Niniejsze badanie przedstawia symulowany system nadmorski z wykorzystaniem modelu mysiego w celu ilościowej oceny stopnia retencji oraz skuteczności fotoprotekcyjnej kremów z filtrem przeciwsłonecznym w warunkach złożonych stresorów środowiskowych, w tym napromieniowania ultrafioletowego, zanurzenia w wodzie morskiej, wypłukiwania przez fale oraz wysuszania przez wiatr. Służy ono jako narzędzie przesiewowe w fazie przedklinicznej i nie zastępuje standaryzowanych badań klinicznych.
Artykuł metodologiczny
An In vivo Mysi symulowany system nadmorski do oceny skuteczności i trwałości kremów z filtrem przeciwsłonecznym
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Promieniowanie ultrafioletowe (UV) jest głównym czynnikiem środowiskowym powodującym fotostarzenie skóry, oparzenia słoneczne oraz ostre uszkodzenia skóry spowodowane promieniowaniem UV. Filtry przeciwsłoneczne stanowią najpowszechniejszą metodę ochrony przed promieniowaniem, jednak obecne metody ich oceny nie oddają wiernie złożonych warunków nadmorskich albo wiążą się z wysokimi kosztami i ograniczeniami etycznymi. W niniejszej pracy przedstawiono nowy, symulowany system badawczy nadbrzeżny połączony z żywym modelem mysim w celu ilościowej oceny skuteczności i trwałości filtrów przeciwsłonecznych w warunkach złożonych czynników środowiskowych. Specjalnie zaprojektowana komora integruje regulowane napromienianie UV, zanurzanie w wodzie morskiej z symulacją fal oraz mechanizmy suszenia wiatrem. Ogolone BALB/c myszom podawano różne kremy przeciwsłoneczne i następnie wystawiano na standardowy 120-minutowy cykl imitujący warunki nadmorskie. Stopień utrzymania kremów przeciwsłonecznych oznaczono za pomocą fluorescencyjnego obrazowania, natomiast skuteczność fotoprotekcyjną oceniono metodą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) barwienie w celu oceny grubości naskórka i infiltracji zapalnej. Wyniki wykazały, że ten system może skutecznie różnicować działanie różnych filtrów przeciwsłonecznych. W szczególności filtr przeciwsłoneczny o wysokim poziomie ochrony i odporności na wodę wykazał najwyższą stopę retencji oraz zapewnił najlepszą ochronę przed uszkodzeniami spowodowanymi przez promieniowanie UV i czynniki środowiskowe. Niniejszy protokół stanowi opartą na zasadach etycznych, taną i wysoce odtwarzalną przedkliniczną metodę badań wstępnych, umożliwiającą badanie produktów chroniących skórę w warunkach symulowanego ekstremalnego środowiska, stanowiąc etap eksploracyjny, a nie zwalniający z obowiązkowego testowania SPF na ludziach.
Wprowadzenie
Promieniowanie ultrafioletowe (UV), w szczególności UVA i UVB, jest główną przyczyną fotostarzenia skóry, oparzeń słonecznych oraz ostrych uszkodzeń skóry wywołanych przez UV1,2,3. Stosowanie kremów z filtrem przeciwsłonecznym jest najpowszechniej przyjętą strategią łagodzenia tych niekorzystnych skutków4,5. W związku z tym dokładna ocena skuteczności filtrów przeciwsłonecznych ma kluczowe znaczenie zarówno dla badań dermatologicznych, jak i dla przemysłu kosmetycznego.
Obecnie głównymi metodami badania skuteczności kremów z filtrem przeciwsłonecznym są analizy instrumentalne in vitro oraz badania kliniczne z udziałem ludzi6,7. Metody in vitro, takie jak spektrofotometria UV na płytkach kwarcowych lub sztucznej skórze, są opłacalne i wysoce powtarzalne8,9. Nie symulują one jednak złożonej dynamiki tworzenia filmu przeciwsłonecznego, wodoodporności oraz odporności na zmywanie na żywej skórze. Z kolei badania kliniczne z udziałem ludzi, w których mierzy się minimalną dawkę rumieniową (MED) na plecach ochotników, są uznawane za złoty standard określania współczynnika ochrony przeciwsłonecznej (SPF) zgodnie z wytycznymi Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (ISO) (SPF: ISO 24444, wodoodporność: ISO 16217) oraz FDA10,11,12,13,14. Pomimo swojej niezawodności, badania kliniczne są kosztowne, czasochłonne, obarczone znaczną zmiennością osobniczą i silnie ograniczone względami etycznymi, zwłaszcza podczas testowania w ekstremalnych lub potencjalnie szkodliwych warunkach środowiskowych.
Istotnym ograniczeniem istniejących technik oceny jest brak możliwości kompleksowego symulowania rzeczywistych warunków nadmorskich. Podczas aktywności nad morzem kremy z filtrem podlegają synergistycznemu procesowi degradacji, obejmującemu zanurzenie w wodzie morskiej o wysokim zasoleniu oraz wypłukiwanie przez fale15,16. Czynniki te drastycznie obniżają stabilność adhezji i czas ochrony stosowanych produktów. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, w niniejszym badaniu wprowadzono nowatorski system symulacji testów nadmorskich z wykorzystaniem modelu myszy BALB/c. System ten integruje wiele kluczowych parametrów środowiskowych — w tym natężenie UV, zasolenie wody morskiej, temperaturę wody, siłę fal oraz prędkość wiatru — w jednej, wysoce sterowalnej platformie. Poprzez połączenie tego sprzętu z ilościowym obrazowaniem fluorescencyjnym i analizą histologiczną, protokół umożliwia precyzyjną ocenę zarówno wskaźnika retencji kremu z filtrem, jak i fizjologicznej skuteczności ochrony. Metoda ta stanowi wiarygodne, niskokosztowe i efektywne rozwiązanie do oceny wydajności kremów z filtrem w złożonych, praktycznych scenariuszach morskich.
Protokół
Wszystkie metody wykorzystujące kręgowce przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzono przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki w Badaniach na Zwierzętach Guangdong Laidi Biomedical Research Institute Co., Ltd., pod numerem zgody LDSW2025050-4.
1. Konfiguracja symulowanego pomieszczenia przybrzeżnego
- Zmontuj komorę testową, która składa się z przezroczystego, szczelnego metalowego pudełka (wymiary: 40 cm długości × szerokość 30 cm × wysokość 30 cm) z portami dostępowymi dla zwierząt.
- Zainstaluj jednostkę symulacji promieniowania UV: Umieść lampy UV (6 W) na górze komory, zapewniając natężenie około 2 mW/cm²2Symuluje to przeciętne intensywne południowe słońce nad morzem.
UWAGA: Promieniowanie UV jest niebezpieczne dla oczu i skóry. Upewnij się, że komora jest całkowicie uszczelniona, i podczas używania urządzenia UV nosić odpowiednie okulary ochronne oraz odzież ochronną. - Zintegruj jednostkę środowiska wodnego. Napełnij wbudowane zbiorniki wodne sztawną wodą morską.
- Przygotuj wodę morską, rozpuszczając komercyjną sól morską w wodzie oczyszczonej w stosunku 1 kg (± 0,05 kg) soli do 30 L (± 0,5 L) wody. Ustaw kontroler temperatury wody tak, aby utrzymywał stałą temperaturę 25 °C± 1 °C).
- Włącz maszynę falową przy natężeniu przepływu około 10 L/min, aby zasymulować siłę tarcia umiarkowanych fal przybrzeżnych.
- Ustaw wentylator tak, aby kierować przepływ powietrza nad obszarem przebywania zwierząt. Dostosuj przepływ powietrza do 35 stóp sześciennych na minutę (CFM), aby zasymulować morski wiatr.
- Połącz wszystkie komponenty z centralnym interfejsem sterującym. Przed przystąpieniem do testowania wprowadź docelowe parametry środowiskowe do systemu sterowania i dokonaj ich kalibracji za pomocą odpowiednich przyrządów pomiarowych.
UWAGA: Wykonaj to wstępne sprawdzenie, korzystając z zewnętrznego przenośnego cyfrowego radiometru UV, termometru wodoodpornego oraz anemometru, upewniając się, że natężenie promieniowania UV (2 mW/cm2), temperatura wody (25 °C) oraz prędkość wiatru (35 CFM) odpowiadają zamierzonym wartościom ustawczym przed rozpoczęciem eksperymentów biologicznych. - Podczas eksperymentu włączaj lub wyłączaj lampy UV, generator fal oraz odpływ wody poprzez interfejs umożliwiający dokładne wykonanie naprzemiennych faz zanurzania i wynurzania.
2. Przygotowanie modelu zwierzęcego
- Odmiana dorosła BALB/c myszy (o wadze około 20 g do 25 g) w warunkach standardowych i pozostawić je na aklimatyzację przez jeden tydzień przed doświadczeniem.
- Krótko zanarkotyzuj myszy za pomocą 1,5% izofluranu poprzez wdychanie, aby zminimalizować stres. Wykonać uprzednie golenie sierści na plecach myszy za pomocą urządzenia do usuwania sierści zwierząt.
- Następnie nałóż równomiernie krem depilacyjny o działaniu chemicznym na skórę grzbietową myszy. Po 3–5 minutach delikatnie usuń owłosienie wilgotną, ciepłą gazą.
UWAGA: Kremy depilacyjne chemiczne oraz paraformaldehyd stosowane w histologii są toksyczne i drażniące. Należy z nimi obchodzić się w miejscu dobrze wentylowanym, używając rękawic ochronnych. Unieszkodliwianie: Całkowite unieszkodliwienie odpadów chemicznych (paraformaldehyd) i odpadów biologicznych (padlina zwierząt i tkanki) należy przeprowadzać w wyznaczonych pojemnikach na odpady biologiczne i chemiczne zgodnie ściśle z wymogami instytucjonalnymi i lokalnymi przepisami regulacyjnymi. - Umieść ogolone myszy na dodatkowe 2 dni, aby umożliwić ich rekonwalescencję. Przed rozpoczęciem eksperymentu dokonaj wizualnej kontroli skóry grzbietowej, aby potwierdzić całkowitą nieobecność zaczerwienienia lub podrażnienia spowodowanych procesem ogolenia.
- Narysuj krzyż na odsłoniętej skórze grzbietowej za pomocą czarnego markera, aby podzielić obszar na cztery odrębne ćwiartki (ćwiartki 1–4).
3. Nakładanie filtrów przeciwsłonecznych i wstępna obróbka
- Przygotuj testowe kremy przeciwsłoneczne. Wybierz losowo trzy dostępne komercyjnie kremy przeciwsłoneczne: A, B i C.
- Nanieść środek filtrujący na wyznaczone obszary za pomocą 20 μL mikropipetą i rozprowadzić preparat równomiernie sterylnym opuszkami palców w delikatnych ruchach okrężnych przez 10 s, aby zapewnić powstanie jednolitej warstwy w następujący sposób:
UWAGA: Upewnij się, że nacisk wywierany przez opuszek palca pozostaje stały we wszystkich kwadrantach. Nierównomierne rozprowadzenie lub nadmierny nacisk mogą prowadzić do nieregularnej grubości warstwy, co bezpośrednio wpłynie na powtarzalność kolejnej oceny retencji. - Ćwiartka 1 (lewa górna): Nałóż 20 mg/cm2 ochrony przed słońcem A.
- Kwadrant 2 (góra-prawo): Zastosuj 20 mg/cm2 kremu przeciwsłonecznego B
- Kwadrant 3 (lewy dolny): Nałóż 20 mg/cm2 kremu przeciwsłonecznego C.
- Kwadrant 4 (prawy dolny): pozostawić nietraktowany (kontrola nienatryskana).
- Umieść myszy w pozycji spoczynkowej przez 5 minut, aby zapewnić równomierne i stabilne rozmieszczenie kremu przeciwsłonecznego na skórze grzbietowej.
4. Ocena retencji filtrów przeciwsłonecznych
- Dodaj bezpieczny znacznik fluorescencyjny (0,01% wag. Sulfo Cy7) do kremu przeciwsłonecznego A, kremu przeciwsłonecznego B oraz kremu przeciwsłonecznego C.
- Nanieś fluorescencyjnie znaczone kremy przeciwsłoneczne na skórę grzbietową myszy zgodnie z opisem w sekcji 3.
- Zdobądź początkowy obraz fluorescencji (F0) skóry grzbietowej, używając in vivo system obrazowania fluorescencyjnego
UWAGA: Sprawdź, czy parametry obrazowania, w tym czas naświetlania i płaszczyzna ogniskowa, są ściśle ustalone dla każdego zwierzęcia. Nieprawidłowe otrzymanie sygnału podstawowego (F0) unieważni ostateczne obliczenie wskaźnika retencji filtru przeciwsłonecznego. - Umieść myszy w komorze testowej. Wyłącz lampy UV i ustaw temperaturę wody na 25 °C.
- Podnieś poziom wody i uruchom generator fal, aby myszy przebywały w fazie zanurzenia (płynięcia) przez 30 minut, zapewniając, że ich głowy będą bezpiecznie nad powierzchnią wody.
- Następnie wyłącz generator fal i obniż poziom wody, aby odsłonić stopniową metalową platformę znajdującą się wewnątrz komory, pozwalając myszom bezpiecznie odpoczywać na platformie przez 30 minut (faza emersji).
- Powtórz fazę zanurzenia trwającą 30 minut i fazę wynurzenia trwającą 30 minut w drugim cyklu (łącznie 120 minut).
- Zrób zdjęcie fluorescencyjne po ekspozycji (F1) za pomocą in vivo system obrazowania
- Oblicz poziom retencji, korzystając ze wzoru:
Poziom retencji = (F1 / F0) × 100% (1) - Oblicz względną intensywność fluorescencji, korzystając ze wzoru:
Intensywność fluorescencji = (F1(X) / F1(A)) × 100% (2)
gdzie F0 to podstawowa intensywność fluorescencji, F1 to intensywność fluorescencji po doświadczeniu, F1(A) to intensywność fluorescencji po doświadczeniu w obszarze, gdzie zastosowano krem z filtrem przeciwsłonecznym A, a F1(X) to intensywność fluorescencji po doświadczeniu w obszarze, gdzie zastosowano krem z filtrem przeciwsłonecznym B lub C.
UWAGA: Podczas eksperymentu z monitorowaniem fluorescencji należy zapewnić, że lampy UV pozostają wyłączone, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji spowodowanemu przez promieniowanie UV. Całkowity czas ekspozycji wynosi 120 min, należy zapewnić ciągłe monitorowanie zwierząt' częstotliwość oddechów i stan aktywności w trakcie fazy zanurzenia w celu potwierdzenia braku objawów stresu lub wyczerpania.
5. Ocena skuteczności fotoprotekcji
- Nanoszenie standardowych (niefluorescencyjnych) filtrów przeciwsłonecznych na plecy myszy zgodnie z opisem w punkcie 3.
- Przyłóż kawałek czarnej taśmy blokującej promieniowanie UV do górnej części szyi myszy, aby służyła za wewnętrzną kontrolę zabezpieczoną przed działaniem UV. Zanotuj stan skóry w warunkach podstawowych. poprzez fotografia makroskopowa
UWAGA: Wciśnij krawędzie taśmy, aby zapobiec przedostawaniu się wody lub przypadkowemu odklejeniu się jej w trakcie etapu płukania falą. Jeżeli taśma się odkleje, obszar kontroli wewnętrznej zostanie narażony na działanie światła UV i wody, co zaburzy histologiczny poziom podstawowy. - Poddaj myszy temu samemu cyklowi zmian poziomu wody, jak opisano w sekcji 4, z włączoną jednostką symulującą promieniowanie UV: podnieś poziom wody na 30 minut (zanurzenie), obniż poziom wody na 30 minut (faza wynurzenia) i powtórz cykl drugi raz (łącznie 120 minut).
- Wyjmij myszy z komory i zanotuj występowanie zaczerwienienia, łuszczenia się lub twardnienia skóry, stosując fotografie makroskopowe.
UWAGA: W oparciu o wymiary komory (40 cm × 30 cm × 30 cm) i zwierzęta' przestrzeń działania względem źródła światła, dawka skumulowanego promieniowania UV dostarczona w cyklu 120-minutowym szacowana jest na około 2,5 J/cm2Dawki na tym poziomie skutecznie wywołują mierzalne pogrubienie naskórka i ostry stan zapalny, zapewniając jednocześnie bezpieczeństwo myszy i rygorystyczne przestrzeganie limitów dobrostanu zwierząt.3. - W końcowym punkcie eksperymentu uśmiercić myszy w sposób humanitarny poprzez dyslokację szyjną pod głęboką narkozą izofluranem, ściśle przestrzegając wytycznych American Veterinary Medical Association (AVMA) dotyczących eutanazji zwierząt, w celu pobrania tkanek skórnych do dalszej oceny histologicznej. Pobrać tkanki skóry grzbietowej z czterech kwadrantów oraz z obszaru chronionego taśmą.
- Utrwalaj tkanki w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny, a następnie przeprowadź standardową dehydratację, woskowanie i cięcie.
- Ubarwij przekroje hematoksyliną i eozyną (H&E). Krótko mówiąc, odparafinizować przekroje w ksylolu, odwodnić w roztworach etanolu o malejącym stężeniu, wybarwić hematoksyliną przez 5 min, przemyć bieżącą wodą z kranu, kontrastować eozyną przez 1 min, odwodnić i zamontować w żywicznym ośrodku montażowym.
- Obserwuj barwione przekroje pod mikroskopem świetlnym. Zmierz grubość naskórka i oszacuj stopień zapalenia skóry, zliczając infiltrujące komórki zapalne.
UWAGA: Dawka UV dostarczona w trakcie cyklu jest wystarczająca do wywołania ostrych objawów rumienia w celu oceny skuteczności, ale pozostaje wyraźnie poniżej progu bezpiecznego i niebędącego zagrożeniem dla życia, co potwierdza brak u myszy objawów ciężkich uszkodzeń systemowych oraz utrzymywanie normalnej aktywności fizycznej po zakończeniu cyklu testowego.
6. Analiza statystyczna
- Przeprowadź analizę statystyczną za pomocą GraphPad Prism 9.5. Wyniki zmiennych ilościowych przedstaw jako średnią ± odchylenie standardowe. Użyj jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem Tukeya’z testem *a posteriori* do porównań między wieloma grupami. Istotność statystyczną zdefiniowano jako *p < 0.05, **p < 0,01, a ns oznacza braku istotności (p > 0.05).
Wyniki
Charakterystyka środowiskowa systemu testowego
Przed in vivo ocena, parametry fizyczne komory imitującej środowisko nadmorskie zostały skalibrowane w celu zapewnienia wysokiej wierności środowiskowej. Jednostka symulująca promieniowanie UV wykorzystywała lampę o mocy 6 W, emitującą szerokie widmo o zakresie od 300 do 420 nm z długością fali szczytową wynoszącą 340 nm. Konkretny rozkład widmowy zapewnia dominujące promieniowanie UVA w połączeniu z biologicznie istotną frakcją UVB, skutecznie naśladującą typowy zakres promieniowania ultrafioletowego naturalnego południowego słońca docierającego do powierzchni Ziemi'powierzchnia s17. Maszyna falowa działała przy przepływie 10 L/min, co generuje umiarkowane naprężenie ścinające cieczy, porównywalne z delikatnym odpływem fal przybrzeżnych. Dodatkowo, jednostka dopływu powietrza zapewniała stałą prędkość wiatru wynoszącą 35 CFM, co odpowiada prędkości wiatru około 3–4 m/s nad obszarem testowym. Odpowiada to lekkiej bryzie (skala Beauforta 3), typowej dla warunków meteorologicznych nad morzem.18Te połączone parametry wiarygodnie odtwarzają cykliczne obciążenia mechaniczne i czynniki środowiskowe występujące podczas typowych czynności wykonywanych nad morzem.
Ocena retencji kremu przeciwsłonecznego
Najpierw zmontowano symulowane urządzenie brzegowe. Jak pokazano na Rycina 1A, system ten składa się głównie z wentylatora, systemu napromieniowania UV, zbiornika z imitowanym morskim wodą oraz systemu sterowania, które służą odpowiednio do osuszania powietrznego, napromieniowania UV, zanurzania w wodzie morskiej oraz sterowania centralnego. Po umieszczeniu myszy w aparaturze i uruchomieniu systemu, warunki faz zanurzenia i wynurzenia na brzegu zostały pomyślnie zasymulowane (Rycina 1B). Na podstawie tego układu najpierw zbadano retencję filtrów przeciwsłonecznych w tych warunkach. Początkowo komercyjne filtry przeciwsłoneczne A, B i C, oznaczone znacznikiem fluorescencyjnym, naniesiono na skórę grzbietową myszy. Następnie myszy te poddano cyklowi naprzemiennemu w urządzeniu symulacyjnym, składającemu się z 30 minut zanurzenia (symulującego pływanie) i 30 minut fazy wynurzenia (symulującej opalanie się na brzegu). Po 2 godzinach, po pełnym cyklu fal i wiatru, wykryto fluorescencję pozostałej na skórze substancji za pomocą in vivo obrazowanie. Jak pokazano w Rycina 2A–B, w porównaniu z pomiarami przed symulacją wszystkie grupy z zastosowaniem kremów przeciwsłonecznych wykazały zmniejszenie intensywności fluorescencji, co wskazuje, że efekt spłukiwania falami morskimi powoduje znaczne usunięcie kremu. Spośród nich, ćwiartka traktowana Kremem C zachowała względnie wysoki poziom fluorescencji, Krem B wykazał umiarkowaną retencję, natomiast Krem A wykazał najniższą retencjęRycina 2C). Oznacza to, że kremy przeciwsłoneczne C i B charakteryzują się stosunkowo silniejszymi możliwościami retencji. Dane te potwierdzają, że nasze urządzenie pozwala ilościowo odróżnić trwałość różnych formuł w warunkach złożonego obciążenia środowiskowego.
Skuteczność fotoprotekcyjna
Aby dalej zbadać ochronne działanie tych filtrów przeciwsłonecznych przed promieniowaniem UV w symulowanym środowisku nadmorskim, przeprowadzono makroskopowe obserwacje skóry grzbietowej myszy. Jak pokazano w Ryc. 3A i 3B, niechroniona kontrola wykazywała uszkodzenia wywołane promieniowaniem UV, charakteryzujące się wyraźnym rumieniem, zaczerwienieniem i oparzeniem słonecznym. W przeciwieństwie do tego, obszary traktowane filtrami przeciwsłonecznymi prezentowały znacznie łagodniejsze objawy oparzenia słonecznego. Dodatkowo, analiza histologiczna używając H&Wykonano barwienie E było zgodne z powyższymi obserwacjami makroskopowymi (Rycina 4A–B). Gdy niechronioną kontrolę wystawiono na działanie symulatora warunków nadmorskich, zaobserwowano istotne pogrubienie naskórka oraz znaczną infiltrację komórek zapalnych (Rycina 4C) w dermie, co pokazuje, że zasymulowany system badawczy nadmorski skutecznie odtwarza oparzenia skóry w rzeczywistym środowisku nadmorskim. Zastosowanie filtrów przeciwsłonecznych znacząco złagodziło te zmiany patologiczne. Warto zaznaczyć, że grubość naskórka oraz infiltracja komórek zapalnych w tkance skóry poddanej działaniu Filtra C były wyraźnie zbliżone do tych obserwowanych w grupie wewnętrznej kontrolnej zabezpieczonej przed promieniowaniem UV i narażonej na te same warunki środowiskowe. Wskazuje to, że Filtr C zapewnia optymalny efekt ochronny w zasymulowanym środowisku morskim, co najprawdopodobniej wynika z jego wysokiego wskaźnika retencji oraz wrodzonych właściwości fotoprotekcyjnych.
Rycina 1: Przegląd symulowanego systemu testowego nadmorskiego. (ASchematyczny diagram aparatury.B) Myszy w komorze testowej. Zmodyfikowana komora testowa wyposażona jest w urządzenie do napromieniania UV, zbiornik wodny z generatorem fal oraz wentylator, skutecznie symulując rzeczywiste środowisko nadmorskie. Z tym obrazem nie wiążą się żadne problemy praw autorskich, ponieważ został on uzyskany przez autorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2Analiza fluorescencyjna retencji kremu przeciwsłonecznego (AReprezentatywne obrazy fluorescencyjne skóry grzbietowej myszy przed i po 120-minutowym eksperymencie.B) Ilościowa analiza retencji fluorescencji. (C) Analiza względnej intensywności fluorescencji. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 5). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu Tukeya’z testem *a posteriori*.p < 0.05, **p < 0.01. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 3: Makroskopowy wygląd skóry myszy po narażeniu na czynniki środowiskowe. (AReprezentatywne obrazy makroskopowe grzbietowej skóry myszy po 120-minutowym narażeniu na symulowane środowisko nadmorskie.BPowiększone widoki lokalne pokazujące występowanie zaczerwienienia i łuszczenia się w niechronionym obszarze kontrolnym w porównaniu z obszarami chronionymi kremem przeciwsłonecznym oraz wewnętrznym kontrolnym obszarem zabezpieczonym przed promieniowaniem UV (Normal). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 4: Ocena histologiczna skuteczności fotoprotekcji. (A) Reprezentatywny H&Przecięcia skóry grzbietowej myszy po zabarwieniu eozyną z różnych obszarów leczonych po ekspozycji środowiskowej. Linie wskaźnikowe wskazują granice mierzonego naskórka. Szerokość szkalowana = 250 µm.B) Ilościowa analiza grubości naskórka w każdym wyznaczonym obszarze.C) Ilościowa ocena względnej liczby komórek zapalnych (%). Nieekspozycyjny, chroniony przed promieniowaniem UV kontrolny obszar (Normalny) przyjęto jako wartość podstawową (100%). Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 5). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), po której wykonano test Tukeya’z testem *a posteriori*.p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
W niniejszym badaniu opracowano i zwalidowano wieloczynnikowy symulowany system testowy warunków nadmorskich połączony z żywym modelem mysim. Poza dostarczeniem nowej aparatury, ten zintegrowany protokół umożliwia dynamiczną ocenę trwałości kremów z filtrem przeciwsłonecznym oraz ich skuteczności fotoprotekcyjnej w warunkach synergistycznego działania stresorów środowiskowych. Poprzez wypełnienie luki między uproszczonymi testami in vitro a złożonymi badaniami klinicznymi z udziałem ludzi, metoda ta tworzy kompleksową platformę przedkliniczną do zrozumienia, jak formulacje barier skórnych sprawdzają się w praktycznych warunkach morskich.
Główną zaletą tego protokołu w porównaniu z metodami konwencjonalnymi jest jego wysoka wierność środowiskowa. Standardowe testy wodoodporności zazwyczaj obejmują statyczne zanurzenie w wodzie w kuwecie laboratoryjnej19. W przeciwieństwie do nich, nasz system integruje tarcie mechaniczne wynikające z działania fal, stres osmotyczny wysokosolonej wody morskiej, efekt odparowania wywołany wiatrem oraz ciągłe naświetlanie UV. Czynniki te działają synergistycznie, prowadząc do rozpadu filmu kremu z filtrem, co zapewnia znacznie bardziej rygorystyczny i realistyczny test obciążeniowy. Należy zauważyć, że podczas oceny retencji fluorescencji lampy UV zostały wyłączone, aby zapobiec gaszeniu fluoroforów. W związku z tym ten konkretny test ocenia trwałość fizyczną w obliczu mechanicznego wypłukiwania i stresu osmotycznego, ale nie uwzględnia czynnika chemicznej degradacji indukowanej przez promieniowanie UV. Aby to zrekompensować, późniejszą ocenę histologiczną przeprowadzono z włączonym modułem UV, co pozwoliło na całościową ocenę praktycznej skuteczności. Wyniki wyraźnie wykazały, że choć wszystkie kremy z filtrem zapewniły pewien podstawowy poziom ochrony, wskaźnik retencji (Rycina 2) oraz odpowiadająca mu ochrona histologiczna (Rycina 4) różniły się znacząco w zależności od odporności danej formulacji na te połączone siły dynamiczne.
Wykorzystanie myszy BALB/c zapewnia doskonałą platformę in vivo, która uwzględnia zmienne biologiczne, takie jak wydzielanie sebum, przeznaskórkowa utrata wody oraz dynamiczny ruch skóry, których nie są w stanie odwzorować sztuczne modele skóry. Dawka UV podawana podczas 120-minutowego cyklu była ściśle kontrolowana, aby skutecznie wywołać ostre oparzenie słoneczne na odsłoniętym obszarze skóry, nie powodując jednocześnie toksyczności systemowej ani poważnych uszkodzeń, zachowując ścisłe limity etyczne dla myszy BALB/c. Ponadto, dzieląc grzbiet pojedynczej myszy na cztery kwadranty, wyeliminowaliśmy różnice biologiczne między osobnikami, co pozwoliło na bardzo dokładne porównania parowe między różnymi formulacjami kremów z filtrem przeciwsłonecznym.
Kluczowym krokiem w tym protokole jest zapewnienie całkowitej regeneracji skóry mysiej po depilacji, ponieważ jakiekolwiek podrażnienie wyjściowe zafałszuje odczyt histologiczny. Ponadto jednorodne nałożenie filmu kremu z filtrem, stabilna kalibracja parametrów środowiskowych przed testowaniem oraz precyzyjne odmierzenie czasu faz zanurzenia i wynurzenia są niezbędne do zapewnienia wysokiej powtarzalności między partiami. W zakresie rozwiązywania problemów mogą wystąpić kilka przewidywalnych trudności. Jeśli zaobserwowano nierównomierne rozprowadzenie kremu z filtrem, należy ponownie skalibrować objętość pipetowania i zapewnić delikatny ruch okrężny. Jeśli rumień wynikający z depilacji utrzymuje się, okres regeneracji powinien zostać wydłużony lub dotknięte zwierzęta powinny zostać wykluczone. Aby zapobiec zmęczeniu zwierząt podczas zanurzenia, należy ściśle monitorować ich aktywność i zapewnić pełną dostępność platformy odpoczynkowej podczas fazy zanurzenia.
Ograniczeniem tego modelu są różnice anatomiczne i fizjologiczne między skórą myszy a skórą człowieka (np. gęstość mieszków włosowych i grubość naskórka). Skóra myszy charakteryzuje się większą gęstością mieszków włosowych i cieńszym naskórkiem, co może wpływać na tworzenie się filmu kremu z filtrem. Liczne wgłębienia mieszków włosowych mogą działać jak mikro-rezerwuary, co potencjalnie sprzyja mechanicznemu zatrzymywaniu filtrów przeciwsłonecznych opartych na cząsteczkach (nieorganicznych) w porównaniu do preparatów ściśle organicznych. Choć system ten stanowi solidne narzędzie porównawcze do przesiewu formulacji, w celu ostatenego określenia wskaźnika SPF niezbędne pozostają kliniczne badania z udziałem ludzi. Przyszłe zastosowania tego systemu są szerokie. Poza kremami z filtrem, aparatura ta może zostać dostosowana do oceny trwałości innych kosmetyków do stosowania miejscowego, kremów barierowych, opatrunków na rany, a nawet tekstyliów chroniących przed promieniowaniem UV w trudnych warunkach środowiskowych. Integracja tego systemu usprawnia proces R&procesu, oferując chemikom kosmetycznym i badaczom dermatologii szybką, kostektywną i etyczną metodę przesiewową przed przejściem do badań z udziałem ludzi.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca była wspierana przez fundusze z Foshan Self-funded Science and Technology Innovation Project (No. 2220001004842).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Eozyna | Macklin | 770427 | Stosowana do barwienia H&E |
| Etanol | Macklin | E809059 | Stosowany do barwienia H&E |
| Krem do depilacji | Veet | TMG-001 | Stosowany do usuwania drobnych włosków |
| Hematoksylina | Macklin | H810910 | Stosowana do barwienia H&E |
| Image J | Stosowany do analizy obrazów | ||
| System obrazowania in vivo | Perkinelmer | IVIS Lumina III | Stosowany do wykrywania retencji fluorescencji |
| Izofluran | RWD Life Science | R510-22-10 | Stosowany do znieczulania myszy |
| Paraformaldehyd | Biosharp | BL539A | Stosowany do utrwalania tkanek skóry |
| Trymer | Chemmole | CM700015 | Stosowany do usuwania większości owłosienia |
| Chlorek sodu | Macklin | S805285 | Stosowany do przygotowania symulowanej wody morskiej |
| Sulfo Cy7 | Ruixibio | R-Z54515 | Stosowany do znakowania kremu z filtrem przeciwsłonecznym |
| Lampa UV | Kanfu Lighting Technology | T5-6W | Stosowana do dostarczania promieni ultrafioletowych |
| Ksylen | Macklin | X821391 | Stosowany do barwienia H&E |
Bibliografia
- RK Gupta, L Parvadiya, K Dudhat. Advancements in skin cancer prevention and treatment: harnessing technology, natural therapies, and emerging diagnostic approaches. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2025; 5: 1-54.
- Q Gao, C Xu, M Tan, et al. Hydrogel-based therapies for photoaging: current advances and future perspectives. J Cosmet Dermatol. 2025; 6: e70295.
- Hong S, Peng Z, Wu M, et al. Human-hair-derived natural particles as multifunctional sunscreen for effective UV protection. ACS nano. 2023; 17(15): 14943-14953.
- S Lautenschlager, HC Wulf, MR Pittelkow. Photoprotection. Lancet. 2007; 9586: 528-37.
- E Biba. Protection: the sunscreen pill. Nature. 2014; 7527: S124-5.
- M Pelizzo, E Zattra, P Nicolosi, et al. In vitro evaluation of sunscreens: an update for the clinicians. ISRN Dermatol. 2012; 352135.
- S Bielfeldt. Performance metrics of sunscreen formulations: in vitro and in vivo techniques. Curr Probl Dermatol. 2021; 124-132.
- J Akrman, L Kubác, H Bendová, et al. Quartz plates for determining sun protection in vitro and testing the photostability of commercial sunscreens. Int J Cosmet Sci. 2009; 2: 119-29.
- DL Lott, J Stanfield, RM Sayre, et al. Uniformity of sunscreen product application: a problem in testing, a problem for consumers. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 2003; 1: 17-20.
- SM Tuchayi, Z Wang, J Yan, et al. Sunscreens: misconceptions and misinformation. J Invest Dermatol. 2023; 8: 1406-1411.
- A Breneman, DV Belsito. Sun protection factor testing: a call for an in vitro method. Cutis. 2022; 2: E15-e17.
- U Osterwalder, JC Hubaud, E Perroux-David, et al. Sun-protection factor of zinc-oxide sunscreens: SPF(in vitro) too low compared to SPF(in vivo)-a brief review. Photochem Photobiol Sci. 2024; 10: 1999-2009.
- International Organization for Standardization. ISO 24444:2019 Cosmetics — Sun protection test methods — In vivo determination of the sun protection factor (SPF). Geneva: ISO; 2019.
- International Organization for Standardization. ISO 16217:2020 Cosmetics — Sun protection test methods — Water resistance percentage. Geneva: ISO; 2020.
- G Ruiz-Gutiérrez, A Rodríguez-Romero, A Tovar-Sánchez, et al. Analysis and modeling of sunscreen ingredients’ behavior in an aquatic environment. Oceans. 2022; 3: 340-363.
- JK Saxe, L Mullins, R Jones, et al. Influence of sunscreen formulation on the transfer of mineral and organic ultraviolet filters from skin to seawater in simulated ocean bathing tests. Int J Cosmet Sci. 2023; 84-92.
- D’orazio, J, Jarrett S, Amaro-Ortiz A, et al. UV radiation and the skin. Int J Mol Sci. 2013; 14(6): 12222-12248.
- Met Office. Beaufort wind force scale [Internet]. Exeter: Met Office. Available from: https://weather.metoffice.gov.uk/guides/coast-and-sea/beaufort-scale
- K Geoffrey, A Mwangi, S Maru. Sunscreen products: rationale for use, formulation development and regulatory considerations. Saudi Pharmaceutical Journal. 2019; 7: 1009-1018.
Przedruki i uprawnienia
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny