całkowitej liczby wykrytych cech, ogólnej intensywności cech oraz powtarzalności cech, wyrażonej jako względne odchylenie standardowe (RSD, %).

W przypadku analizy LC-MS największą liczbę cech wykryto przy użyciu MeOH-H2O (60:40, v/v), ze średnią 4 514 cech w trzech powtórzeniach, a następnie w czystym MeOH (4 169 cech). Mieszanina ACN–MeOH (70:30, v/v) dała średnio 3 502 cechy, natomiast czysty ACN przyniósł najniższą średnią liczbę cech, wynoszącą 2 836. Graficzna reprezentacja tych liczb cech dla każdego powtórzenia przedstawiona jest na Ryc. 5A.

Aby zbadać charakterystykę precyzji dla każdego warunku ekstrakcji, przeanalizowano intensywności cech oraz wartości %RSD z trzech powtórzeń wstrzykiwań. Porównanie całkowitej liczby cech oraz średniego %RSD dla każdego rozpuszczalnika do ekstrakcji w analizie LC-MS przedstawiono na Ryc. 5A. Rozkłady sygnałów log₂ były podobne dla wszystkich ekstraktów, przy czym MeOH-H2O 60:40 (v/v), ACN i MeOH dawały nieco wyższą liczebność niż ACN-MeOH 70:30 (v/v). MeOH wykazała niższy ogólny średni %RSD, co wskazuje, że ekstrakcja przy użyciu tego rozpuszczalnika była bardziej powtarzalna.

Podobna ocena wydajności systemu rozpuszczalników do ekstrakcji została przeprowadzona na podstawie danych GC-MS. Ponownie, w celu oceny liczby cech, uwzględniono tylko te, w których sygnał wykryto w co najmniej dwóch z trzech powtórzeń. Rozpuszczalnikiem, który pozwolił na uzyskanie największej liczby cech, był ACN-MeOH 70:30 (v/v) (216 cech), a tuż za nim uplasował się MeOH (187 cech). Graficzna ilustracja liczby wykrytych cech w zależności od rozpuszczalnika do ekstrakcji i BµS przedstawiona jest na Rysunku 5B.

W odniesieniu do ogólnej obfitości wykrytych cech, MeOH okazał się najskuteczniejszy, dając najwyższą obfitość, co przedstawiono na Rysunku 5B. Drugim najlepszym rozpuszczalnikiem był MeOH-H₂O 60:40 (v/v), a następnie ACN-MeOH 70:30 (v/v). ACN był najmniej skutecznym rozpuszczalnikiem. W odniesieniu do %RSD cech, MeOH-H₂O 60:40 (v/v) zapewnił najniższe wartości RSD dla VAMS (RSD = 38,57%), a tuż za nim ACN (42,65%), MeOH (44,14%) oraz ACN-MeOH 70:30 (v/v) (49,14%). Wartości te przedstawiono na Rysunku 5B.

Powyższe wyniki są zgodne z wcześniej opublikowaną literaturą. Couacault i wsp. (2026)¹⁹ zgłosili porównywalną liczbę cech w analizie RP-LC-MS próbek DBS i VAMS, stosując podobny skład rozpuszczalnika do ekstrakcji (rehydratacja 80 µL wody, a następnie dodanie 320 µL MeOH). Podobnie Cala i wsp. (2017)¹¹ wykryli porównywalną liczbę cech (153) podczas analizy GC-MS końcówek VAMS. Chociaż większość istniejących badań nie oceniała precyzji analiz z wykorzystaniem tych urządzeń, nasze ogólne wnioski są zgodne z oczekiwaniami dla analizy nietargetowanej. Co więcej, wyniki LC są zgodne z raportowanymi przez Bossi i wsp. (2025)²⁶ dla analizy HILIC mikropróbek DBS i qDBS, w której większość wykrytych cech miała RSD < 30%.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wykazują, że ekstrakcja z użyciem metanolu zapewnia optymalną równowagę pomiędzy liczbą cech, intensywnością a precyzją (średnie RSD, %) dla analizy próbek VAMS zarówno metodą LC-MS, jak i GC-MS. W związku z tym pojedynczy protokół ekstrakcji metanolowej może usprawnić podwójne przygotowanie próbek, ułatwić równoległe pozyskiwanie komplementarnych profili metabolicznych i zmaksymalizować ilość uzyskanych informacji.

Rycina 1: Schematy protokołów przedstawiające (A) protokół ekstrakcji próbek, (B) rekonstytucję do LC-MS oraz (C) derywatyzację do GC-MS/MS. Utworzone w BioRender. Marques, D. (2026) https://BioRender.com/dprdv18, https://biorender.com/xu2qh34, https://biorender.com/7ztz2qv. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2: porównania m/z i rt dla reprezentatywnej próbki w analizie (A) LC-MS oraz (B) GC-MS. Każda kropka reprezentuje pojedynczy sygnał przed jego pogrupowaniem w cechy. Kolory reprezentują intensywność sygnału MS1 dla danej cechy, przy czym intensywność wzrasta od koloru niebieskiego do czerwonego. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Pokrycie cech i powtarzalność w różnych platformach analitycznych. (A) Pokrycie cech: Całkowita liczba unikalnych cech wykrytych przez LC (turkusowy) i GC (pomarańczowy), z dokładnymi liczbami naniesionymi nad każdym słupkiem. (B) Powtarzalność cech: Wykresy skrzypcowe przedstawiające gęstość rozkładu względnych odchyleń standardowych (RSD%) dla wszystkich cech. Wbudowane wykresy pudełkowe wskazują medianę oraz rozstępy międzykwartylowe; poszczególne punkty danych pominięto dla przejrzystości wizualnej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Histogramy przedstawiające liczbę związków z różnych klas chemicznych wykrytych za pomocą (A) LC-MS oraz (B) GC-MS. (C) Część wspólna metabolitów z adnotacją poziomu 1 i 2 pomiędzy platformami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wyniki zastosowania rozpuszczalników ekstrakcyjnych w analizie LC-MS (A) oraz GC-MS (B) urządzeń VAMS. Wykresy słupkowe w górnej części rysunku przedstawiają liczbę cech uzyskanych z każdego rozpuszczalnika ekstrakcyjnego zastosowanego w urządzeniach VAMS na powtórzenie. Wykresy w dolnej części rysunku pokazują sumę intensywności oraz średnie RSD (%) dla każdego rozpuszczalnika ekstrakcyjnego użytego w urządzeniu VAMS. Rozmiar okręgu reprezentuje całkowitą sumę intensywności wykrytych cech w skali log2, co odzwierciedla wydajność ekstrakcji. Gradient kolorów wskazuje precyzję analityczną, wyrażoną jako względne odchylenie standardowe (RSD), gdzie kolor żółty oznacza wyższą precyzję, a czerwony większą zmienność. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Tabela rozwiązywania problemów. Przegląd typowych problemów z pobieraniem próbek, ich przyczyn oraz rozwiązań w przypadku pobierania próbek za pomocą urządzeń VAMS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela 2: Eluenty RP i roztwory płuczące. Przegląd składów faz ruchomych, płynu do płukania uszczelnień, rozpuszczalnika do płukania układu i rozpuszczalnika do mycia stosowanych w analizie chromatograficznej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Dodatkowe szczegóły eksperymentalne. Parametry LC-MS i GC-MS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Adnotacje LC-MS. Związki zidentyfikowane za pomocą obecnego protokołu na platformie LC-MS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Adnotacje GC-MS. Związki zidentyfikowane za pomocą obecnego protokołu na platformie GC-MS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Nierukierowana metabolomika zapewnia unikalny wgląd w skład chemiczny próbek biologicznych. Jednak ze względu na ogromną różnorodność chemiczną metabolomu, żadna technika nie pozwala na całkowite scharakteryzowanie małych cząsteczek obecnych we krwi. Dlatego niezbędne jest stosowanie technik komplementarnych w celu zwiększenia zakresu wykrywanych metabolitów i poprawy całkowitej ilości informacji uzyskanych z tych badań. Jednak mała objętość mikropróbek krwi, takich jak VAMS, sprawia, że przygotowanie próbek do różnych analiz jest dużym wyzwaniem.

W niniejszym protokole przedstawiono kompleksowy schemat postępowania w celu profilowania metabolicznego końcówek VAMS z wykorzystaniem podwójnej ekstrakcji oraz dwóch komplementarnych technik analitycznych. Chociaż opublikowano już prace dotyczące analizy nietargetowanej próbek VAMS^{11,12,13,15,17,18,19,20,21,27}, każda z nich koncentrowała się na jednej technice analitycznej. Jest to pierwszy protokół, który dostosowuje ekstrakcję z urządzeń VAMS tak, aby umożliwić przeprowadzenie analiz LC oraz GC-MS w ramach jednego schematu postępowania.

Niniejszy protokół podaje konkretne objętości rozpuszczalników i ekstraktów w celu uzyskania przedstawionych wyników; niewielkie modyfikacje można dostosować do indywidualnych konfiguracji w zależności od czułości sprzętu, dostępnych objętości iniekcji oraz wymagań dotyczących próbek QC. Na przykład objętość wody do rehydratacji dodawanej w kroku 2.2 można zmienić z 50 na 80 µL, aby upewnić się, że końcówka jest całkowicie zwilżona. Objętość metanolu w kroku 2.3 można zwiększyć z 400 do 500 µL, aby uzyskać większą objętość ekstraktu do rozdzielenia na więcej próbek QC. Należy jednak zauważyć, że zwiększenie objętości rozpuszczalnika doprowadzi do większego rozcieńczenia analitów. Ponadto objętości pobierane do analizy i próbek QC w krokach 2.7 i 2.8 można odpowiednio dostosować (z 150 do 200 µL w kroku 2.7 oraz z 20 do 50 µL w kroku 2.8), aby dopasować je do pożądanej objętości dla każdej próbki. Co istotne, objętości te można dowolnie modyfikować bez konieczności proporcjonalnego skalowania. Choć standardowy stosunek rozpuszczalnika do próbki 3:1 jest zazwyczaj wystarczający do pełnej ekstrakcji, w tej metodzie zastosowano większy nadmiar rozpuszczalnika, aby zapewnić całkowite zanurzenie całego urządzenia BµS, co czyni protokół odpornym i bezpośrednio możliwym do zastosowania przy wszystkich sugerowanych objętościach.

Dane z LC-MS i GC-MS można analizować za pomocą różnych narzędzi programistycznych o otwartym kodzie źródłowym. W niniejszej pracy wyniki LC-MS uzyskano, stosując przepływ pracy Metabonaut²⁸ z XCMS. W przypadku próbek GC-MS przetwarzanie danych przeprowadzono przy użyciu programu MSDial v. 5.5.2603²³. Samouczki są dostępne pod adresem (https://systemsomicslab.github.io/mtbinfo.github.io/MS-DIAL/tutorial.html). Szczegółowe parametry przetwarzania danych LC-MS i GC-MS znajdują się w Pliku uzupełniającym 1.

Zaleca się przetwarzanie każdego zestawu danych indywidualnie, z wykorzystaniem próbek QC w oddzielnej partii w celu optymalizacji parametrów przetwarzania przed ich zastosowaniem do całego zestawu danych. Normalizację należy przeprowadzić po wstępnym przetwarzaniu danych. Zarówno XCMS, jak i MSDial posiadają wbudowane narzędzia do normalizacji. W niniejszej pracy normalizację wykonano przy użyciu oprogramowania open-source QCMXP²⁹, stosując model liniowy oparty na odpowiedziach próbek QC.

Należy wyróżnić niektóre krytyczne etapy, głównie w części dotyczącej przygotowania próbek, aby zapewnić wiarygodność otrzymanych wyników.

Obecny protokół został opracowany przy użyciu systemu LC sprzężonego z quadrupolowym spektrometrem mas czasu przelotu (LC-QTOF-MS) oraz systemu chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS), z parametrami wyszczególnionymi w materiale uzupełniającym S1. W przypadku zastosowania innego typu LC lub GC, parametry muszą zostać zoptymalizowane dla konkretnej konfiguracji. W analizach metabolomicznych opartych na GC-MS i LC-MS należy zaplanować wstrzyknięcia próbek ślepych na początku i na końcu serii analitycznej. Przed wstrzyknięciem jakichkolwiek próbek kontroli jakości (QC), próbki QC do kondycjonowania muszą zostać wstrzyknięte od 10 do 15 razy w systemie LC-MS oraz od 5 do 10 razy w systemie GC-MS, aby ukondycjonować kolumnę macierzą, która ma być analizowana. Próbki QC do kondycjonowania muszą być przygotowane zgodnie z tą samą procedurą, co pozostałe próbki QC. Próbki QC wewnątrzbadań należy wstrzykiwać okresowo, a ich udział powinien wynosić około 10% wszystkich wstrzykniętych roztworów.

Obsługa końcówek VAMS jest jednym z krytycznych etapów w tym schemacie postępowania. Należy zadbać o to, aby końcówka nie dotknęła żadnej powierzchni poza wnętrzem probówki do mikrocentryfugi, ponieważ może to doprowadzić do utraty analitytu. Ponadto etap wstępnej hydratacji jest niezbędny dla prawidłowej ekstrakcji analitytu: podczas gdy wstępna rehydratacja wydaje się zwiększać odzysk poprzez ułatwienie uwalniania analitytu przed wytrąceniem, przypuszcza się, że bezpośrednie dodawanie rozpuszczalników organicznych wywołuje natychmiastowe wytrącanie białek w strukturze końcówki, tworząc barierę fizyczną, która ogranicza późniejszą ekstrakcję metabolitów.

Ponadto należy upewnić się, że końcówka została usunięta przed etapem wirowania. Choć może to prowadzić do niewielkiej utraty roztworu, zaniechanie tego kroku wpływa na odzysk supernatantu. Końcówka może łatwo spowodować resuspensję osadu, co uniemożliwi zebranie czystego supernatantu.

Należy zwrócić uwagę na kilka ogólnych kwestii dotyczących stabilności, aby zapewnić uzyskanie najlepszych wyników. Po pierwsze, próbki powinny być przechowywane w warunkach chłodniczych, najlepiej w temperaturze −80 °C do momentu analizy. Zaleca się rozmrażanie próbek w łaźni lodowej lub w lodówce. Aby zapobiec degradacji, zaleca się jak najszybsze wprowadzenie próbki do systemu chromatograficznego. Jeśli jednak z powodu ograniczeń czasowych wstrzyknięcie nie jest możliwe, wysuszony ekstrakt można zamrozić na noc bez znaczącej utraty stabilności.

Należy również zwrócić uwagę na niektóre etapy procedury GC-MS. Proces derywatyzacji składa się z dwóch kroków. Pierwszym z nich jest metoksyaminacja, która chroni grupy ketonowe, które w przypadku braku ochrony ulegają utracie karboksylowej w postaci dwutlenku węgla. Następnie przeprowadza się trimetylosilylację. MSTFA reaguje z cząsteczkami zawierającymi protony kwasowe, które są powszechne w grupach karboksylowych, hydroksylowych, aminowych, iminowych i sulfonylowych. Taka reakcja zmniejsza polarność analitycznych i wprowadza dużą, zawadzką grupę, co obniża ich temperaturę wrzenia²³. Kluczowe jest, aby próbka była całkowicie sucha przed dodaniem metoksyaminy, ponieważ woda może zakłócać ochronę analitów. Należy również pamiętać, że istotne jest pozostawienie próbek do ustabilizowania w temperaturze pokojowej po wyjęciu ich z pieca, ponieważ otwarcie fiolki przed tym czasem może spowodować utratę lotnych metabolitów. Ponadto nakrętki do GC mogą rozszerzać się podczas podgrzewania, co może prowadzić do nieszczelnego zamknięcia fiolki i stopniowej utraty analitów. Z tego powodu zaleca się wymianę nakrętki GC po każdym etapie inkubacji.

Niemniej jednak, w odniesieniu do protokołu GC-MS, należy wziąć pod uwagę kwestie dotyczące czasu pochodnowania. Wykazano, że metabolity reagują nadal nawet po wyjęciu z pieca, a plateau stężenia zostaje osiągnięte po 4 h. Plateau to pozostaje stabilne do 24 h po całkowitym pochodnowaniu^30,31. Dlatego bardzo ważne jest tak zorganizowanie przygotowania próbek, aby pochodnowane próbki pozostawały w autoprobniku nie dłużej niż 28 h po reakcji z MSTFA. W przypadku dużych partii analitycznych zaleca się, aby wszystkie próbki były przygotowywane jednocześnie, co pozwoli ograniczyć zmienność międzyobserwacyjną w przygotowaniu próbek i zapewni możliwość połączenia aliquotów z każdej próbki w mieszaninie QC. Próbki można przechowywać w formie wysuszonych pozostałości w temperaturze −80 °C, a rozmrażać i pochodnować należy tylko te, które mają zostać przeanalizowane w ciągu kolejnych 24 h²⁷. Zaleca się również przykrycie fiolek folią laboratoryjną, aby zapobiec pochłanianiu wilgoci przez próbkę w zamrażarce. Na koniec zaleca się stosowanie świeżo przygotowanych roztworów do pochodnowania oraz przestrzeganie ogólnych wytycznych dotyczących zapewnienia jakości w analizach metabolomicznych w obu metodologiach, aby zapewnić wiarygodność wyników³².

Choć porównanie obecnego schematu postępowania z tradycyjną analizą osocza wykracza poza zakres niniejszej pracy, zagadnienie to było szeroko omawiane w literaturze^{17,18,19,20,21,27}. Zazwyczaj urządzenia VAMS dostarczają profili jakościowych porównywalnych z osoczem, jednak zawartość analizowanych substancji różni się między macierzami w sposób specyficzny dla danego anality, nawet przy równoważnych objętościach (20 µL). Różnice te wynikają prawdopodobnie z obecności komponentu komórkowego w BµS, różnic między krwią kapilarną a żylną lub interferencji wynikających z obecności wysuszonej macierzy podczas analizy. Wymusza to walidację wyników uzyskanych z urządzeń BµS przed ich zastosowaniem w praktyce klinicznej.

Aby dostosować proponowany protokół do rutynowych, wysokoprzepustowych procesów laboratoryjnych, można wprowadzić kilka modyfikacji oraz strategii rozwiązywania problemów. Po pierwsze, objętości rozpuszczalnika do ekstrakcji mogą zostać zwiększone, zwłaszcza przy przygotowywaniu większych serii próbek QC. Należy jednak pamiętać, że zwiększenie objętości ekstrakcji nieuchronnie rozcieńcza próbkę, co może prowadzić do zmniejszenia intensywności sygnału, chyba że proporcjonalnie skoryguje się późniejszą objętość rekonstytucji. Dodatkowo skład rozpuszczalnika do rekonstytucji w chromatografii cieczowej może zostać zoptymalizowany tak, aby odpowiadał początkowemu gradientowi fazy ruchomej dla konkretnych konfiguracji aparatury.

Głównym ograniczeniem niniejszego protokołu jest niewielka wielkość próbki. Ponieważ pojedyncza próbka o objętości 20 µL jest dzielona w celu analizy na dwóch różnych systemach, związki występujące w niskich stężeniach mogą spaść poniżej poziomu wykrywalności na mniej czułym urządzeniu. Niemniej jednak, wadę tę równoważy wygoda pobierania próbek oferowana przez BµS oraz szerszy zakres analizy chemicznej zapewniony przez techniki komplementarne. Ponadto, choć etap odparowywania w protokole mógłby teoretycznie spowodować utratę związków lotnych, jego rzeczywisty wpływ na substancje lotne nie został oceniony. Mimo to, ponieważ odparowanie jest niezbędne do derywatyzacji próbki i pozwala na jej rekonstytucję w mniejszej objętości w celu zwiększenia czułości LC, korzyści praktyczne przeważają nad potencjalną utratą sygnału. Chociaż w poprzednich badaniach zajmowano się nietargetowaną analizą mikropróbek^{7,11,12,13,15,17,18,19,20,27}, niniejszy protokół jest, według wiedzy autorów, pierwszym kompletnym schematem postępowania dla analizy urządzeń do wolumetrycznego mikropróbkowania absorpcyjnego (VAMS) przy użyciu LC oraz GC-MS z jednej ekstrakcji.

Ponadto, ocena dodatkowych wskaźników mogłaby jeszcze bardziej wzmocnić te wnioski. Po pierwsze, walidacja wyników poprzez porównanie międzylaboratoryjne z zastosowaniem dokładnie tego samego protokołu dwupłatformowego potwierdziłaby odporność metody i pozwoliła ocenić jej wydajność na różnych instrumentach LC-MS i GC-MS. Dodatkowo, w niniejszym badaniu nie oceniono zmienności międzyoperatorowej podczas przygotowania lub pobierania próbek. Wreszcie, dalsza analiza badająca wpływ przechowywania na integralność próbek oraz efekt hematokrytu stanowią kluczowe obszary, w których obecne badanie mogłoby zostać rozszerzone. Biorąc pod uwagę, że w analizie nietargetowanej priorytetem jest szeroki zakres pokrycia metabolitów i porównania relatywne między próbkami, różnice indywidualne w konkretnych metabolitach z różnych klas chemicznych nie naruszają ważności danych. W związku z tym wpływ hematokrytu i przechowywania powinien być badany pod tym kątem. Takie dane są nieliczne, poza badaniem Volani i wsp. (2023), które wykazało, że urządzenia VAMS pozostają stabilne w temperaturze −80 °C przez 6 miesięcy²⁴.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fiolki szklane 1,5 ml	Rozwiązania laboratoryjne	ACSV0902A	Stosowane do przenoszenia i odparowywania frakcji GC, przeprowadzania reakcji pochodnowania oraz końcowego wtrysku do chromatografu gazowego.
Acetonitryl (AcN)	Odczynniki BDA firmy VWR	BDH92497.320	stopień czystości LC-MS. Oceniać jako składnik rozpuszczalnika do ekstrakcji.
D27-Kwas mirystynowy	Sigma Aldrich	366889	Dodano do rozpuszczalnika do ekstrakcji metanolowej w celu monitorowania wydajności ekstrakcji oraz parametrów analitycznych.
Kolumna kapilarna DBS-5 (5% – fenylometylopolisiloksan)	Agilent Technologies	122-5332UI	Kolumna kapilarna do chromatografii gazowej zainstalowana w termostacie GC do analizy GC-MS.
Eppendorf Concentrator plus	Eppendorf	5,3E+09	Służy do odparowania nadsączów próbek do całkowitej suchości przed przechowywaniem lub rekonstytucją/derywatyzacją.
Mieszanina wzorcowa estrów metylowych kwasów tłuszczowych	Sigma Aldrich	SMB00937-1ML	Stosowane w celu wyznaczenia indeksów retencji metabolitów do adnotacji GC.
Kwas mrówkowy	Odczynniki chemiczne VWR BDA	PI85178	Klasy LC-MS. Stosowany jako dodatek w stężeniu 0,1% w fazach ruchomych A i B do RP-LC-MS.
Kolumna HSS T3 C18 (100 mm x 2,1 mm, 1.7 µm)	Waters Corporation	1,9E+08	Kolumna do chromatografii cieczowej w odwróconej fazie zainstalowana w termostacie kolumny do analizy RP-LC-MS/MS.
Izopropanol	Laboratorium Chemiczne	CL00.0926.2500	stopnia LC-MS. Składnik roztworu do płukania uszczelnienia (H2O:izopropanol 80:20 v/v).
Film laboratoryjny	Parafilm	PM-996	Służy do owijania i przykrywania fiolek podczas przechowywania w temperaturze -80°C aby uniknąć pochłaniania wilgoci.
Metanol (MeOH)	Odczynniki VWR BDA	AA47192-K2	czystości LC-MS lub GC-MS. Stosowany do optymalizacji rozpuszczalnika do ekstrakcji, przygotowania standardu wewnętrznego oraz faz ruchomych.
Wodorochlorek metoksyaminy	Sigma Aldrich	89803	Służy do przygotowania odczynnika do metoksyaminacji (40 mg/ml w pirydynie) w celu ochrony grup ketonowych/karbonylowych.
Mikrowkładki	Rozwiązania laboratoryjne	ACIV300IC	Służy do przechowywania roztworu przed wstrzyknięciem.
Mikropróbkowanie krwi za pomocą systemu Mitra (BµS) Urządzenia 20 µL	Neoteryx / Trajan Scientific and Medical	200004	Polimerowe końcówki do wolumetrycznego mikropróbkowania absorpcyjnego (VAMS) stosowane do precyzyjnego pobierania małymi objętościami próbek krwi.
N-metylo-N-(trimetylosililo)trifluoroacetamid (MSTFA)	Resztki	35601	Odczynnik sylilujący stosowany do zmniejszania polarności i punktów wrzenia analitów poprzez reakcję z protonami kwasowymi.
Piekarnik	Heraleus	8,1E+09	Stosowane w reakcjach pochodnowania: metoksyaminizacja w 30°C przez 90 min oraz tymylosylację w 37°C przez 30 min.
Pentadekan	Sigma Aldrich	K2015R	Przygotowano w stężeniu 6,25 mg/L. Dodano do każdej próbki przed końcowym przeniesieniem do fiolki GC w celu weryfikacji jakości wstrzyknięcia.
Chłodząca wirówka Pro-Research	Centurion Scientific Lab	CL00.1688.2500	Zdolny do chłodzenia do 4°C i osiągając prędkości do 10 000 x g.
Pirydyna	Sigma Aldrich	23053	Stopień bezwodny. Rozpuszczalnik stosowany do rozpuszczenia chlorowodorku metoksyaminy w pierwszym etapie derywatyzacji.
Probówki do mikrocentrifugowania z okrągłym dnem	FL Medical	TS-88530	Służy do odpinania i przechowywania końcówki VAMS podczas rehydratacji, ekstrakcji i wirowania.
Trimetylochlorosilan (TMCS)	Alfa Aesar	Nie dotyczy	Katalizator derywatyzacji. Dodany do MSTFA w stosunku 1% v/v.
Pinceta	Nie dotyczy	N/D	Służy do ostrożnego wyjmowania końcówek VAMS z probówek. Należy czyścić metanolem pomiędzy próbkami.
Woda ultrapure (H₂O)2O)	demineralizator Hydrolab (Straszyn, Polska)	Nie dotyczy	18,2 MΩ·oporność cm. Stosowana do rehydratacji końcówek, mieszanin do ekstrakcji oraz fazy ruchomej A.
Kąpiel ultradźwiękowa Sonorex Digitec DT	Bandelin	Nie dotyczy*	Stosowane z kąpielą lodową w przypadku opcji ekstrakcji trwającej 10 minut zamiast 30–60 minut na stole agitacyjnym.
Jednorazowy lancet aktywowany przez kontakt (głębokość 1,5 mm)	[firma — Proszę o potwierdzenie.	[numer katalogowy # — Proszę o potwierdzenie.	Służy do wykonania nakłucia palca w celu pobrania krwi kapilarnej (krok 1.3).
Roztwór etanolu (70%)	[firma — Proszę potwierdzić]	[numer katalogowy # — proszę potwierdzić	Służy do dezynfekcji opuszki palca przed pobraniem próbki (Krok 1.2).
system LC-QTOF-MS (układ Bruker Elute LC sprzężony z kwadrupolowym spektrometrem mas czasu przelotu)	Bruker	[numer katalogowy # — Proszę o potwierdzenie.	System LC-MS w odwróconej fazie wykorzystany do analizy RP-LC-MS (Sekcja 5); wcześniej wymieniony bezpośrednio w treści Dyskusji bez wpisu w Tabeli materiałów.
system GC-MS (Bruker EVOQ-456)	Bruker	[nr katalogowy # — Proszę o potwierdzenie.	System chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas używany do analizy GC-MS (Sekcja 6); wcześniej wymieniony bezpośrednio w treści dyskusji bez  wpis dotyczący materiałów.