Niniejszy protokół opisuje model zawału mięśnia sercowego ex vivo w izolowanym sercu mysim perfundowanym krystaloidem. Podejście to pozwala pominąć zmienne systemowe, co umożliwia badaczom bezpośrednią ocenę efektów kardiologicznych przy braku czynników zewnętrznych, które mogłyby zakłócić przeżywalność kardiomiocytów, oraz testowanie lokalnych interwencji farmakologicznych.
Artykuł metodologiczny
Model zawału mięśnia sercowego Ex Vivo w perfundowanym krystaloidem sercu myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zawał mięśnia sercowego (MI) w warunkach eksperymentalnych modeluje się u zwierząt zazwyczaj poprzez przejściową okluzję lewej tętnicy wieńcowej opadającej przedniej (LAD) lub, na poziomie komórkowym, za pomocą protokołów hipoksji i reoksygenacji. Alternatywnym modelem niedokrwienia na poziomie narządu jest preparat serca perfundowanego metodą Langendorffa, który pozostaje podstawowym narzędziem do badania wpływu zaburzeń fizjologicznych i interwencji farmakologicznych na kardioprotekcję. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy podstawową metodologię i fundamentalne zasady wymagane do ustanowienia regionalnego modelu niedokrwienia/reperfusion mięśnia sercowego w izolowanym sercu myszy. W skrócie, po zatrzymaniu kardioplegicznym tętnicę LAD podwiązano po krótkim przepłukaniu lodowatym PBS. Serce zamontowano następnie w aparacie Langendorffa i perfundowano bogatym w składniki odżywcze, natlenionym buforem w temperaturze 37°C pod stałym ciśnieniem perfuzji 110 cmH₂O. Niedokrwienie mięśnia sercowego indukowano na czas 30, 45, 60, 90 i 120 min, po czym następowało 90 min reperfuzji. Żywotność kardiomiocytów oraz wielkość zawału oceniono za pomocą mikroskopowej metody barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolium (TTC). Wykazaliśmy, że model MI ex vivo pozwala na niezawodne uzyskanie powtarzalnych uszkodzeń mięśnia sercowego, charakteryzujących się stopniową utratą żywotnych kardiomiocytów w obszarze zawału wraz z wydłużaniem czasu niedokrwienia. Ponadto, aby uzyskać wyraźne wyznaczenie obszaru zawału mięśnia sercowego metodą TTC, wymagane było co najmniej 30 min reperfuzji. Podejście to eliminuje zmienne systemowe, co pozwala badaczom na bezpośrednią ocenę efektów kardiologicznych wobec braku zewnętrznych wpływów regulacyjnych, takich jak krążące czynniki humoralne i naciek komórek odpornościowych, które mogą zaburzać przebieg zawału, a także na testowanie miejscowych interwencji farmakologicznych. Tym samym model MI ex vivo stanowi użyteczną platformę do badania mechanizmów kardioprotekcyjnych działających bezpośrednio na kardiomiocyty.
Wprowadzenie
Zawał mięśnia sercowego (MI) występuje, gdy przepływ krwi w tętnicach wieńcowych zostaje przerwany, co prowadzi do śmierci tkanek i ciężkiego upośledzenia funkcji. Choć zazwyczaj bada się go w całych organizmach, termin ten może odnosić się do regionalnego MI ograniczonego do konkretnych struktur serca lub do modeli laboratoryjnych serca izolowanego ex vivo (np. perfuzja Langendorffa), wykorzystywanych do badania zawałów przy braku wpływu systemowego1. W związku z tym serce poddane perfuzji Langendorffa służy jako solidny i dobrze ugruntowany model eksperymentalny do badania niedokrwiennego uszkodzenia mięśnia sercowego od ponad 50 lat2.
Model MI ex vivo w izolowanym sercu oferuje szereg zalet, w tym precyzyjną kontrolę środowiska eksperymentalnego oraz możliwość oceny bezpośredniego wpływu interwencji, takich jak środki farmakologiczne, na mięsień sercowy niezależnie od wpływów systemowych, w tym krążących czynników humoralnych, składników krwi i regulacji neurohumoralnej3. Dzięki zminimalizowaniu tych czynników zakłócających, model ex vivo zapewnia bardziej przewidywalne i powtarzalne podejście niż modele in vivo, a tym samym ułatwia rygorystyczne badanie procesów chorobowych i szlaków molekularnych zaangażowanych w MI4.
W izolowanych sercach niedokrwienie mięśnia sercowego może być indukowane globalnie lub regionalnie5. W modelu globalnego MI całkowicie przerywany jest przepływ perfuzatu przez cały układ wieńcowy, natomiast w modelu regionalnego MI przejściowo zamyka się jedynie lewą przednią tętnicę wieńcową (LAD) poprzez podwiązanie, co prowadzi do uszkodzenia niedokrwiennego ograniczonego do mięśnia sercowego dystalnie względem miejsca podwiązania. Chociaż model globalnego MI jest technicznie prosty w wykonaniu, posiada on kilka ograniczeń, które zawężają jego zastosowanie w badaniach nad kardioprotekcją6. Jednym z głównych ograniczeń jest fakt, że czas trwania niedokrwienia jest ograniczony przez wytrzymałość całego serca, co utrudnia indukcję przedłużonego niedokrwienia przy prawdopodobieństwie wystąpienia zawału transmuralnego porównywalnym do sytuacji in vivo7. Ponadto, mimo że modele ex vivo zazwyczaj zapewniają doskonałą powtarzalność, gdy czas trwania niedokrwienia i reperfuzji jest starannie kontrolowany, protokoły te znacznie różnią się między laboratoriami. Taka zmienność podkreśla potrzebę lepszej standaryzacji i charakterystyki izolowanego serca myszy, szczególnie ponieważ wiele krytycznych szczegółów metodologicznych pozostaje niewystarczająco opisanych w literaturze8.
Z drugiej strony, regionalny model MI jest technicznie trudniejszy do opracowania. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy kilka modyfikacji i praktycznych strategii optymalizacji indukcji wiarygodnego MI ex vivo w izolowanym sercu myszy, szczególnie w celu oceny interwencji farmakologicznych nakierowanych na kardioprotekcję9,10. W związku z tym ten zmodyfikowany protokół MI ex vivo z wykorzystaniem perfuzji serca myszy w układzie Langendorffa stanowi skuteczną platformę do bezpośredniej oceny przeżywalności mięśnia sercowego po zastosowaniu interwencji terapeutycznych.
Protokół
Opisany tutaj model izolowanej perfuzji serca jest ostrym eksperymentem bez przeżycia, który został zatwierdzony przez lokalne organy nadzorcze (O1019/25, LANUV w Nadrenii Północnej i Westfalii, Niemcy). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE oraz przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Sprzęt i odczynniki chemiczne niezbędne do przeprowadzenia eksperymentów wymieniono w Tabeli materiałów.
1. Konfiguracja systemu retroperfuzji Langendorffa dla izolowanego serca myszy
UWAGA: Zaprojektowano system grawitacyjny bez recyrkulacji w celu dostarczania natlenionego krystaloidalnego perfuzatu (bufor Krebsa-Henseleita, KHB) do izolowanego serca myszy pod stałym ciśnieniem 110 cmH2O (Rysunek 1A).
- Oczyścić szklane elementy aparatu Langendorffa za pomocą 0.1 M/L HCl oraz 100% etanolu, a następnie wypłukać wodą destylowaną przed montażem systemu.
- Odważyć wszystkie odczynniki niezbędne do przygotowania 2 L zmodyfikowanego KHB zgodnie z następującymi stężeniami końcowymi (mM): 116.02 NaCl, 4.63 KCl, 1.10 MgSO4·7H2O, 1.21 KH2PO4, 2.52 CaCl2·2H2O, 24.88 NaHCO3, 8.30 D-glucose, 2.0 pirogronianu sodu.
- Rozpuścić wszystkie odczynniki z wyjątkiem CaCl₂ w wodzie dwukrotnie destylowanej w kolbie o pojemności 2 L, stale przepuszczając Carbogen (95% O₂/5% CO₂) przez co najmniej 10 min w celu wyrównania pH do 7.4.
- Dodać CaCl₂ do roztworu w kolejnym kroku, aby zapobiec wytrącaniu osadu.
- Kontynuować napowietrzanie roztworu Carbogenem przez kolejne 10 min.
- Przefiltrować roztwór KHB pod próżnią przez filtr membranowy 0.2 µm, aby usunąć drobne cząstki, które mogłyby zablokować mikrokrążenie wieńcowe.
- Przenieść przefiltrowany roztwór KHB do szklanego zbiornika o pojemności 2 L umieszczonego w wstępnie podgrzanej kąpieli wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C.
- Połączyć zbiornik KHB ze szklaną kolumną ciśnieniową, umożliwiając ciągłe napełnianie kolumny natlenionym KHB dzięki ciśnieniu generowanemu przez gaz Carbogen w zbiorniku.
- Upewnić się, że w systemie rurek odpływowych nie ma pęcherzyków powietrza.
- Równoważyć roztwór KHB z Carbogenem przez dodatkowe 30 min przed rozpoczęciem eksperymentu.
2. Izolacja i kaniulacja serca
UWAGA: W niniejszych eksperymentach wykorzystano samce myszy C57BL/6J o masie 20–25 g. Wszystkie procedury eksperymentalne muszą być odpowiednio udokumentowane zgodnie z lokalnymi przepisami, w tym uzasadnienie, data oraz metoda eutanazji.
- Delikatnie umieść mysz w komorze indukcyjnej zawierającej 5% izofluranu (v/v) w celu indukcji znieczulenia.
- Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez całkowity brak reakcji na mocne ściśnięcie palca stopy, a następnie przenieś zwierzę na stół operacyjny. Natychmiast uśmierć mysz poprzez zwichnięcie stawów szyjnych, co potwierdza brak oddechu i utrata napięcia mięśniowego w dolnej części ciała.
- Przetnij klatkę piersiową obustronnie w kierunku mostka, aby w pełni odsłonić serce i aortę wstępującą.
- Chwyć tkankę pozasercową pęsetą i wycinij serce.
- Umieść serce w małym, uprzednio schłodzonym zlewku zawierającym 50 mL lodowatego roztworu KHB na co najmniej 30 s, aby wywołać zatrzymanie akcji serca.
UWAGA: Ponieważ aktywność serca jest silnie zależna od temperatury, serce zostaje całkowicie zatrzymane poprzez zanurzenie w lodowatym roztworze KHB. - Przenieś serce na wstępnie schłodzony, zwilżony roztworem KHB wacik bawełniany umieszczony w metalowej miseczce, w której przygotowano system kaniul podłączonych do trójdrożnego kranu (Rysunek 1B).
UWAGA: System perfuzyjny nie powinien zawierać pęcherzyków powietrza. - Przygotuj luźny węzeł półkwadratowy z jedwabnej nici 5-0 na dystalnym końcu kaniuli.
- Ostrożnie wypreparuj grasicę, tkankę łączną i pozostałe tkanki pozasercowe (w tym płuca i przełyk), aby odsłonić i przyciąć pierścień aorty.
UWAGA: Upewnij się, że aorta wstępująca ma odpowiednią długość, aby umożliwić poprawną kaniulację. - Osadź serce na kaniuli i zabezpiecz je wcześniej przygotowanym szwem.
- Przepłucz serce 5 mL lodowatego PBS, aby usunąć pozostałą krew z krążenia wieńcowego.
3 Ischemia i reperfuzja mięśnia sercowego ex vivo
UWAGA: Globalne niedokrwienie mięśnia sercowego wywołano poprzez całkowite zatrzymanie perfuzji serca, natomiast regionalne niedokrwienie mięśnia sercowego uzyskano poprzez przejściowe podwiązanie LAD pod stereomikroskopem.
- Ustaw LAD w centrum pola widzenia, delikatnie obracając serce poprzez regulację znajdującego się pod nim wacika bawełnianego. Podczas perfuzji PBS naczynie LAD stało się przezroczyste i wyraźnie odróżnialne od otaczającego mięśnia sercowego.
- Przerowadź stożkowatą igłę z nicią polipropylenową 8–0 pod LAD, 1 mm poniżej dolnej krawędzi lewego przedsionka.
UWAGA: Upewnij się, że LAD znajduje się dokładnie pomiędzy dwoma miejscami nakłucia, aby uniknąć uszkodzenia naczyń spowodowanego podwiązaniem. - Umieść fragment miękkiego pledgetu nad LAD.
- Mocno zaciśnij szew, aby zatrzymać perfuzję w odcinku dystalnym względem miejsca podwiązania.
- Przenieś kaniulowane serce do aparatu Langendorffa i rozpocznij perfuzję wsteczną.
- Zanurz serce w kąpieli organowej z płaszczem wodnym, aby utrzymać stałą temperaturę (37 °C) przez cały okres eksperymentu.
- Monitoruj szczytowy i stacjonarny przepływ wieńcowy (Tabela 1).
- W wyznaczonych punktach czasowych niedokrwienia mięśnia sercowego (patrz sekcja wyników) przerwij perfuzję i wyjmij kaniulowane serce z aparatu perfuzyjnego.
- Natychmiast zanurz serce w lodowatym KHB (4 °C), aby całkowicie zatrzymać skurcze serca.
- Umieść serce z powrotem na waciku bawełnianym w schłodzonej metalowej szalce i poluzuj podwiązanie LAD.
- W badaniach nad interwencją farmakologiczną wstrzyknij na tym etapie 5 µL interleukiny 6 (IL-6, 0,1 mg/mL) do zawałowej ściany przedniej, używając strzykawki insulinowej 30 G.
- Ponownie zamocuj kaniulowane serce w aparacie perfuzyjnym i wznowij perfuzję serca (reperfuzja).
4. Ocena uszkodzenia mięśnia sercowego i przeżywalności
UWAGA: Barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolium (TTC) wybarwia żywe mięsień sercowe na kolor ciemnoczerwony, podczas gdy tkanka zawałowa/nekrotyczna po utrwaleniu w roztworze Zamboniego przybiera kolor beżowy.
OSTRZEŻENIE: TTC jest powszechnie uważany za substancję niebezpieczną i wymaga ostrożnego obchodzenia się, ponieważ może powodować lekkie podrażnienie skóry, poważne podrażnienie oczu oraz jest szkodliwy w przypadku wdychania. Odpady i pozostałości należy utylizować zgodnie z wymogami lokalnych organów nadzorczych.
- Przerwać perfuzję 90 min po reperfuzji i natychmiast zanurzyć serce w lodowatym roztworze KHB, aby zatrzymać skurcze serca.
- Podłączyć kaniulę do strzykawki o pojemności 3 ml wypełnionej uprzednio roztworem do barwienia TTC (1% TTC rozpuszczony w PBS) poprzez trójdrożny kurek.
- Wprowadź 1 ml roztworu TTC do serca, powtórz infuzję trzykrotnie, podając całkowitą objętość 3 ml w ciągu 15 min.
- Przykryć serce wilgotnym papierem ręcznicznym, aby zapobiec wysychaniu powierzchni.
- Umieść serce w probówce do wirowania zawierającej 3 ml roztworu TTC w temperaturze 4 °C przez noc.
- Przygotowanie bloku tkankowego z zastosowaniem związku Optimal Cutting Temperature (OCT).
UWAGA: Blok tkankowy można przechowywać w temperaturze −80 °C przez kilka miesięcy do czasu dalszej analizy. - Zamocuj blok tkankowy na uchwycie kriotomu, używając związku OCT.
- Wykonaj seryjne mrożone skrawki serca o grubości 50 µm i zbierać co 10th sekcja; zazwyczaj uzyskuje się około 8 przekrojów tkanki z jednego serca.
- Ułóż wszystkie 8 skrawków na jednym szkiełku przedmiotowym i wysusz je za pomocą suszarki do włosów przez 2–3 min.
- Zanurzyć skrawki w komorze barwiącej zawierającej roztwór Zamboni (utrwalacz zawierający 2% paraformaldehydu i 0,4% kwasu pikrynowego, w/v) na noc w temperaturze 4 °C.
OSTRZEŻENIE: Utrwalacz Zamboniego może wywołać reakcję alergiczną skóry i jest podejrzewany o wywoływanie wad genetycznych oraz działanie rakotwórcze. Odpady i pozostałości należy utylizować zgodnie z przepisami lokalnych organów nadzorczych. - Przemyj plastry trzykrotnie w PBS, a następnie pokryj preparaty medium montażowym.
UWAGA: Próbkę serca barwioną TTC można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy. - Należy wykonać obrazy serca przy użyciu mikroskopu świetlnego z obiektywem 1,25x, korzystając z oprogramowania CellSens.
- W celu ilościowego określenia wielkości obszaru zawału, należy zaimportować pliki obrazów do programu ImageJ.
- Z menu programu ImageJ wybierz Obraz -> Dostosuj -> Próg koloru aby otworzyć okno Color Threshold (Rysunek 2B).
- Wybierz niewielki obszar zainteresowania (ROI) w obrębie przekroju serca, wykorzystując ciemnoczerwony, żywy mięsień sercowy oraz beżową tkankę zawałową/martwiczą jako referencje kolorystyczne.
- Kliknij w Próbka w Próg koloru wyreguluj i dostrój zakres nasycenia, aż wybrany obszar będzie precyzyjnie odpowiadał docelowemu obszarowi koloru.
- Kliknij w Wybór aby wyznaczyć obszar odpowiadający wybranemu kolorowi.
- Z menu programu ImageJ wybierz Analizuj -> PomiarPowierzchnia wybranego obszaru, wyrażona w pikselach, zostanie wyświetlona w oknie Wyniki.
- Wyeksportuj dane pomiarowe do arkusza programu Excel w celu obliczenia planimetrycznej wielkości obszaru zawału.
- Aby określić ilość żywego mięśnia sercowego w obszarze zawału, należy wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI), przede wszystkim na objętej zawałem przedniej ścianie komory, w której wstrzyknięto IL-6.
- Otwórz Menedżer ROI z menu programu ImageJ i kliknij na Dodaj aby zapisać wybrany obszar zainteresowania (ROI) na liście ROI (Rycina 2C).
- Użyj funkcji „Sample” i „Selection”, zgodnie z powyższym opisem, aby wyznaczyć obszar żywego mięśnia sercowego (ciemnoczerwony).
- Dodaj wybrany obszar żywy do listy „ROI Manager”, a następnie wybierz ORAZ aby uzyskać obszar nakładania się ROI i żywotnego mięśnia sercowego.
- Zmierz pole powierzchni żywego mięśnia sercowego i oblicz współczynnik przeżywalności kardiomiocytów w obrębie wybranego obszaru zainteresowania (ROI).
UWAGA: Szczegóły metodologiczne dotyczące barwienia TTC oraz ilościowego oznaczania wielkości zawału zostały opisane we wcześniejszych publikacjach11.
Wyniki
W platformie ex vivo MI oceniono dwa protokoły niedokrwienia w izolowanym sercu myszy. Niedokrwienie globalne, szeroko stosowane w badaniach ex vivo MI, doprowadziło do heterogenicznego uszkodzenia niedokrwiennego w całym sercu. Wykorzystując niezawodną i wysokorozdzielczą mikroskopową metodę detekcji opartą na TTC12, wykazano, że mięsień sercowy przedsionków oraz obszar koniuszkowy były stosunkowo odporne na niedokrwienie i pozostały żywe po 45 min globalnego niedokrwienia z brakiem przepływu (Rycina 2A, górny panel). Z kolei regionalne MI wywołało miejscowe uszkodzenie niedokrwienne w mięśniu sercowym dystalnie względem miejsca podwiązania LAD. W tych warunkach fragmenty podepikardialnego mięśnia sercowego pozostały TTC-dodatnie, co wskazuje na zachowanie żywej tkanki (Rycina 2A, dolny panel). Wyniki te ujawniają odmienne wzorce przeżywalności mięśnia sercowego pomiędzy dwoma protokołami niedokrwienia.
Dalsze badania przeprowadzono na izolowanym sercu myszy, aby określić minimalny czas trwania niedokrwienia i reperfuzji niezbędny do wiarygodnego i powtarzalnego wywołania zawału mięśnia sercowego. Uszkodzenie mięśnia sercowego narastało progresywnie wraz z wydłużeniem czasu niedokrwienia z 30 min do 120 min (Rycyna 3A). Warto zauważyć, że wielkość zawału ponad dwukrotnie zwiększyła się pomiędzy 30 min (n = 3) a 45 min (n = 5) niedokrwienia i zdawała się osiągnąć plateau przy wydłużeniu czasu niedokrwienia do 60 min (n = 5), 90 min (n = 4) i 120 min (n = 3) (Rycyna 3B). Wyniki te wskazują, że żywotność mięśnia sercowego jest bardzo wrażliwa na czas trwania niedokrwienia przekraczający 30 min. W porównaniu z modelem zawału in vivo (ivMI, n = 5), model zawału ex vivo (evMI, n = 8) wykazał niemal identyczną wielkość zawału przy porównywalnym czasie niedokrwienia i reperfuzji (36,88% ± 3,91% vs. 37,8% ± 2,17%, p = 0,27), co sugeruje, że uszkodzenie mięśnia sercowego nie było w znacznym stopniu uwarunkowane perfuzją krystaloidową. Niemniej jednak, serca w modelu evMI wykazywały grubsze ściany komór i zmniejszone światło komór, co prawdopodobnie wynikało z obrzęku mięśnia sercowego związanego z perfuzją krystaloidową (Rycyna 3C).
Wykorzystując względnie kontrolowane środowisko, wolne od wpływów pozasercowych, oceniono kardioprotekcyjne efekty wewnątrzmięśniowego podania IL-6. W sercach kontrolnych traktowanych PBS, w obrębie obszaru zawałowego/nekrotycznego (beżowy) pozostały wykrywalne rozproszone, lecz mierzalne żywe kardiomiocyty (żywe CM; ciemnoczerwone), nawet po 45 min niedokrwienia (Rysunek 4; 1.05% ± 0,44%, SEM, n = 4). Co istotne, podanie IL-6 do mięśnia sercowego (i.m.; strzałki) znacząco zwiększyło liczbę żywych kardiomiocytów (CM), które lokalizowały się głównie wokół miejsca wstrzyknięcia w obrębie obszaru zainteresowania (ROI; 4,08% ± 0,99%, SEM, n = 6; p = 0,005, test t Studenta test t-Studenta). Wyniki te sugerują, że IL-6 może zwiększać przeżywalność kardiomiocytów po urazie niedokrwiennym.
Wreszcie, obecny model MI ex vivo posiada kilka potencjalnych pułapek, które mogą wpływać na powtarzalność wyników eksperymentalnych. Jak pokazano na Rysunku 5, zsunięcie się podwiązki może prowadzić do niewystarczającego zamknięcia LAD i rozległego przeżycia mięśnia sercowego (4/168), a jednocześnie może dojść do niepełnej reperfuzji w przypadku uszkodzenia odgałęzień LAD (12/168). Ponadto embolizacja powietrzna podczas kaniulacji aorty może również spowodować uszkodzenie mięśnia sercowego (strzałki, 7/168), co utrudnia odróżnienie uszkodzenia niedokrwiennego od embolicznego w celu przeprowadzenia kwantyfikacji. Na koniec, niewystarczające barwienie TTC może wystąpić przy nadmiernej perfuzji serca (11/168), co znacznie utrudnia wyznaczenie obszaru zawału.
Rycina 1Schemat układu eksperymentalnego. Nierecyrkulacyjny, grawitacyjny system Langendorffa o stałym ciśnieniu został zaprojektowany w celu dostarczania wzbogaconego w składniki odżywcze, natlenionego buforu Krebsa-Henseleita (KHB) przy stałym ciśnieniu hydrostatycznym wynoszącym 110 cmH2O.₂KHB 0,1 M zostało uprzednio ogrzane do 37 °C do zbiornika i podawane do kolumny ciśnieniowej z płaszczem wodnym, w której utrzymywane jest stałe ciśnienie hydrostatyczne wynoszące 110 cmH2O2utrzymywano O poprzez regulator ciśnienia. Perfundowane serce umieszczono w kąpieli organowej z płaszczem wodnym o regulowanej wysokości, aby utrzymać stałą temperaturę wynoszącą 37 °C przez cały okres eksperymentalny (A). Zawał mięśnia sercowego wywołano poprzez przejściowe podwiązanie lewej przedniej tętnicy wieńcowej (LAD) po zatrzymaniu krążenia za pomocą kardioplegii na wkładce bawełnianej w schłodzonej uprzednio metalowej kacecie (B). Procedurę wykonano pod stereomikroskopem. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Regionalny kontra globalny zawał mięśnia sercowego (MI) i wyznaczanie wielkości obszaru zawału. Globalny MI wywołuje uszkodzenie niedokrwienne w całym sercu, co wskazuje żółte barwienie na mikroskopowych obrazach TTC. Mięsieńt kardiowy przedsionków oraz region koniuszkowy wydawały się bardziej odporne na niedokrwienie i pozostały żywotne po 45 min globalnego niedokrwienia z brakiem przepływu (górny panel w A). Regionalny MI wywołuje uszkodzenie niedokrwienne w mięśniu sercowym dystalnie względem miejsca podwiązania LAD. W tym przypadku fragmenty podepikardialnego mięśnia sercowego są zabarwione na czerwono, co sugeruje zachowanie żywotnej tkanki (dolny panel w A). Wielkość zawału określono za pomocą programu ImageJ, wyznaczając obszar zawałowy/nekrotyczny oraz żywotny mięsień sercowy na podstawie odmiennych kolorów barwienia (B). Przeżywalność kardiomiocytów w obrębie obszaru zainteresowania (ROI) obliczono, wyznaczając procent ciemnoczerwonego barwienia w wybranym ROI (C). Paski skali: 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3Wpływ długości niedokrwienia na wielkość obszaru zawału. Uszkodzenie mięśnia sercowego postępowało wraz z wydłużaniem czasu niedokrwienia z 30 min do 120 min (A). Rozmiar obszaru zawału ponad dwukrotnie zwiększył się pomiędzy 30 min (n = 3) a 45 min (n = 5) niedokrwienia i zdawał się osiągać plateau wraz z wydłużeniem czasu niedokrwienia do 60 min (n = 5), 90 min (n = 4) i 120 min (n = 3) (B). W porównaniu z in vivo model MI (ivMI, n = 5), the ex vivo MI (evMI, n = 8) wygenerowało niemal identyczne wielkości obszarów zawału przy porównywalnym czasie niedokrwienia (36,88% ± 3.91% kontra. 37.8% ± 2.17%, p = 0,27, test t Studenta t-Test). Serca evMI charakteryzowały się grubszą ścianą komór oraz zmniejszonym światłem komory, co prawdopodobnie wynikało z obrzęku mięśnia sercowego związanego z perfuzją krystaloidami (C). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe średniej (SDM). Skala: 1 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: IL-6 zwiększyła przeżywalność kardiomiocytów po urazie niedokrwiennym. Wewnątrzmiokardowe (i.m.) podanie IL-6 w modelu evMI doprowadziło do uzyskania mierzalnej liczby żywych kardiomiocytów (żywe CM; ciemnoczerwone) w obrębie obszaru zawałowego/nekrotycznego (beżowy), zlokalizowanych głównie wokół miejsca wstrzyknięcia IL-6 (strzałki, panel lewy). Ilościowe oznaczenie żywych CM w obszarze zainteresowania (ROI, zaznaczonym liniami przerywanymi) wykazało, że wstrzyknięcie PBS skutkowało obecnością jedynie niewielkiej frakcji żywego mięśnia sercowego (1,05% ± 0,44%, SEM, n = 4), natomiast wstrzyknięcie IL-6 znacząco zwiększyło liczbę żywych CM w obrębie ROI (4,08% ± 0,99%, SEM, n = 6; p = 0,005, test t Studenta). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe średniej (SDM). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Niezadowalające lub nieudane wyniki spowodowane błędami technicznymi. Jak pokazano na reprezentatywnym przykładzie uszkodzenia mięśnia sercowego w modelu MI ex vivo (po lewej), w typowym barwieniu TTC można zazwyczaj wyraźnie rozróżnić żywe i martwicze mięsień sercowe. Jednakże kilka błędów technicznych może prowadzić do niezadowalających lub niemożliwych do zinterpretowania wyników. Niewłaściwe podwiązanie LAD spowodowane ześlizgnięciem się szwu może skutkować rozległym przeżyciem mięśnia sercowego mimo przedłużonego niedokrwienia. Niepełna reperfuzja może wystąpić, gdy gałęzie LAD zostaną uszkodzone podczas podwiązania i w konsekwencji staną się słabo ukrwione, co tworzy obraz przypominający zjawisko „no-reflow” obserwowane klinicznie. Takie obszary mogą wykazywać różową kolorację (strzałki). Zatorowość mikro naczyniowa spowodowana pęcherzykami powietrza dostającymi się do krążenia wieńcowego podczas procedury kaniulacji może również powodować uszkodzenie mięśnia sercowego (strzałki), co utrudnia odróżnienie uszkodzenia niedokrwiennego od zatorowego w celu ilościowej oceny. Wreszcie, niewłaściwe barwienie TTC może wystąpić, gdy serce zostanie nadmiernie przepłukane, co może spowodować uszkodzenie mięśnia sercowego niezależnie od niedokrwienia. Paski skali: 1 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| F-szczytowe (n = 19) | F-stabilne (n = 19) | RF-szczytowe (n = 19) | RF-stabilne (n = 19) | |
| Średnie (mL/min) | 2,54 | 0,78 | 2 | 0,99 |
| SD | 0,59 | 0,29 | 0,56 | 0,53 |
Tabela 1: Przepływ wieńcowy na poziomach maksymalnym (F-peak) i stacjonarnym (F-steady) podczas niedokrwienia i reperfuzji (RF-peak i RF-steady).
Dyskusja
Obecny model MI ex vivo opiera się głównie na zaawansowanych systemach perfuzji serca metodą Langendorffa2. Powszechnym błędem podczas przygotowania jest wprowadzenie pęcherzyków powietrza do krążenia wieńcowego, co może spowodować uszkodzenie zatorowe i zakłócić ocenę uszkodzenia niedokrwiennego. Aby zapobiec temu problemowi, niezbędna jest dokładna inspekcja systemu perfuzji bezpośrednio przed każdym eksperymentem. Jeśli wewnątrz układu rurek uwięzną małe pęcherzyki powietrza, pomocne w rozwiązaniu problemu może być płukanie wsteczne za pomocą KHB w celu wypchnięcia pęcherzyków z powrotem do kolumny ciśnieniowej.
Kluczowym krokiem w tym protokole jest ligacja tętnicy wieńcowej LAD. W związku z tym w pierwszej kolejności krytyczna jest dokładna identyfikacja wizualna LAD. W większości przypadków naczynia wieńcowe stają się półprzezroczyste po wypłukaniu serca lodowatym PBS, co sprawia, że LAD jest wyraźnie odróżnialna od otaczającego mięśnia sercowego. Ponadto równie ważna jest właściwa i biegła technika ligacji, ponieważ nadmierne napięcie nici polipropylenowej 8-0 może doprowadzić do przecięcia LAD, co uniemożliwi późniejszą reperfuzję. Aby zminimalizować to ryzyko, pomiędzy szwem a naczyniem należy umieścić miękki pledget o odpowiedniej wielkości, aby rozłożyć siłę ligacji i chronić tętnicę wieńcową przed uszkodzeniem mechanicznym. Niemniej jednak niewielkie uszkodzenia mięśnia sercowego wywołane ligacją są nieuniknione, ale zazwyczaj nie upośledzają perfuzji wieńcowej ani nie wpływają na wynik eksperymentu. Wreszcie, ponieważ uszkodzenie mięśnia sercowego jest bardzo wrażliwe na temperaturę13, krytyczne znaczenie ma utrzymanie stałej temperatury przez cały czas trwania eksperymentu. Szczególnie w warunkach perfuzji ze stałym ciśnieniem może dochodzić do utraty ciepła między kolumną perfuzyjną a sercem, co zmienia się dynamicznie w zależności od szybkości przepływu wieńcowego14. Tym samym fluktuacje mogą potencjalnie prowadzić do zmian temperatury mięśnia sercowego. W takich warunkach bardzo pożądane jest zastosowanie kąpieli organowej z płaszczem wodnym w celu utrzymania stabilnych warunków termicznych (Rysunek 1A).
Po pokonaniu tych wyzwań technicznych model MI ex vivo stanowi niezawodną i powtarzalną platformę do indukowania uszkodzenia mięśnia sercowego w izolowanym sercu myszy (Rycina 3A). Stanowi on zatem cenny system eksperymentalny do badania przeżywalności mięśnia sercowego po MI, oceny lokalnie dostarczanych interwencji terapeutycznych oraz wykonywania obrazowania o wysokiej rozdzielczości bez zakłóceń wynikających z ruchów oddechowych lub pracy serca. Chociaż protokół globalnego MI jest technicznie prosty i był szeroko stosowany w poprzednich badaniach4, jego głównym ograniczeniem jest fakt, że czas trwania globalnego niedokrwienia jest zazwyczaj ograniczony do mniej niż 45 min3. W konsekwencji, w przeciwieństwie do regionalnego modelu MI, rzadko prowadzi on do powstania zawału transmuralnego (Rycina 2).
Jedną z unikalnych cech modelu MI ex vivo jest brak wpływów systemowych, w tym regulacji neuronalnej i krążących składników krwi, co pozwala badaczom ocenić bezpośrednie miejscowe efekty interwencji terapeutycznych w mięśniu sercowym8. Jest to szczególnie istotne w przypadku cytokin, takich jak IL-6, oraz downstreamowego szlaku sygnalizacyjnego PI3K/AKT, które wykazują działanie kardioprotekcyjne w izolowanych kardiomiocytach15. Jednakże in vivo efekty kardiologiczne IL-6 są często niespójne lub nawet sprzeczne, ponieważ IL-6 jednocześnie aktywuje komórki odpornościowe i promuje odpowiedzi zapalne, które mogą znosić jej bezpośrednie działanie kardioprotekcyjne16. Zgodnie z tą koncepcją, nasz model ex vivo przekonująco wykazał, że miejscowe podanie domięśniowe IL-6 znacznie zachowało żywotność mięśnia sercowego po urazie niedokrwiennym17,18, co potwierdza bezpośredni efekt kardioprotekcyjny IL-6 na kardiomiocyty (Rysunek 4).
Przyznajemy, że obecny model MI ex vivo posiada kilka ograniczeń. W zastosowanym układzie, w ramach niniejszego protokołu3, nie oceniano funkcji skurczowej serca. Wynikało to z faktu, że głównym celem była charakterystyka przeżywalności mięśnia sercowego w regionalnym modelu MI oraz z tego, że dysfunkcja skurczowa odzwierciedla upośledzenie funkcjonalne po urazie niedokrwiennym, ale niekoniecznie wskazuje na śmierć kardiomiocytów8. Co więcej, model MI ex vivo z natury wyklucza krążące składniki krwi, komórki odpornościowe oraz wpływy neurohumoralne, które mogą znacząco przyczyniać się do progresji MI i przebudowy serca in vivo. Chociaż to ograniczenie złożoności systemowej jest główną zaletą modelu MI ex vivo, ogranicza ono również jego szerokie zastosowanie w naśladowaniu odpowiedzi zapalnych, naczyniowych, neuronalnych i endokrynnych, które mogą wystąpić in vivo. Wreszcie stwierdzono, że perfuzja krystaloidami wiąże się z obrzękiem mięśnia sercowego, o czym świadczy zwiększona grubość ścianek komór oraz zmniejszona szerokość światła komór w porównaniu z sercami po MI in vivo. Powszechne występowanie obrzęku może zmieniać architekturę mięśnia sercowego, dyfuzję tkankową, a potencjalnie również żywotność komórkową. Dlatego też obecny model należy traktować jako kontrolowaną platformę do badania uszkodzeń mięśnia sercowego i mechanizmów specyficznych dla kardiomiocytów.
Niemniej jednak opisany tutaj model MI ex vivo stanowi prostą i kosztowo efektywną platformę do oceny przeżywalności mięśnia sercowego przy braku zewnętrznych wpływów regulacyjnych. Biorąc pod uwagę rosnące wykorzystanie genetycznie modyfikowanych modeli mysich, podejście to może być szczególnie wartościowe w badaniu mechanizmów kardioprotekcyjnych z wykorzystaniem zaawansowanego obrazowania, rejestracji elektrofizjologicznej oraz analiz molekularnych. Ponadto model ten mógłby zostać dostosowany do systematycznego testowania lokalnych interwencji farmakologicznych lub genowych oraz do analizy mechanizmów specyficznych dla kardiomiocytów bez systemowych czynników zakłócających. Tym samym model MI ex vivo stanowi komplementarną platformę eksperymentalną, ułatwiającą identyfikację i badanie mechanistyczne szlaków kardioprotekcyjnych.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie występuje u nich konflikt interesów. Autorzy oświadczają, że w procesie przygotowania tekstu, analizy danych, generowania rycin ani walidacji niniejszej pracy nie wykorzystano narzędzi sztucznej inteligencji (AI) ani technologii wspomaganych przez generatywną AI.
Podziękowania
Niniejsza praca była finansowana przez General Project of Jiangsu Geriatrics Society (JGS2026MS019 dla WO), Social Development Foundation of the Science and Technology Department of Zhenjiang City (granty nr SH2023023 dla H.Z. oraz SH2023057 dla X.L.), program FoKo (grant nr 23/2013 dla ZD) oraz Cardiovascular Research Institute Düsseldorf (CARID).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| chlorek 2,3,5-trifenylo-2,3,5-tetrazoliu | Millipore | 1.08380.0100 | Odczynniki chemiczne |
| Kaniula aortalna | BD | 305895 (20 g) | Retroperfuzja |
| Aquamount | BDH | 362262H | Kriosekcja |
| Waga | Ohaus | - | Odważanie odczynników chemicznych |
| Duże kleszczyki | AESCULAP | - | Instrumenty chirurgiczne |
| Analizatory gazometrii krwi | Radiometr | ABL90 FLEX PLUS | Analizator gazów |
| Dwuwodny chlorek wapnia | Fluka | 21097 | Odczynniki chemiczne |
| Carbogen | Linde | 4040152 | aparat Langendorffa |
| CellSens | Olympus | Wersja 3.1.1 | Oprogramowanie do obrazowania |
| Płatki kosmetyczne | BEESana | PZN-1330900 | Instrumenty chirurgiczne |
| Szkiełka nakrywkowe | Epredia | BB02400500A113MN20 | Kriosekcja |
| Kriotomograf | Leica | M850 | Kriosekcja |
| D(+)-glukoza bezwodna | Merck | 8337.1000 | Odczynniki chemiczne |
| Woda dwukrotnie destylowana | Millipore | - | Rozpuszczanie substancji chemicznych |
| Etanol (100%) | Merck | 64-17-5 | Czyszczenie drenów |
| Etanol (70%) | VWR | UN1170 | Czyszczenie przewodów |
| Membrana filtrująca (0.2 µm) | Thermo Scientific | 8-000-230511 | aparat Langendorffa |
| Przepływomierz | Transoniczny | T4S410 | Aparat Langendorffa |
| Szkiełka przedmiotowe | Engelbrecht | 11102 | Kriosekcja |
| Szklana kolumna wodna | Własnej roboty | - | Aparat Langendorffa |
| Kwas solny | Roth | P074.1 | Odczynniki chemiczne |
| ImageJ | NIH | wersja 1,54 g | Oprogramowanie |
| Interleukina 6 | BioLegend | 570804 | Odczynniki chemiczne |
| Izofluran | Piramal | 14150097146754 | Odczynniki chemiczne |
| Mikroskop świetlny | Olympus | BX61 | Obrazowanie |
| Siarczan magnezu siedmiowodny | Merck | 5886.1000 | Odczynniki chemiczne |
| Medyczna sonda przepływowa | Transoniczny | 3PXN | Aparat Langendorffa |
| Metalowa szalka | Domowej roboty | - | Instrumenty chirurgiczne |
| strzykawka Micro-Fine | BD | 30G / 0,3 ml | Aparat Langendorffa |
| Mysz | Styczeń | C57BL/6J | Zwierzęta |
| Obiektyw (x 1,25) | Olympus | PlanApo 1.25X/0.04 | Obrazowanie |
| związek OCT | Sakura | 4583 | Odczynniki chemiczne |
| szalka Petriego | Thermo Scientific | 172931 | Aparat Langendorffa |
| bufor fosforanowo-solny | Roth | 9143.1 | Odczynniki chemiczne |
| Chlorek potasu | Merck | 4936.1000 | Odczynniki chemiczne |
| Wodorofosforan potasu | Merck | 4873.1000 | Odczynniki chemiczne |
| Szew jedwabny | F.S.T | 18020-60 | Instrumenty chirurgiczne |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | SZBD0810V | Odczynniki chemiczne |
| Wodorowęglan sodu | Roth | 6885.2 | Odczynniki chemiczne |
| Pirowinian sodu | SigmaAldrich | 113-24-6 | Odczynniki chemiczne |
| Miękki pledżet | Deknatel | L-705 | Instrumenty chirurgiczne |
| Kleszczyki ze stali nierdzewnej (8 mm) | F.S.T | 11052-10 | Instrumenty chirurgiczne |
| Nożyczki ze stali nierdzewnej | AESCULAP | BC702R | Instrumenty chirurgiczne |
| Nożyczki nierdzewne | AESCULAP | BC257R | Instrumenty chirurgiczne |
| Stereomikroskop | Leica | MZ6 | Instrumenty chirurgiczne |
| Szew (8-0) | Ethicon | TG-108 | Instrumenty chirurgiczne |
| Strzykawka (3 ml) | B. Braun | 4617100V | Retroperfuzja |
| Kurek trójdrożny | B. Braun | 16494C | Retroperfuzja |
| Przewody | Tygon | T3304-23 | Aparat Langendorffa |
| Kąpiel wodna | HAAKE | DC1/B3 | Aparat Langendorffa |
| roztwór Zamboniego | Morphisto | 12773.0050 | Odczynniki chemiczne |
Bibliografia
- Pendexter CA, et al. Modified Langendorff perfusion method for extended perfusion times of rodent cardiac grafts. J Vis Exp. 2024;(208):66815.
- Bell RM, Mocanu MM, Yellon DM. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. J Mol Cell Cardiol. 2011;50(6):940-950.
- Rossello X, Hall AR, Bell RM, Yellon DM. Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2016;21(3):286-295.
- Yang T, et al. Isolated perfused hearts for cardiovascular research: an old dog with new tricks. J Cardiovasc Transl Res. 2024;17(5):1207-1217.
- Martin TP, et al. Preclinical models of myocardial infarction: from mechanism to translation. Br J Pharmacol. 2022;179(5):770-791.
- Hurt CM, et al. Transient receptor potential vanilloid 1 regulates mitochondrial membrane potential and myocardial reperfusion injury. J Am Heart Assoc. 2016;5(9):3774.
- Herr DJ, Aune SE, Menick DR. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. J Vis Exp. 2015;(101):52908.
- Lindsey ML, et al. Guidelines for experimental models of myocardial ischemia and infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2018;314(4):H812-H838.
- Zhu H, et al. Sfrp1 as a pivotal paracrine factor in the trained pericardial stem cells that foster reparative activity. Stem Cells Transl Med. 2023;12(12):137-150.
- Ouyang W, et al. An immunostaining-based approach for assessing myocardial viability in the infarcted mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2025;12:1598314.
- Ding Z, Zhang H, Bouvain P, Ding Z, Flögel U. A microscopic 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride assay for accurate and reliable analysis of myocardial injury. J Vis Exp. 2025;(225):68596.
- Ding Z, et al. A refined TTC assay precisely detects cardiac injury and cellular viability in the infarcted mouse heart. Sci Rep. 2024;14(1):25214.
- El Farissi M, et al. Hypothermia for reduction of myocardial reperfusion injury in acute myocardial infarction: closing the translational gap. Circ Cardiovasc Interv. 2021;14(8):010326.
- Ding Z, Gödecke A, Schrader J. Contribution of cytochrome P450 metabolites to bradykinin-induced vasodilation in endothelial NO synthase deficient mouse hearts. Br J Pharmacol. 2002;135(3):631-638.
- Smart N, et al. IL-6 induces PI 3-kinase and nitric oxide-dependent protection and preserves mitochondrial function in cardiomyocytes. Cardiovasc Res. 2006;69(1):164-177.
- Broch K, et al. Randomized trial of interleukin-6 receptor inhibition in patients with acute ST-segment elevation myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2021;77(15):1845-1855.
- Fontes JA, Rose NR, Čiháková D. The varying faces of IL-6: from cardiac protection to cardiac failure. Cytokine. 2015;74(1):62-68.
- Preda A, et al. IL-6 in the spotlight: from cardiovascular pathophysiology to therapy. Eur J Clin Invest. 2026;56(1):e70161.
Przedruki i uprawnienia
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny