Standaryzowana akupunktura w połączeniu z modyfikowanym wywarem Xiaoxuming w leczeniu ostrego udaru niedokrwiennego: randomizowane badanie kontrolowane

Podsumowanie

To zrandomizowane badanie kontrolowane dostarcza powtarzalnego protokołu standaryzowanej akupunktury oraz zmodyfikowanego wywaru Xiaoxuming jako terapii wspomagającej w opiece nad pacjentami z ostrym udarem niedokrwiennym mózgu. Interwencja wiązała się z umiarkowaną poprawą neurologiczną w 28. dniu oraz różnicami w wybranych biomarkerach; analizy na poziomie uczestników nie potwierdziły mediacji ani roszczenia o przyczynową mediację.

Streszczenie

Ostreму udarowi niedokrwiennemu towarzyszy ogólnoustrojowy stan zapalny oraz zaburzenia mikrobioty jelitowej. W tym jednocentrowym, zrandomizowanym badaniu kontrolowanym z zaślepieniem oceniającego sprawdzono, czy standaryzowana akupunktura oraz zmodyfikowany wywar Xiaoxuming, dodane do standardowej opieki, poprawiają wczesną regenerację neurologiczną i są powiązane z wcześniej określonymi biomarkerami jelitowymi i zapalnymi. Dorośli pacjenci z potwierdzonym w badaniach obrazowych ostrym udarem niedokrwiennym w ciągu 72 h oraz wynikiem w skali National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS) od 4 do 15 zostali zrandomizowani w stosunku 1:1 do grupy otrzymującej standardową opiekę lub połączoną interwencję przez 28 dni, przy 64 uczestnikach w każdej grupie. Głównym punktem końcowym był wynik NIHSS w 28. dniu, skorygowany o wyjściowy NIHSS, wiek, płeć, terapię reperfuzyjną oraz czas od wystąpienia objawów do randomizacji, przy czym brakujące wyniki uzupełniono metodą 30-krotnej wielokrotnej imputacji. Wtórne i eksploracyjne punkty końcowe obejmowały indeks Barthel, zmodyfikowaną skalę Rankin (mRS) w 90. dniu, zdarzenia niepożądane, markery zapalne, lipopolisacharydy (LPS), różnorodność mikrobioty kałowej, wybrane rodzaje bakterii oraz krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe. Analiza wielokrotnej imputacji wykazała niższy wynik NIHSS w 28. dniu w grupie interwencyjnej (skorygowana różnica: −1.30 punktu; 95% przedział ufności: od −2.36 do −0.24; P = 0.017). Indeks Barthel w 28. dniu był wyższy, natomiast wynik NIHSS, indeks Barthel oraz obserwowany wynik mRS 0–2 w 90. dniu nie różniły się znacząco. W 28. dniu grupa interwencyjna wykazywała wyższą różnorodność wskaźnika Shannon oraz wyższy poziom maślanu w kale, a niższy poziom interleukiny-6 i LPS. Zmiany na poziomie uczestników w zakresie poziomu maślanu, interleukiny-6, LPS i różnorodności Shannon nie były istotnie powiązane ze zmianą wyniku NIHSS; w związku z tym nie przeprowadzono analizy mediacji. Nie zidentyfikowano żadnych poważnych zdarzeń niepożądanych związanych z interwencją. Połączona interwencja wiązała się z umiarkowaną wczesną poprawą neurologiczną i różnicami w wybranych biomarkerach, jednak wyniki biologiczne mają charakter eksploracyjny i nie ustanawiają przyczynowej ścieżki oś mózg-jelita.

Wprowadzenie

Udar pozostaje główną przyczyną zgonów i długotrwałej niepełnosprawności na całym świecie, a udar niedokrwienny odpowiada za większość przypadków. Standardowa opieka kładzie nacisk na szybką diagnostykę, reperfuzję w razie wskazań, terapię przeciwpłytkową, zarządzanie czynnikami ryzyka, zapobieganie powikłaniom oraz rehabilitację^1,2. Nawet przy zastosowaniu tych środków często występują trwałe deficyty neurologiczne, co motywuje do oceny powtarzalnych interwencji wspomagających.

Stan zapalny po niedokrwieniu, stres śródbłonka i bariery krew-mózg, obwodowa aktywacja immunologiczna oraz zaburzenia metaboliczne przyczyniają się do wtórnego uszkodzenia i regeneracji³. Udar może również zmieniać motorykę jelit, ich przepuszczalność, skład mikrobioty oraz pochodzące z jelit sygnały immunologiczne, tworząc dwukierunkowe powiązania powszechnie opisywane jako oś mózg-jelita⁴.

Badania kliniczne powiązały ostry udar niedokrwienny z dysbiozą jelitową, zmienionymi profilami krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) oraz gorszymi wynikami terapeutycznymi⁵. Maślan budzi szczególne zainteresowanie, ponieważ wspiera integralność bariery nabłonkowej i reguluje sygnalizację immunologiczną⁶. Powyższe obserwacje uzasadniają pomiar różnorodności mikrobiologicznej, metabolitów mikrobiologicznych, ekspozycji na endotoksyny oraz mediatorów zapalnych równolegle z wynikami neurologicznymi, przy jednoczesnym uznaniu, że równoległe zmiany nie dowodzą mediacji.

Akupunktura była oceniana jako pomocnicza terapia udaru, jednak opublikowane badania różnią się pod względem czasu rozpoczęcia, doboru punktów akupunkturowych, częstotliwości oraz oceny wyników^7,8. W związku z tym powtarzalny protokół wymaga precyzyjnego określenia procedur nakłuwania, stymulacji, czasu pozostawienia igieł, bezpieczeństwa oraz przestrzegania zaleceń. Wywar Xiaoxuming to klasyczna formuła ziołowa stosowana w stanach związanych z udarem. Badania systematyczne i farmakologiczne wskazują na możliwe korzyści, jednak dowody kliniczne pozostają ograniczone ze względu na wielkość próby, heterogeniczność i ryzyko błędu^9,10. Jego wkładu nie można oddzielić od akupunktury w dwugrupowym projekcie z interwencją łączoną.

W badaniu tym oceniono standaryzowaną interwencję łączoną, wykorzystując wyniki kliniczne oraz zdefiniowane wcześniej eksploracyjne biomarkery jelitowe i zapalne¹¹. Postawiono hipotezę, że dodanie standaryzowanej akupunktury oraz zmodyfikowanego wywaru Xiaoxuming do standardowej opieki poprawi wczesną regenerację neurologiczną i korzystnie wpłynie na zdefiniowane wcześniej biomarkery związane z osią mózgowo-jelitową.

Protokół

Zatwierdzenie etyczne dla niniejszego badania zostało wydane przez Komisję Etyki Medycznej Szpitala Medycyny Tradycyjnej Chińskiej i Medycyny Zachodniej w mieście Dazhou w dniu 10 czerwca 2025 r. (nr zatwierdzenia 2025–29; ważne do 9 czerwca 2027 r.). Każdy uczestnik lub jego ustawowy przedstawiciel wyraził pisemną świadomą zgodę przed randomizacją. Zgoda obejmowała akupunkturę, leczenie ziołowe, pobieranie krwi i kału, ochronę danych mikrobiomu oraz możliwość wycofania się z pobierania próbek biologicznych bez utraty standardowej opieki. Procedury były zgodne z Deklaracją Helsińską. Narzędzia badawcze wykorzystane w protokole są wymienione w Tabeli materiałów. Badanie nie zostało zarejestrowane prospektywnie, ponieważ rejestracja nie została zakończona przed rozpoczęciem rekrutacji uczestników.

1. Projekt badania i randomizacja

Uczestników rekrutowano od 1 marca do 31 grudnia 2025 roku, a każdy z nich był obserwowany przez 90 dni. W badaniu zastosowano jednocentrowy projekt z równoległymi grupami, z zaślepieniem dla osoby oceniającej i 28-dniową aktywną interwencją. Kwalifikowalnych uczestników przydzielono w stosunku 1:1 do grupy opieki standardowej lub grupy opieki standardowej uzupełnionej o akupunkturę i zmodyfikowany wywar Xiaoxuming. Randomizacja została przeprowadzona za pomocą generowanych komputerowo bloków po 4 lub 6 osób i była stratyfikowana według wyjściowej punktacji NIHSS (4–8 vs. 9–15). Przydział został utajniony przy użyciu sekwencyjnie numerowanych, nieprzezroczystych, zapieczętowanych kopert.

Końcowa 28-dniowa interwencja została zakończona 28 stycznia 2026 r., ostatnia wizyta kontrolna odbyła się 31 marca 2026 r., baza danych została zamknięta 15 kwietnia 2026 r., a zaplanowana analiza została ukończona do 30 kwietnia 2026 r. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami CONSORT¹²; przepływ uczestników przedstawiono na Rysunku 1, a harmonogram ocen podano w Tabeli 1.

2. Przesiewowe badanie i rekrutacja uczestników

Pacjentów z ostrym udarem niedokrwiennym mózgu, potwierdzonym w tomografii komputerowej lub rezonansie magnetycznym, poddano badaniom przesiewowym w ciągu 72 h od wystąpienia objawów lub ostatniego momentu znanej sprawności. Do badania zakwalifikowano osoby dorosłe w wieku 40–80 lat z wyjściową punktacją w skali National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS) od 4 do 15, stabilnymi oznakami życiowymi po ocenie ratunkowej, możliwością rozpoczęcia przydzielonej interwencji w ciągu 24 h oraz gotowością do przekazania próbek krwi i kału. Oceny NIHSS były przeprowadzane przez przeszkolonych oceniających¹³.

Kryteria wykluczenia obejmowały: krwawienie wewnątrzczaszkowe; przejściowy atak niedokrwienny bez zawału; śpiączkę; planowany zabieg chirurgii dekompresyjnej; niebezpieczny spożycie doustne; aktywną infekcję wymagającą systemowej antybiotykoterapii; stosowanie antybiotyków, suplementów probiotycznych lub prebiotycznych w ciągu 4 tygodni; nieswoiste zapalne choroby jelit; przewlekłą biegunkę; zabiegi chirurgiczne w obrębie przewodu pokarmowego w ciągu 6 miesięcy; nowotwór złośliwy; ciężką niewydolność wątroby lub nerek; niekontrolowane nadciśnienie tętnicze; niestabilną chorobę wieńcową; nieodpowiednią arytmię; liczbę płytek krwi < 80 × 10⁹/L; przeciwwskazania do akupunktury; alergię na preparat ziołowy; ciążę lub okres laktacji; udział w innym badaniu interwencyjnym w ciągu 3 miesięcy; lub niemożność ukończenia obserwacji. Zwykła żywność roślinna, kiszone warzywa i fermentowany tofu nie zostały zakwalifikowane jako produkty zabronione, ponieważ rutynowe diety chińskie nie mogły zostać w pełni ustandaryzowane.

3. Standardowa opieka i ekspozycje istotne dla mikrobiomu

Obie grupy otrzymały opiekę zgodną z wytycznymi, obejmującą dożylną trombolizę i/lub mechaniczną trombektomię w razie wskazań; leczenie przeciwpłytkowe, hipolipemiczne, kontrolę ciśnienia tętniczego i poziomu glukozy; nawadnianie i żywienie; przesiewowe badanie w kierunku dysfagii; zapobieganie zapaleniu płuc i zakrzepicy żył głębokich; rehabilitację oraz wtórną profilaktykę¹⁴. Terapia reperfuzyjna nie została opóźniona ani zastąpiona ze względu na udział w badaniu.

Od momentu randomizacji do 28. dnia badania zabronione było stosowanie akupunktury poza protokołem, moksoterapii, ziołowych receptur związanych z udarem, suplementów probiotycznych/prebiotycznych/synbiotycznych oraz preparatów ukierunkowanych na mikrobiotę. Uczestnicy i opiekunowie zostali poinformowani, że ograniczenia te dotyczą suplementów i dostępnych w handlu produktów probiotycznych, a nie rutynowych produktów spożywczych.

Odnotowano zastosowanie terapii reperfuzyjnej oraz odchylenia od protokołu. Jako potencjalne czynniki zakłócające związane z mikrobiomem zarejestrowano dietę, stopień nasilenia dysfagii, żywienie dojelitowe, antybiotykoterapię po randomizacji, stosowanie inhibitorów pompy protonowej, zaparcia oraz czas hospitalizacji. Zmienne te nie zostały uwzględnione jako współzmienne w statystycznych modelach mikrobiomu, w związku z czym uznano je za rezydualne czynniki zakłócające.

4. Maskowanie alokacji

Sekwencja randomizacji została wygenerowana przez niezależnego statystyka. Ponumerowane sekwencyjnie, nieprzezroczyste, zapieczętowane koperty zostały przygotowane przez koordynatora, który nie brał udziału w rekrutacji, leczeniu, ocenie wyników, pracach laboratoryjnych ani w analizie statystycznej. Następna koperta była otwierana dopiero po uzyskaniu świadomej zgody, potwierdzeniu kwalifikacji oraz zakończeniu ocen wyjściowych. Sekwencja randomizacji była przechowywana w pliku chronionym hasłem, który pozostawał niedostępny dla osób oceniających wyniki, personelu laboratoryjnego i analityków aż do zakończenia głównej analizy.

5. Maskowanie wyników, laboratorium i analizy

Oceny w skalach NIHSS, indeksie Barthel oraz zmodyfikowanej skali Rankin (mRS) zostały przeprowadzone przez oceniających, którzy nie uczestniczyli w podawaniu leczenia. Uczestnicy i opiekunowie zostali poinstruowani, aby nie ujawniać przydziału do grup terapeutycznych osobom dokonującym ocen wyników. Próbki biologiczne oznaczono zakodowanymi identyfikatorami, a personel laboratoryjny oraz statystycy pozostawali zaślepieni w kwestii kodów grup aż do momentu sfinalizowania zaplanowanych analiz. Przypadkowe zdarzenia odmaskowania zostały udokumentowane.

6. Standaryzowana akupunktura manualna

Akupunkturę rozpoczęto w ciągu 24 h po randomizacji, po potwierdzeniu przez neurolog prowadzącego stabilności hemodynamicznej oraz akceptowalnego ryzyka krwawienia. Zabiegi zaplanowano w formie jednej 30-minutowej sesji dziennie, 5 dni w tygodniu przez 4 tygodnie, co łącznie dawało 20 zaplanowanych sesji.

Uczestnicy zostali bezpiecznie ułożeni, a skórę zdezynfekowano przed nakłuciem. Punkty Baihui (GV20), Shuigou (GV26), obustronne Fengchi (GB20), Quchi (LI11), Hegu (LI4), Zusanli (ST36), Yanglingquan (GB34) oraz Sanyinjiao (SP6) nakłuto zgodnie z lateralnością i głębokością określonymi w Tabeli 2¹⁵.

Użyto sterylnych jednorazowych igieł do akupunktury ze stali nierdzewnej o wymiarach 0,25 mm × 40 mm. Igły wprowadzano na głębokość 10–25 mm, zależnie od punktu akupunktury i budowy ciała. Stosowano manualne podnoszenie, wciskanie i obracanie igieł aż do uzyskania efektu deqi lub miejscowej odpowiedzi na nakłucie. Igły pozostawiono na 30 min, przeprowadzając manualną restymulację co 10 min. Nie stosowano elektroakupunktury.

Akupunktura była wykonywana przez licencjonowanych akupunkturystów z co najmniej 5-letnim doświadczeniem klinicznym. Sesje odraczano w przypadku wystąpienia gorączki, niestabilnego ciśnienia tętniczego, pogorszenia stanu neurologicznego, czynnego krwawienia, silnego pobudzenia lub zmęczenia, a także w przypadku odmowy uczestnika. Powód odroczenia oraz wszelkie związane z tym zdarzenia niepożądane były rejestrowane.

7. Zmodyfikowany wywar Xiaoxuming

Każda dawka dobowa zawierała Ephedrae Herba 6 g, Cinnamomi Ramulus 9 g, Paeoniae Radix Alba 12 g, Saposhnikoviae Radix 9 g, Zingiberis Rhizoma Recens 6 g, Glycyrrhizae Radix et Rhizoma 6 g, Angelicae Sinensis Radix 10 g, Chuanxiong Rhizoma 10 g, Astragali Radix 20 g, Poria 15 g oraz Paeoniae Radix Rubra 12 g. Tożsamość przepisanych surowców roślinnych została zweryfikowana przez aptekę szpitalną przed przygotowaniem, a następnie zastosowano rutynowe procedury wydawania i odwaru. Szczegóły receptury przedstawiono w Tabeli 3⁹˒¹⁶.

Dopuszczalne były jedynie zdefiniowane wcześniej modyfikacje. W przypadku zaparć można było dodać 10 g Cannabis Fructus, w przypadku luźnych stolców dawkę Poria można było zwiększyć do 20 g, a przy nasilonym poceniu spontanicznym dawkę Astragali Radix można było zwiększyć do 30 g. Każda modyfikacja, pominięta dawka, epizod wymiotów oraz przerwa w leczeniu były rejestrowane.

Jedną dzienną dawkę odgotowywano w aptece szpitalnej i zagęszczano do 400 mL. Preparat dzielono na dwie porcje po 200 mL i podawano po śniadaniu oraz kolacji przez 28 dni. Podawanie zaprzestano w przypadkach niebezpiecznego połykania, uporczywych wymiotów, alergii, poziomu aminotransferazy alaninowej/asparaginianowej >3× górnej granicy normy, szacowanego współczynnika filtracji kłębuszkowej <45 mL/min/1.73 m², niekontrolowanego ciśnienia tętniczego, klinicznie istotnej tachyarytmii, nowego bólu w klatce piersiowej lub ryzyka określonego przez badacza.

8. Ograniczenia grupy kontrolnej

Uczestnicy przydzieleni do grupy kontrolnej otrzymali wyłącznie standardową opiekę. Do 28. dnia zabronione było stosowanie akupunktury niezgodnej z protokołem, moksoterapii, ziołowych terapii związanych z udarem, suplementów probiotycznych/prebiotycznych/synbiotycznych oraz produktów ukierunkowanych na mikrobiotę. Każde zastosowanie tych interwencji odnotowywano jako odchylenie od protokołu.

9. Monitorowanie przestrzegania zaleceń i bezpieczeństwa

Przestrzeganie zaleceń dotyczących akupunktury obliczono jako liczbę ukończonych sesji podzieloną przez 20 zaplanowanych sesji. Przestrzeganie zaleceń dotyczących ziół oceniano na podstawie zwróconych opakowań oraz dzienniczków przyjmowania leków. Przestrzeganie protokołu zdefiniowano jako ukończenie co najmniej 16 sesji akupunktury i spożycie co najmniej 80% przepisanych dawek odwaru. Pacjenci stacjonarni byli obserwowani codziennie, a pacjenci ambulatoryjni monitorowani podczas zaplanowanych wizyt kontrolnych. Odnotowane zdarzenia niepożądane obejmowały miejscowe krwawienie, krwiaki, ból, zawroty głowy, omdlenia, infekcje, objawy żołądkowo-jelitowe, wysypkę, nieprawidłowości w funkcji wątroby lub nerek, kołatanie serca, wahania ciśnienia tętniczego oraz reakcje alergiczne. Poważne zdarzenia niepożądane oraz ich przypisanie zostały niezależnie sklasyfikowane przez dwóch klinicystów jako niezwiązane, prawdopodobnie związane, bardzo prawdopodobnie związane lub jednoznacznie związane.

10. Ocena wyników klinicznych

Skalę NIHSS oceniano w punkcie wyjściowym oraz w 14., 28. i 90. dniu. Głównym punktem końcowym był wynik NIHSS w 28. dniu, skorygowany o wynik NIHSS w punkcie wyjściowym. Indeks Barthela oceniano w punkcie wyjściowym oraz w 28. i 90. dniu, natomiast skalę mRS oceniano w 90. dniu. Nawroty udaru, zgony z jakiejkolwiek przyczyny oraz zdarzenia niepożądane rejestrowano do 90. dnia¹⁷. Korzystny wynik w 90. dniu zdefiniowano jako mRS 0–2. Wyniki kliniczne i biologiczne, punkty czasowe ocen, definicje oraz klasyfikacje analiz podsumowano w Tabeli 4.

11. Pobieranie krwi i analizy biomarkerów

Krew żylną pobierano w punkcie wyjściowym przed interwencją oraz w dniach 14. i 28., najlepiej między 06:30 a 08:30 po nocnym poście. W stosownych przypadkach dokumentowano pobranie krwi w stanie niepostnym.

Próbki przetworzono w ciągu 2 h. Wirowanie przeprowadzono przy 850 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Surowicę i osocze podzielono na alikwoty w sterylnych probówkach kriogenicznych i przechowywano w temperaturze −80 °C. Próbki pochodzące od tego samego uczestnika, w miarę możliwości, umieszczano w tej samej serii analiz.

Poziom białka C-reaktywnego o wysokiej czułości, interleukiny-6 (IL-6), czynnika martwicy nowotworów alfa, lipopolisacharydu (LPS) oraz zonuliny określono przy użyciu wskazanych testów. Poziom IL-6, czynnika martwicy nowotworów alfa, LPS oraz zonuliny mierzono w dubletach, a pomiary powtarzano w przypadku, gdy współczynnik zmienności dubletów przekroczył 15%.

Specyfikacje katalogowe podane przez producenta, a nie wyniki walidacji specyficzne dla badania, były następujące: czułość hs-CRP, 5,36 pg/mL; zakres, 18,75–1 200 pg/mL; CV wewnątrz- i międzyseryjnym dla surowicy, 1,4%/4,0%; czułość IL-6, 0,7 pg/mL; zakres, 3,12–300 pg/mL; CV wewnątrzseryjny dla surowicy/osocza, 1,6%–4,2%; CV międzyseryjny, 3,3%–6,4%; czułość czynnika martwicy nowotworu alfa, 6,23 pg/mL; zakres, 15,6–1 000 pg/mL; CV wewnątrzseryjny, 2,2%–3,0%; CV międzyseryjny, 7,3%–8,4%; oraz granica wykrywalności zonuliny, 0,183 ng/mL; granica oznaczalności, 0,183 ng/mL; liniowość, 3,03–40,25 ng/mL; CV powtarzalności, 3,5%–6,0%; oraz CV odtwarzalności, 7,7%–8,3%. Granica wykrywalności i granica oznaczalności zonuliny zostały podane przez producenta przed zastosowaniem współczynnika rozcieńczenia próbki.

Stężenia LPS podano w EU/mL, a stężenia tlenku trimetyloaminy N w osoczu w µmol/L. Oba pomiary potraktowano jako eksploracyjne wyniki biomarkerów.

12. Pobieranie kału i sekwencjonowanie 16S rRNA

Próbki kału pobrano w punkcie wyjściowym oraz w 28. dniu do sterylnych probówek, odnotowując czas defekacji i zamrożenia. W sytuacjach, gdy uczestnik nie mógł oddać stolca w zaplanowanym oknie czasowym, pobierano kolejną spontaniczną próbkę tak szybko, jak było to klinicznie możliwe. Wszyscy zrandomizowani uczestnicy ostatecznie dostarczyli próbki kału odpowiednie do analiz mikrobiomu i krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych; opóźnienia w procedurach pobierania nie spowodowały braku próbek do zaplanowanych analiz kału. Dokumentowano czas opóźnienia w pobraniu oraz stan zaparć; nie podawano środków przeczyszczających wyłącznie w celu pobrania próbek do badań.

Świeże kał transportowano w ciągu 2 h. W przypadku braku możliwości natychmiastowego transportu, próbki przechowywano w temperaturze 4 °C nie dłużej niż przez 6 h przed zamrożeniem w −80 °C. Unikano powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. DNA wyizolowano przy użyciu określonego zestawu do ekstrakcji DNA z kału. Region V3–V4 amplifikowano za pomocą starterów 338F i 806R, a następnie wykonano sekwencjonowanie par końcowych (paired-end) o długości 300-bp. W programie QIIME 2 wersja 2024.10.1 (RRID: SCR_021258) dokonano demultipleksacji odczytów oraz przycięcia starterów. Do filtrowania jakościowego, odszumiania (denoising), łączenia par odczytów, usuwania chimer oraz wnioskowania wariantów sekwencji amplikonów (ASV) wykorzystano DADA2. Przypisanie taksonomiczne wykonano w oparciu o bazę SILVA release 138.1 (RRID: SCR_006423).

Do oceny różnorodności alfa obliczono indeksy Shannona oraz Chao1. W celu analizy różnorodności beta wykorzystano odległości Braya-Curtisa oraz analizę głównych współrzędnych, natomiast do oceny różnic w różnorodności beta zastosowano permutacyjną wielowymiarową analizę wariancji (PERMANOVA)¹⁸.

13. Ilościowe oznaczenie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w kale

Około 100 mg rozmrożonego kału zmieszano z 1,0 mL 0,5% kwasu fosforowego, wymieszano w wstrząsarzu typu vortex przez 60 s, a następnie odwirowano przy 14 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Nadpływ wyekstrahowano octanem etylu zawierającym kwas 4-metylowalerianowy jako standard wewnętrzny.

Alikwot o objętości 1 µL przeanalizowano metodą chromatografii gazowej sprzężonej z detekcją selektywną masowo, wykorzystując kolumnę DB-FFAP o wymiarach 30 m × 0.25 mm × 0.25 µm. Jako gaz nośny zastosowano hel z przepływem 1.0 mL/min przy stosunku podziału 10:1 oraz jonizację elektronową przy 70 eV.

Ilościowo oznaczono octan, propionian, maślan, izomaślan, walerianian oraz izowalerianian, a całkowitą zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych zdefiniowano jako ich sumę. Analitycy pozostawali zaślepieni względem przydziału do grup terapeutycznych, a analizy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych potraktowano jako eksploracyjne.

14. Eksploracyjna odpowiedź biomarkerów

Eksploracyjną odpowiedź złożoną zdefiniowano jako wystąpienie co najmniej dwóch z czterech zmian w 28. dniu: wzrost indeksu Shannona > 0.20, wzrost poziomu maślanu w kale > 20%, spadek poziomu LPS w osoczu > 15% oraz spadek poziomu IL-6 > 20%. Te pragmatyczne progi miały na celu wyeliminowanie niewielkich wahań analitycznych, nie zostały zwalidowane klinicznie i były wykorzystywane wyłącznie do opisu eksploracyjnego. Nie zastosowano progu indeksu Shannona < 1.5.

15. Obliczanie wielkości próby

Obliczenia wielkości próby przyjęły różnicę międzygrupową w zmianie skali NIHSS w 28. dniu na poziomie 1,2 punktu, odchylenie standardowe wynoszące 2,3, dwustronny poziom istotności alfa 0,05 oraz moc testu 80%. Obliczenia te wykazały zapotrzebowanie na 58 uczestników w każdej grupie. Uwzględniając 10% niepełnych punktów końcowych, docelową liczbę rekrutowanych osób ustalono na 64 uczestników na grupę, co łącznie dało 128 zrandomizowanych uczestników¹⁹.

16. Zarządzanie danymi i kontrola jakości

Dane kliniczne zapisywano przy użyciu zestandaryzowanych formularzy raportu przypadku, a następnie poddano je podwójnemu wprowadzaniu danych. Przed zablokowaniem bazy danych przeprowadzono kontrole zakresu i spójności, a rozbieżności rozstrzygano w oparciu o dokumentację źródłową. Osoby oceniające wyniki zostały przeszkolone przed rozpoczęciem rekrutacji. Pobieranie próbek, czas przetwarzania, temperatura przechowywania, cykle zamrażania i rozmrażania, serie testów oraz serie sekwencjonowania śledzono za pomocą zakodowanych identyfikatorów.

17. Analiza statystyczna

Wszystkich 128 zrandomizowanych uczestników włączono do głównej analizy zgodnej z intencją leczenia (intention-to-treat). Populację zgodnie z protokołem (per-protocol) zdefiniowano jako grupę osób, które ukończyły ocenę w 28. dniu, otrzymały co najmniej 80% przypisanej interwencji i nie dopuściły się poważnego naruszenia protokołu. W analizach bezpieczeństwa uwzględniono wszystkich leczonych uczestników. Analizy mikrobiomu oraz krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych przeprowadzono z wykorzystaniem możliwych do oceny próbek kału pobranych w punkcie wyjściowym oraz w 28. dniu. Ponieważ wszyscy zrandomizowani uczestnicy dostarczyli próbki kału nadające się do analizy, nikt nie został wykluczony, a w analizach opartych na próbkach kału nie było konieczne stosowanie imputacji brakujących danych.

Brakujące wartości NIHSS z 28. dnia uzupełniono 30 razy, przyjmując założenie o losowości braków (missing-at-random), z wykorzystaniem bayesowskich modeli grzbietowych z łańcuchowymi równaniami, które uwzględniały leczenie, wyjściowy poziom NIHSS oraz poziom z 14. dnia, wyjściowy wskaźnik Barthela, wiek, płeć, terapię reperfuzyjną oraz czas od wystąpienia objawów do randomizacji. Szacunki połączono zgodnie z regułami Rubina, a analizę przypadków kompletnych przeprowadzono jako analizę wrażliwości.

Przeanalizowano histogramy oraz wykresy Q–Q, a do reszt modelu zastosowano testy Shapiro–Wilka. Reszty z podstawowej analizy ANCOVA przeprowadzonej na pełnych przypadkach były zgodne z rozkładem normalnym (P = 0,308). Silnie prawostronnie skośne biomarkery poddano transformacji przed modelowaniem liniowym, jeśli było to konieczne. W przypadku regresji logistycznej rozkład zmiennej wynikowej binarnej nie musiał być normalny; oceniono liniowość predyktorów ciągłych oraz wpływ obserwacji odstających.

Do analizy wyniku NIHSS w 28. dniu zastosowano analizę kowariancji (ANCOVA), uwzględniając w modelu leczenie, wyjściową wartość NIHSS, wiek, płeć, terapię reperfuzyjną oraz czas od wystąpienia objawów do randomizacji²⁰. W przypadku ciągłych eksploracyjnych punktów końcowych w 28. dniu zastosowano modele liniowe skorygowane o wartości wyjściowe. Do analizy proporcji wykorzystano test chi-kwadrat lub dokładny test Fishera, natomiast do analizy odległości Braya-Curtisa zastosowano test PERMANOVA z 9 999 permutacjami. Analizy różnorodności mikrobiomu i struktury społeczności nie były korygowane o dietę, stopień nasilenia dysfagii, żywienie enteralne, antybiotykoterapię po randomizacji, stosowanie inhibitorów pompy protonowej, zaparcia ani czas hospitalizacji; czynniki te uznano za potencjalne resztkowe zmienne zakłócające.

Zastosowano korektę współczynnika fałszywych odkryć (FDR) metodą Benjamini–Hochberg dla trzech przedstawionych rodzajów, a raportowano zarówno nominalne wartości P, jak i wartości q. Do eksploracyjnej analizy powiązań na poziomie uczestników wykorzystano współczynnik rho Spearmana z 5 000 prób bootstrapowych, natomiast współczynniki korelacji Pearsona nie były używane do interpretacji wnioskowania. Analizę mediacji zaplanowano wyłącznie w przypadku potwierdzenia powiązań zarówno między ekspozycją a mediatorem, jak i między mediatorem a wynikiem. Dla głównych i wcześniej określonych wyników klinicznych przyjęto dwustronny poziom istotności P < 0,05.

Rycina 1: Przepływ uczestników i harmonogram oceny. (A) Schemat przepływu w stylu CONSORT przedstawiający przesiew (n = 176), wykluczenia (n = 48), randomizację (64/grupa), trombolizę dożylną (16 kontrolna; 18 interwencyjna), trombektomię mechaniczną (4; 5), dostępność NIHSS w 28. dniu (59; 58), obserwację w 90. dniu (57; 56) oraz populacje analizowane. (B) Harmonogram interwencji i oceny. NIHSS, skala udaru National Institutes of Health; ITT, analiza intencji leczenia; mRS, zmodyfikowana skala Rankin. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Procedura badania	Przesiew	Wartości wyjściowe	Dni 1–28	Dzień 14	Dzień 28	Dzień 90
Okno kalendarzowe	1 mar–31 gru 2025	Ten sam dzień co randomizacja	Mar 2025–sty 2026	±2 dni	±3 dni	±7 dni
Ocena kwalifikowalności	✓
Pisemna świadoma zgoda	✓
Potwierdzenie udaru niedokrwiennego w TK/MRI	✓
Gromadzenie danych demograficznych i klinicznych		✓
Randomizacja		✓
Standardowa opieka w ostrym udarze niedokrwiennym		✓	✓	✓	✓	✓
Znormalizowana akupunktura manualna			✓
Zmodyfikowany wywar Xiaoxuming			✓
Ocena NIHSS		✓		✓	✓	✓
Ocena w indeksie Barthela		✓			✓	✓
Ocena w zmodyfikowanej skali Rankin						✓
Pobieranie próbek krwi obwodowej		✓		✓	✓
Pobieranie próbek kału		✓			✓
Monitorowanie zdarzeń niepożądanych		✓	✓	✓	✓	✓
Zakończenie końcowej obserwacji klinicznej						Do 31 mar 2026
Czyszczenie danych i analiza statystyczna						1 kwi–30 kwi 2026

Tabela 1: Harmonogram badania, ekspozycja na interwencję, pobieranie próbek i ocena wyników. CT, tomografia komputerowa; MRI, obrazowanie rezonansem magnetycznym; NIHSS, skala udaru National Institutes of Health.

Punkt akupunktu	Kategoria lokalizacji	Lateralizacja	Głębokość wprowadzenia igły	Metoda stymulacji	Czas retencji	Częstotliwość leczenia	Środki ostrożności
Baihui (GV20)	Punkt skalpu	Pojedynczy	10–15 mm	Wprowadzenie ukośne z lekką stymulacją manualną	30 min	5 sesji w tygodniu przez 4 tygodnie	Należy unikać nadmiernej stymulacji u pacjentów z niestabilnymi parametrami życiowymi
Shuigou (GV26)	Punkt twarzy	Pojedynczy	5–10 mm	Wprowadzenie skośne z lekką stymulacją manualną	30 min	5 sesji w tygodniu przez 4 tygodnie	Należy unikać nakłuwania u pacjentów z miejscowym urazem skóry, infekcją lub słabą współpracą
Fengchi (GB20)	Punkt głowy i szyi	Obustronny	15–25 mm	Wprowadzenie skośne; unikano głębokiego igłowania przyśrodkowego	30 min	5 sesji w tygodniu przez 4 tygodnie	Należy unikać głębokiej insercji w kierunku kanału kręgowego lub obszaru tętnicy kręgowej.
Quchi (LI11)	Punkt kończyny górnej	Obustronny	15–25 mm	Ręczne podnoszenie-pchanie i obracanie	30 min	5 sesji/tydzień przez 4 tygodnie	Należy unikać nakłuwania przez skórę z siniakami, obrzękniętą lub zainfekowaną
Hegu (LI4)	Punkt kończyny górnej	Obustronny	10–20 mm	Ręczne podnoszenie-pchanie i obracanie	30 min	5 sesji/tydzień przez 4 tygodnie	Należy unikać nadmiernej manipulacji u pacjentów w stanie kruchym lub u pacjentów z nietolerancją bólu
Zusanli (ST36)	Punkt kończyny dolnej	Obustronny	20–25 mm	Ręczne unoszenie-pchanie i obracanie	30 min	5 sesji w tygodniu przez 4 tygodnie	Należy unikać nakłuwania obszarów z obrzękiem, infekcją lub lokalnym urazem.
Yanglingquan (GB34)	Punkt kończyny dolnej	Obustronny	20–25 mm	Ręczne podnoszenie-pchanie i obracanie	30 min	5 sesji w tygodniu przez 4 tygodnie	Należy unikać nakłuwania u pacjentów z silnym bólem kończyn, urazami lub pobudzeniem
Sanyinjiao (SP6)	Punkt kończyny dolnej	Obustronny	15–25 mm	Ręczne podnoszenie-popychanie i obracanie	30 min	5 sesji w tygodniu przez 4 tygodnie	Nie stosować w czasie ciąży oraz u pacjentów z miejscowymi zmianami skórnymi

Tabela 2: Zstandaryzowany schemat akupunktury i protokół operacyjny. Uwagi operacyjne: Wykorzystano sterylne jednorazowe igły ze stali nierdzewnej o wymiarach 0,25 mm × 40 mm. Stymulację manualną stosowano do momentu zgłoszenia odczucia deqi lub zaobserwowania miejscowej reakcji na nakłucie. Igły pozostawiano przez 30 min, a stymulację manualną powtarzano co 10 min podczas ich retencji.

Składnik	Łacińska nazwa farmaceutyczna	Dawka dobowa	Rola funkcjonalna w recepturze	Uwagi dotyczące kontroli jakości i bezpieczeństwa
Ephedra	Ephedrae Herba	6 g	Składnik rozpraszający wiatr i otwierający kanały	W trakcie leczenia monitorowano ciśnienie tętnicze, kołatania serca, dyskomfort w klatce piersiowej oraz bezsenność
Gałązka cynamonu	Cinnamomi Ramulus	9 g	Składnik rozgrzewający i wspomagający krążenie	Stosowany ostrożnie u pacjentów z nadmierną potliwością lub objawami związanymi z gorącem
Korzeń białej piwonii	Paeoniae Radix Alba	12 g	Składnik harmonizujący i rozkurczowy	Wymagana była certyfikacja apteczna i dokumentacja serii
Korzeń Saposhnikovia	Saposhnikoviae Radix	9 g	Składnik rozpraszający wiatr	Wymagana była certyfikacja apteczna i dokumentacja serii
Świeży imbir	Zingiberis Rhizoma Recens	6 g	Składnik harmonizujący pracę przewodu pokarmowego	Podawanie zaprzestano w przypadku wystąpienia uporczywych wymiotów
Korzeń lukrecji	Glycyrrhizae Radix et Rhizoma	6 g	Składnik harmonizujący recepturę	U pacjentów z grupy wysokiego ryzyka monitorowano zaburzenia elektrolitowe i obrzęki
Korzeń Angelica	Angelicae Sinensis Radix	10 g	Składnik odżywczy dla krwi i wspomagający krążenie	Odnotowano jednoczesne stosowanie leków przeciwpłytkowych lub przeciwzakrzepowych
Kłącze Chuanxiong	Chuanxiong Rhizoma	10 g	Składnik aktywujący krew	Monitorowano i odnotowywano zdarzenia niepożądane związane z krwawieniem
Korzeń Astragalus	Astragali Radix	20 g	Składnik wspomagający Qi	Dawka mogła zostać zwiększona do 30 g w przypadku wyraźnej potliwości spontanicznej, jeśli odnotowano to jako modyfikację zdefiniowaną w protokole
Poria	Poria	15 g	Składnik wspomagający śledzionę i usuwający wilgoć	Dawka mogła zostać zwiększona do 20 g w przypadku luźnych stolców, jeśli odnotowano to jako modyfikację zdefiniowaną w protokole
Korzeń czerwonej piwonii	Paeoniae Radix Rubra	12 g	Składnik aktywujący krew i przeciwzapalny	Wymagana była certyfikacja apteczna i dokumentacja serii
Nasiona konopi	Cannabis Fructus	10 g, w razie potrzeby	Wyłącznie korekta zaparć	Dodawano tylko w przypadku zaparć i odnotowywano jako modyfikację zdefiniowaną w protokole

Tabela 3: Skład i protokół podawania zmodyfikowanego wywaru Xiaoxuming. Protokół podawania: Jedna dawka dobowa była przygotowywana przez aptekę szpitalną i zagęszczana do 400 mL. Wywar dzielono na dwie dawki po 200 mL i podawano doustnie po śniadaniu oraz kolacji przez 28 kolejnych dni. Podawanie leku wstrzymywano u pacjentów z zaburzeniami połykania, uporczywymi wymiotami, podejrzeniem reakcji alergicznej, poziomem aminotransferazy alaninowej lub aminotransferazy asparaganianowej przekraczającym trzykrotnie górną granicę normy, szacowanym współczynnikiem filtracji kłębuszkowej poniżej 45 mL/min/1,73 m², niekontrolowanym ciśnieniem tętniczym po zastosowaniu standardowego leczenia, klinicznie istotną tachyarytmią, nowym bólem w klatce piersiowej lub w przypadku jakichkolwiek obaw dotyczących bezpieczeństwa określonych przez badacza.

Kategoria wyników	Zmienna	Punkt czasowy oceny	Definicja lub pomiar	Klasyfikacja analiz
Deficyt neurologiczny	wynik w skali NIHSS	Wartość wyjściowa, dzień 14, dzień 28, dzień 90	Skala udaru National Institutes of Health oceniana przez neurologów w ślepej próbie	Główny punkt końcowy badania w 28. dniu; drugorzędne punkty końcowe w 14. i 90. dniu
Funkcjonowanie w codziennym życiu	Indeks Barthela	Wartość bazowa, dzień 28, dzień 90	Wynik oceny czynności życia codziennego oceniony przez przeszkolonych, zaślepionych oceniających	Wtórny punkt końcowy badania klinicznego
Niepełnosprawność na świecie	Zmodyfikowana skala Rankina	Dzień 90	Skala niepełnosprawności funkcjonalnej 0–6	Wtórny punkt końcowy badania klinicznego; zaobserwowany rozkład oraz oddzielnie oznakowana dychotomia ITT
Korzystny wynik funkcjonalny	mRS 0–2	Dzień 90	Uczestnicy z wynikiem mRS 0, 1 lub 2	Wtórny punkt końcowy badania klinicznego
Nawrót udaru	Nawracający udar niedokrwienny	Do 90. dnia	Diagnoza neurologiczna z wykorzystaniem obrazowania, jeśli jest ono dostępne	Wynik związany z bezpieczeństwem
Śmiertelność	Zgon z jakiejkolwiek przyczyny	Do 90. dnia	Zgon z jakiejkolwiek przyczyny	Wynik bezpieczeństwa
Stan zapalny układowy	hs-CRP, IL-6, TNF-alfa	Wartość wyjściowa, dzień 14, dzień 28	Stężenia w surowicy/osoczu	Eksploracyjny punkt końcowy biomarkerów
Markery endotoksyn/bariery	LPS, zonulina	Wartość wyjściowa, dzień 14, dzień 28	Stężenia we krwi	Eksploracyjny punkt końcowy biomarkera
Metabolit mikrobiologiczny	TMAO	Wartość wyjściowa, dzień 28	Stężenie w osoczu	Eksploracyjny punkt końcowy biomarkera
Różnorodność mikrobioty jelitowej	Shannon, Chao1, Bray–Curtis	Wartość wyjściowa, dzień 28	różnorodność oparta na 16S rRNA	Eksploracyjny punkt końcowy biomarkerów
Skład mikrobiologiczny	Wybrane rodzaje	Dzień 28	Względna obfitość na poziomie rodzaju	Badanie eksploracyjne; nominalna wartość p oraz wartość q BH-FDR w trzech dostarczonych rodzajach
Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe	Octan, propionian, maślan, całkowite SCFA	Dzień 28	Stężenia w kale metodą GC-MS	Eksploracyjny punkt końcowy biomarkerów
Odpowiedź eksploracyjna	Odpowiedź złożona	Dzień 28	Przynajmniej dwa: Shannon >0,20; maślan >20%; spadek LPS >15%; spadek poziomu IL-6 >20%	Badanie eksploracyjne; wartości progowe nie zostały zwalidowane klinicznie
Bezpieczeństwo interwencji	Zdarzenia niepożądane i poważne zdarzenia niepożądane	Dzień 1–90	Zdarzenia rejestrowane przez badacza i ich przypisanie	Wynik w zakresie bezpieczeństwa

Tabela 4: Wyniki kliniczne i biologiczne, okna czasowe, definicje i klasyfikacja analiz.W tabeli podsumowano wcześniej określone wyniki kliniczne i biologiczne, punkty czasowe ich oceny, definicje operacyjne oraz klasyfikacje analiz. FDR, współczynnik fałszywych odkryć (false discovery rate); hs-CRP, białko C reaktywne wysokiej czułości; IL-6, interleukina-6; LPS, lipopolisacharyd; mRS, zmodyfikowana skala Rankina; NIHSS, skala udaru National Institutes of Health; SCFA, krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe; TMAO, N-tlenek trimetyloaminy.

Wyniki

Przepływ uczestników i populacje analizowane

Spośród 176 przebadanych pacjentów, 48 wykluczono przed randomizacją, a 128 zrandomizowano (64/grupa; Rycina 1). Wszyscy zrandomizowani uczestnicy zostali włączeni do populacji intencji leczenia (intention-to-treat) oraz populacji bezpieczeństwa. Wynik NIHSS w 28. dniu obserwowano u 59 uczestników z grupy kontrolnej i 58 uczestników z grupy interwencyjnej; wizytę kontrolną w 90. dniu ukończyło odpowiednio 57 i 56 uczestników. Populacje per-protocol obejmowały 58 i 57 uczestników (Rycina 2).

Charakterystyka wyjściowa

Charakterystyka wyjściowa była podobna w obu grupach (Tabela 5). Średni wiek wynosił 65,1 ± 8,7 versus 64,7 ± 9,1 lat, wyjściowa skala NIHSS wynosiła 8,6 ± 2,6 versus 8,4 ± 2,9, a wyjściowy indeks Barthel wynosił 43,5 ± 13,2 versus 44,8 ± 12,7. Trombolizę dożylną zastosowano u 16/64 (25,0%) uczestników grupy kontrolnej oraz 18/64 (28,1%) uczestników grupy interwencyjnej; trombektomię mechaniczną wykonano odpowiednio u 4/64 (6,3%) i 5/64 (7,8%) osób.

Przestrzeganie interwencji

W grupie interwencyjnej mediana liczby sesji akupunktury wyniosła 18 (rozstęp międzykwartylny, 17–20); 57 uczestników ukończyło ≥ 16 sesji, a 58 spożyło ≥ 80% odwaru. Stosowanie probiotyków/prebiotyków niezgodnie z protokołem wystąpiło u dwóch uczestników z grupy kontrolnej i jednego uczestnika z grupy interwencyjnej; osoby te zostały uwzględnione w analizie intention-to-treat, ale wykluczone z analizy per-protocol (Tabela uzupełniająca 1).

Wyniki kliniczne

Zaobserwowany wynik NIHSS spadł z 8,6 ± 2,6 do 5,5 ± 3,1 w grupie kontrolnej (n = 59 w 28. dniu) oraz z 8,4 ± 2,9 do 4,1 ± 2,9 w grupie interwencyjnej (n = 58; Rysunek 3A). Zaobserwowane średnie zmiany wyniosły odpowiednio −3,34 ± 4,14 i −3,97 ± 4,03 punktu (Rysunek 3B). W zaplanowanej analizie ANCOVA z 30 imputacjami, skorygowany wynik NIHSS w 28. dniu był o 1,30 punktu niższy w grupie interwencyjnej (95% przedział ufności [CI], od −2,36 do −0,24; P = 0,017).

Wynik w skali NIHSS w 14. dniu wynosił 5,49 ± 2.45 kontra 4.61 ± 2,23 (P skorygowane o wartość wyjściową = 0,041), a obserwowana wartość NIHSS w 90. dniu wynosiła 3,68 ± 2,68 (n = 57) kontra 2.88 ± 2,36 (n = 56; P = 0,091; Rycina 3A).

Wskaźnik Barthela w 28. dniu wynosił 61,39 ± 18.80 kontra 68.82 ± 19,36 (P skorygowane o wartość wyjściową = 0,040); zaobserwowane wartości w 90. dniu wyniosły 75,56 ± 19.22 kontra 81.49 ± 17,67 (P = 0,098; Rycina 3C). Wśród uczestników uwzględnionych w analizie mRS w 90. dniu dla przypadków zaobserwowanych, korzystny wynik wystąpił u 32/57 osób w grupie kontrolnej (56,1%) i u 38/56 uczestników w grupie interwencyjnej (67,9%; P = 0,200). Pełny rozkład kategorii mRS dla przypadków zaobserwowanych przedstawiono w Rycina 3D i Tabela uzupełniająca 1Szacunki ITT dla dychotomizowanego wyniku mRS z zastosowaniem wielokrotnej imputacji (36/64) kontra 44/64; P = 0,144) są raportowane oddzielnie.

Biomarkery związane z osią mózgowo-jelitową

Próbki kału były dostępne i zostały z powodzeniem przeanalizowane dla wszystkich zrandomizowanych uczestników (64 w każdej grupie) w planowanym punkcie czasowym analizy. Wskaźnik różnorodności Shannona w 28. dniu wynosił 3,08. ± 0.52 kontra 3.31 ± 0,57 (P skorygowane o wartość wyjściową = 0,019; Rycina 4A), a stężenie maślanu w kale wyniosło 10,21 ± 4.27 kontra 12.91 ± 5.08 µmol/g (P = 0,002; Rysunek 4B).

Poziom IL-6 wynosił 18,23 ± 9,44 w stosunku do 15,62 ± 8,06 pg/mL w 14. dniu (nominalne P = 0,095) oraz 14,61 ± 8,18 w stosunku do 11,84 ± 6,83 pg/mL w 28. dniu (P skorygowane o wartość bazową = 0,041; Rycina 4C). Poziom LPS wynosił 0,85 ± 0,32 w stosunku do 0,78 ± 0,30 EU/mL w 14. dniu (P = 0,204) oraz 0,78 ± 0,31 w stosunku do 0,66 ± 0,28 EU/mL w 28. dniu (P skorygowane o wartość bazową = 0,023; Rycina 4D).

W 28. dniu Faecalibacterium i Roseburia były bardziej liczne w grupie interwencyjnej (nominalne P = 0,006 i 0,009; oba q = 0,013), natomiast Bifidobacterium nie osiągnęło nominalnej istotności (P = q = 0,056; Rycina 4E). W odniesieniu do trzech przedstawionych rodzajów zastosowano korektę Benjamini–Hochberga.

Eksploracyjna złożona odpowiedź wystąpiła u 21/64 osób w grupie kontrolnej (32,8%) oraz u 34/64 uczestników w grupie interwencyjnej (53,1%; P = 0.020). Wyniki poszczególnych komponentów przedstawiono na Rysunku 4F oraz w Tabeli uzupełniającej 2; progi te mają charakter eksploracyjny i nie zostały zwalidowane klinicznie.

Eksploracyjne powiązania na poziomie uczestników

Eksploracyjne powiązania na poziomie uczestników oceniono za pomocą współczynnika rho Spearmana z zastosowaniem 5 000 prób bootstrapowych. Zmiany w stężeniu maślanu w kale, IL-6, LPS oraz w indeksie różnorodności Shannon nie były istotnie powiązane z odpowiadającymi im zmianami neurologicznymi lub zmianami w biomarkerach (Rysunek 5).

Zmiany poziomu maślanu w kale oraz wyniku NIHSS nie były istotnie skorelowane (rho Spearmana = −0.05; 95% przedział ufności [CI] bootstrapowy, od −0.23 do 0.13; P = 0.601; n = 117). Zmiana poziomu IL-6 nie była powiązana ze zmianą wyniku NIHSS (rho = −0.01; 95% bootstrap CI, od −0.18 do 0.15; P = 0.887; n = 117), a zmiana poziomu LPS nie była powiązana ze zmianą poziomu IL-6 (rho = −0.14; 95% bootstrap CI, od −0.29 do 0.03; P = 0.125; n = 128).

Zmiana różnorodności Shannona nie była istotnie powiązana ze zmianą w skali NIHSS (rho = −0,15; 95% CI, −0,34 do 0,06; P = 0,119; n = 117). Ponieważ wstępnie określone powiązania na poziomie uczestników między ekspozycją a mediatorem oraz między mediatorem a wynikiem nie zostały potwierdzone, nie przeprowadzono analizy mediacji i nie wywnioskowano istnienia efektu pośredniego ani przyczynowej ścieżki mózg–jelita.

Wyniki bezpieczeństwa

Jakiekolwiek zdarzenie niepożądane wystąpiło u 8/64 osób w grupie kontrolnej i 11/64 uczestników w grupie interwencyjnej (12,5% w stosunku do 17,2%; P = 0,456). Siniaki w miejscu wkłucia igły wystąpiły u 0 w stosunku do 5 uczestników (P = 0,023) i ustąpiły bez leczenia; łagodne dolegliwości żołądkowo-jelitowe wystąpiły u 3 w stosunku do 6 uczestników (P = 0,300; Tabela 6).

Poważne zdarzenia niepożądane wystąpiły u 3 osób w grupie kontrolnej i 2 uczestników w grupie interwencyjnej (P = 0.648). W każdej z grup odnotowano jeden zgon; żadnego poważnego zdarzenia niepożądanego nie uznano za jednoznacznie powiązane z akupunkturą lub zmodyfikowanym wywarem Xiaoxuming.

Podsumowując, połączona interwencja wiązała się z niewielką poprawą w skali NIHSS w 28. dniu oraz w wybranych biomarkerach w 28. dniu. Różnice kliniczne w 90. dniu nie były istotne statystycznie, a dane na poziomie uczestników nie potwierdziły mediacji poprzez zmierzone biomarkery.

Rycina 2: Schemat pobierania próbek klinicznych i biologicznych. Próbki krwi i kału pobrano w celu pomiaru mikrobiomu, krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA), markerów zapalnych oraz parametrów związanych z barierą jelitową. Przedstawiony schemat określa korelacje o charakterze eksploracyjnym i nie stwierdza przyczynowego mechanizmu osi mózg-jelita. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 3: Wyniki kliniczne. (A) Trajektoria NIHSS; punkty reprezentują średnią ± SD, z podaniem n dla każdego punktu czasowego. (B) Obserwowana zmiana NIHSS od poziomu wyjściowego do 28. dnia, przedstawiona jako średnia ± SD (grupa kontrolna n = 59; grupa interwencyjna n = 58); adnotacja zawiera wyniki analizy ANCOVA z 30 imputacjami, skorygowanej o wyjściowy NIHSS, wiek, płeć, reperfuzję oraz czas od wystąpienia objawów do randomizacji. (C) Indeks Barthel, przedstawiony jako średnia ± SD, z podaniem n. (D) Kategorie mRS w 90. dniu dla przypadków obserwowanych (grupa kontrolna n = 57; grupa interwencyjna n = 56); wartości procentowe obliczono na podstawie liczby obserwowanych przypadków. Wartości p są dwustronne. Nie użyto symboli istotności. CI, przedział ufności; MI, imputacja wielokrotna; SD, odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Eksploracyjne biomarkery. Słupki i punkty przedstawiają średnią ± SD. Wszyscy zrandomizowani uczestnicy dostarczyli próbki nadające się do oceny w odpowiednich analizach; w związku z tym dla każdego panelu dostępna była grupa n = 64/group. Próbki kału zostały pomyślnie pobrane i przetworzone od wszystkich uczestników, w tym od tych, u których pobranie zostało opóźnione w ramach wcześniej określonego okna czasowego. (A) Indeks Shannona i (B) maślan w kale: liniowe modele skorygowane o wartości bazowe w dniu 28. (C) Trajektorie IL-6 i (D) LPS: testy Welcha w dniu 14 oraz modele skorygowane o wartości bazowe w dniu 28. (E) Wybrane rodzaje w dniu 28: testy Welcha z korekcją Benjamini–Hochberg dla trzech przedstawionych rodzajów; pokazano zarówno nominalne wartości P, jak i q. (F) Komponenty odpowiedzi: testy chi-kwadrat Pearsona. Wszystkie wartości P są dwustronne; nie zastosowano symboli istotności. IL-6, interleukina-6; LPS, lipopolisacharyd; SCFA, krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe; SD, odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Eksploracyjne analizy korelacji na poziomie uczestników. (A) Zmiana poziomu maślanu a zmiana w skali NIHSS (n = 117). (B) Zmiana poziomu IL-6 versus zmiana w skali NIHSS (n = 117). (C) Zmiana poziomu LPS a zmiana poziomu IL-6 (n = 128). Linie zostały przedstawione wyłącznie w celu wizualizacji i nie reprezentują wnioskowania opartego na regresji. Wnioskowanie statystyczne oparto na rho Spearmana z 5 000 prób bootstrapowych. (D) Estymatory Spearmana z 95% przedziałami ufności CI dla 5 000 prób bootstrapowych, w tym zmiana wskaźnika Shannon a zmiana w skali NIHSS (n = 117). Żadna korelacja nie spełniła warunku P < 0,05; w związku z czym nie przeprowadzono analizy mediacji. Nie zastosowano symboli istotności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Zmienna	Grupa kontrolna (n = 64)	Grupa interwencyjna (n = 64)	Wartość P
Wiek, lata	65.1 ± 8.7	64.6 ± 9.0	0.775
Płeć męska, n (%)	40 (62.5)	39 (60.9)	0.855
Czas od wystąpienia objawów do randomizacji, h	41.7 ± 14.9	40.9 ± 15.7	0.773
Wartość wyjściowa skali NIHSS	8.6 ± 2.6	8.4 ± 2.9	0.665
Wartość wyjściowa indeksu Barthel	43.5 ± 13.2	44.8 ± 12.7	0.573
Nadciśnienie tętnicze, n (%)	42 (65.6)	41 (64.1)	0.855
Cukrzyca, n (%)	18 (28.1)	17 (26.6)	0.839
Tromboliza dożylna, n (%)	16 (25.0)	18 (28.1)	0.690
Mechaniczna trombektomia, n (%)	4 (6.3)	5 (7.8)	0.732
hs-CRP, mg/L	7.21 ± 4.18	7.04 ± 4.03	0.813
IL-6, pg/mL	24.03 ± 10.14	23.62 ± 9.96	0.817
TNF-alpha, pg/mL	30.5 ± 11.2	30.0 ± 11.0	0.799
Indeks Shannona	2.84 ± 0.55	2.86 ± 0.56	0.833
Maślan w kale, µmol/g	8.41 ± 3.99	8.53 ± 4.04	0.859
LPS, EU/mL	0.94 ± 0.34	0.93 ± 0.35	0.870
Zonulina, ng/mL	54.50 ± 15.60	54.11 ± 15.08	0.885

Tabela 5: Wyjściowa charakterystyka demograficzna, kliniczna i biomarkerowa.Tabela ta podsumowuje wyjściową charakterystykę demograficzną, kliniczną, związaną z leczeniem oraz charakterystykę biomarkerów w grupie kontrolnej i interwencyjnej. Wartości przedstawiono jako średnia ± SD lub n (%). Tromboliza dożylna i mechaniczna trombektomia są raportowane jako oddzielne kategorie standardowej opieki.

Wynik bezpieczeństwa	Grupa kontrolna (n=64)	Grupa interwencyjna (n=64)	Wartość P
Jakiekolwiek zdarzenie niepożądane, n (%)	8 (12.5)	11 (17.2)	0.456
Siniaki w miejscu wkłucia, n (%)	0	5 (7.8)	0.023
Lekki dyskomfort żołądkowo-jelitowy, n (%)	3 (4.7)	6 (9.4)	0.3
Przejściowe zawroty głowy, n (%)	2 (3.1)	3 (4.7)	0.648
Lekka wysypka, n (%)	1 (1.6)	2 (3.1)	0.56
Nieprawidłowa funkcja wątroby, n (%)	1 (1.6)	2 (3.1)	0.56
Nieprawidłowa funkcja nerek, n (%)	1 (1.6)	1 (1.6)	1
Wahania ciśnienia tętniczego, n (%)	2 (3.1)	3 (4.7)	0.648
Kołatania serca, n (%)	0	1 (1.6)	0.315
Poważne zdarzenie niepożądane, n (%)	3 (4.7)	2 (3.1)	0.648
Poważne zdarzenie niepożądane związane z interwencją, n (%)	0	0	--
Zgon z jakiejkolwiek przyczyny, n (%)	1 (1.6)	1 (1.6)	1

Tabela 6: Zdarzenia niepożądane i poważne zdarzenia niepożądane. Tabela ta podsumowuje zdarzenia niepożądane, poważne zdarzenia niepożądane, poważne zdarzenia niepożądane związane z interwencją oraz zgony z dowolnej przyczyny w grupie kontrolnej i grupie interwencyjnej. Wartości przedstawiono jako n (%).

DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:

Zanonimizowane dane na poziomie uczestników, stanowiące podstawę opisanych analiz klinicznych, biomarkerów, mikrobiomu, przestrzegania zaleceń oraz bezpieczeństwa, są publicznie dostępne w serwisie Zenodo (https://zenodo.org/records/22725409).

Tabela uzupełniająca 1: Obserwacje kontrolne, przestrzeganie zaleceń i wyniki kliniczne. Populacje analizy obserwacyjnej i imputowanej są oznaczone oddzielnie. Główna ocena wykorzystuje 30-krotne wielokrotne imputowanie danych oraz analizę ANCOVA skorygowaną o wyjściowy wynik NIHSS, wiek, płeć, reperfuzję oraz czas od początku objawów do randomizacji. CI, przedział ufności; IQR, rozstęp międzykwartylowy; mRS, zmodyfikowana skala Rankina; NIHSS, skala udaru National Institutes of Health.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Eksploracyjne wyniki biomarkerów. Wartości przedstawiono jako średnia ± SD lub n (%). Rozróżniono nominalne wartości P oraz wartości q skorygowane pod kątem FDR. Odpowiedź złożona wymagała co najmniej dwóch z czterech z góry określonych zmian i nie została zwalidowana klinicznie. Analizy korelacji mają charakter eksploracyjny; nie przeprowadzono analizy mediacji, ponieważ wymagane powiązania na poziomie uczestników nie były istotne.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Surowe dane odpowiadające rysunkom i tabelom.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Zastosowanie protokołu łączonego doprowadziło do umiarkowanej poprawy w zakresie wczesnego deficytu neurologicznego, przy czym analiza ANCOVA z wielokrotną imputacją wykazała różnicę wynoszącą −1.30 punktu w skali NIHSS w 28. dniu. Odnotowano również różnice w Indeksie Barthela oraz w wybranych biomarkerach w 28. dniu, natomiast wyniki w 90. dniu nie osiągnęły istotności statystycznej. Wyniki te wspierają ocenę interwencji łączonej jako terapii wspomagającej, a nie zamiennika dla reperfuzji, leczenia przeciwzakrzepowego, rehabilitacji lub innej standardowej opieki.

Efekt kliniczny zaobserwowany w tym badaniu jest zgodny z rosnącym przekonaniem, że akupunktura może przyczyniać się do rekonwalescencji po udarze w stopniu wykraczającym poza modulację objawową. Wcześniejsze prace sugerowały, że akupunktura może poprawić funkcje neurologiczne i zmniejszyć aktywność zapalną w ostrym udarze niedokrwiennym, choć skala i trwałość korzyści pozostają zmienne w zależności od badania²¹. Niniejsze wyniki rozszerzają ten nurt dowodów poprzez analizę akupunktury jako części interwencji łączonej ze zstandaryzowaną formułą ziołową oraz poprzez powiązanie efektu klinicznego z predefiniowanymi biomarkerami związanymi z osią mózgowo-jelitową. Wielkość efektu była umiarkowana, a nie spektakularna, co jest istotne dla interpretacji. Skorygowana różnica wynosząca 1 punkt w skali NIHSS może być znacząca w udarze lekkim do umiarkowanego, gdy towarzyszą jej sygnały funkcjonalne i biologiczne, jednak nie należy jej interpretować jako dowodu na to, że sama interwencja determinuje powrót do zdrowia. Krokami najbardziej wrażliwymi pod kątem powtarzalności są: spójny czas ustalania kwalifikowalności, zakamuflowana alokacja, bezpieczne nakłuwanie, zstandaryzowana ekspozycja na wywar, zaślepiona ocena wyników oraz szybkie, kontrolowane temperaturowo przetwarzanie próbek. Do typowych problemów operacyjnych należą: pominięte sesje akupunktury, niebezpieczne połykanie, opóźnione wydalanie stolca oraz rozmrażanie podczas transportu. Problemy te rozwiązano poprzez dokumentowanie przełożeń, wstrzymywanie leczenia doustnego w przypadku braku bezpieczeństwa, pobieranie kolejnego spontanicznego stolca bez stosowania środków przeczyszczających przeznaczonych wyłącznie na potrzeby badań, rejestrowanie zaparć i opóźnień w pobieraniu oraz śledzenie historii przetwarzania i cykli zamrażania i rozmrażania.

Różnice w indeksie różnorodności Shannona, poziomie maślanu, IL-6 oraz LPS w 28. dniu stanowiły eksploracyjne powiązania na poziomie grup. Eksploracyjne analizy na poziomie uczestników dotyczące korelacji między maślanem a NIHSS, IL-6 a NIHSS, LPS a IL-6 oraz indeksem Shannona a NIHSS nie potwierdziły zależności niezbędnych do przeprowadzenia analizy mediacji; w związku z tym analiza mediacji nie została wykonana, a uzyskane dane nie dowodzą istnienia przyczynowego szlaku oś mózg-jelita. Alternatywne podejścia, w tym metagenomika shotgun, celowana metabolomika ze standardami znakowanymi izotopowo, seryjne dzienniczki żywieniowe oraz powtarzalne pobieranie biomarkerów, pozwoliłyby na bardziej bezpośrednią charakterystykę funkcji i chronologii zdarzeń niż sekwencjonowanie 16S rRNA i dwa punkty czasowe pobierania kału^22,23,24.

Interpretacja jest ograniczona ze względu na próbkę z jednego ośrodka, brak zaślepienia uczestników, brak prospektywnej rejestracji badania przed rekrutacją oraz łączny projekt interwencji bez grup otrzymujących wyłącznie akupunkturę lub wyłącznie wywar. W związku z tym projekt ten nie pozwala na przypisanie efektów jednemu komponentowi lub synergii. Rutynowa dieta, stopień nasilenia dysfagii, żywienie enteralne, antybiotykoterapia po randomizacji, stosowanie inhibitorów pompy protonowej, zaparcia, intensywność rehabilitacji oraz czas pobytu w szpitalu mogą wpływać na wyniki analiz mikrobiomu. Czynniki te nie zostały uwzględnione w skorygowanych modelach mikrobiomu, w związku z czym pozostają potencjalnymi rezydualnymi czynnikami zakłócającymi. Korekcja FDR dla wybranych rodzajów była ograniczona do trzech przedstawionych rodzajów, a eksploracyjne progi odpowiedzi nie zostały zwalidowane zewnętrznie. Analizy biomarkerów miały charakter eksploracyjny; niektóre stężenia IL-6 i TNF-alpha spadły poniżej nominalnych zakresów testów producentów i powinny być interpretowane z ostrożnością.

Przyszłe prace powinny wykorzystywać prospektywną rejestrację, wieloośrodkową rekrutację, plan factorialny, zweryfikowane z danych źródłowych informacje o współinterwencjach, zestandaryzowane metody rejestracji diety/ekspozycji oraz niezależnie reprodukowalne potoki analiz mikrobiomu i metabolomiki. Przed przetestowaniem mediacji, efektów poszczególnych komponentów leczenia lub doboru terapii w oparciu o mikrobiom niezbędne są większe próby oraz częstsze pobieranie próbek. Monitorowanie bezpieczeństwa nie wykazało żadnego poważnego zdarzenia niepożądanego jednoznacznie związanego z interwencją, jednak próba była zbyt mała, aby wykluczyć rzadkie powikłania. Szczególną uwagę należy zwrócić na ryzyko krwawień, bezpieczeństwo połykania, nietolerancję żołądkowo-jelitową, funkcje wątroby/nerek, ciśnienie tętnicze oraz arytmię podczas integrowania akupunktury i terapii ziołowej z leczeniem ostrego udaru mózgu.

Podsumowując, standaryzowana akupunktura wraz ze zmodyfikowanym wywarem Xiaoxuming wiązała się z umiarkowaną poprawą neurologiczną w 28. dniu oraz różnicami w wybranych biomarkerach w przypadku zastosowania jako uzupełnienie opieki standardowej. Wyniki biologiczne mają charakter generujący hipotezy i nie wykazują przyczynowego mechanizmu oś mózgowo-jelitowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 4-metylowalerianowy	Sigma-Aldrich, USA	142342	wewnętrzny standard GC-MS
startery do genu 16S rRNA (V3–region V4)	Sangon Biotech, Chiny	Synteza na zamówienie	para starterów 341F/806R
Igły do akupunktury	Hwato (Suzhou Medical Appliance Factory), Chiny	0.25 × 40 mm	Sterylne jednorazowe igły ze stali nierdzewnej
Ocena według indeksu Barthel	Nie dotyczy	Nie dotyczy	Ocena czynności życia codziennego
Probówki kriogeniczne	Corning, USA	430659	Przechowywanie próbek kału
Octan etylu (stopnia chromatograficznego)	Merck, Niemcy	109623	Organiczny rozpuszczalnik ekstrakcyjny
Końcówki do pipet z filtrem	Axygen, USA	Różne	wolny od RNaz/DNaz
Chromatograf gazowy	Agilent Technologies, USA	GC 7890B	System rozdziału GC
Zestaw ELISA do oznaczania ludzkiej IL-6	R&D Systems, USA	D6050	Oznaczanie ilościowe IL-6 w surowicy
Zestaw ELISA do oznaczania ludzkiego lipopolisacharydu (LPS)	Cusabio, Chiny	CSB-E13066h	Oznaczanie ilości LPS w surowicy
Zestaw do oznaczania TMAO u ludzi	Sigma-Aldrich, USA	MAK264	Kolorymetryczne/fluorometryczne oznaczanie ilościowe TMAO
Detektor selektywny masowo	Agilent Technologies, USA	5977B MSD	Kwadrupolowy spektrometr mas
Oprogramowanie MassHunter Workstation	Agilent Technologies, USA	G1701EA	Nabywanie i analiza danych GC-MS
Mikropipety	Eppendorf, Niemcy	Seria Research plus	Laboratoryjne pipetowanie i dozowanie cieczy
Zestaw odczynników MiSeq Reagent Kit v3 (600 cykli)	Illumina, USA	MS-102-3003	Sekwencjonowanie par końców 2 × sekwencjonowanie 300 bp
System MiSeq	Illumina, USA	SY-410-1003	Platforma do sekwencjonowania par końcowych; 2 × chemia sekwencjonowania 300 bp
Ocena w zmodyfikowanej skali Rankin (mRS)	Nie dotyczy	Nie dotyczy	Ocena wyników funkcjonalnych w 90. dniu
Zmodyfikowany wywar Xiaoxuming (receptura ziołowa)	Apteka Szpitalna, Szpital Medycyny Tradycyjnej Chińskiej i Medycyny Zachodniej w mieście Dazhou	Nie dotyczy	Przygotowano zgodnie z normami apteki instytucjonalnej; zweryfikowano i wydano przez farmaceutów szpitalnych
Arkusz oceny w skali udaru NIH (NIHSS)	Krajowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udarów	Nie dotyczy	Znormalizowane narzędzie oceny klinicznej
NumPy	programiści NumPy	RRID: SCR_008633	Wersja 1.26.x
pandas	zespół programistyczny pandas	RRID: SCR_018239	Wersja 2.1.x
Kwas fosforowy	Sigma-Aldrich, USA	79619	Odczynnik czysty do analizy
Python	Python Software Foundation	RRID: SCR_008394	Wersja 3.11.x
Zestaw QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit	Qiagen, Niemcy	51804	Ekstrakcja DNA mikrobiomu kału
QIIME 2	zespół programistyczny QIIME 2	RRID: SCR_008249	Wersja 2024.5
Zestaw do oznaczania Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, USA	Q32851	Fluorescencyjne oznaczanie ilości DNA
scikit-learn	twórcy scikit-learn	RRID: SCR_002577	Wersja 1.4.x
SciPy	programiści SciPy	RRID: SCR_008058	Wersja 1.11.x
baza danych rRNA SILVA	Projekt SILVA	RRID: SCR_006423	Wersja 138.1
Zamrażarka niskotemperaturowa	Thermo Fisher Scientific	TSX60086A	−80 °C przechowywanie