Zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ krwiotwórczy podczas rozwoju. Stwierdziliśmy, że macierzyste komórki krwiotwórcze (HSCs) są zarówno generowane, jak i powielane w łożysku w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych. W niniejszej pracy opisujemy techniki eksperymentalne niezbędne do izolacji i wizualizacji HSCs w łożysku myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSCs) posiadają zdolność do samoodnawiania oraz generowania wszystkich typów komórek linii krwi w ciągu całego życia organizmu. Wszystkie HSCs powstają podczas rozwoju embrionalnego, po czym wielkość ich puli jest utrzymywana dzięki podziałom komórkowym prowadzącym do samoodnawiania. Identyfikacja anatomicznego pochodzenia HSCs oraz kluczowych zdarzeń rozwojowych regulujących proces ich powstawania była utrudniona, ponieważ w fetalnej hematopoezie uczestniczy wiele miejsc anatomicznych. Niedawno zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ hematopoetyczny, w którym HSCs są generowane i powielane w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). W konsekwencji łożysko stanowi istotne źródło HSCs podczas ich powstawania i wstępnej ekspansji.
W niniejszym artykule przedstawiamy techniki sekcji służące do izolacji łożyska mysiego z embrionów w dniach E10.5 i E12.5, co odpowiada odpowiednio etapom rozwojowym inicjacji HSC oraz szczytowej liczebności puli HSC w łożysku. Ponadto prezentujemy zoptymalizowany protokół enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji tkanki łożyskowej do zawiesiny pojedynczych komórek, przeznaczonej do zastosowania w cytometrii przepływowej lub testach funkcjonalnych. Stwierdziliśmy, że zastosowanie kolagenazy do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek łożyska zapewnia wystarczającą wydajność pozyskiwania HSC. Ważnym czynnikiem wpływającym na wydajność HSC z łożyska jest stopień mechanicznej dysocjacji poprzedzającej obróbkę enzymatyczną oraz czas trwania tej ostatniej.
Zapewniamy również protokół przygotowania utrwalonych i zamrożonych skrawków tkanki łożyskowej w celu wizualizacji rozwijających się HSC za pomocą immunohistochemii w ich precyzyjnych niszach komórkowych. Ponieważ antygeny specyficzne dla hematopoezy nie są zachowywane podczas przygotowania skrawków zatopionych w parafinie, rutynowo stosujemy skrawki utrwalone i zamrożone do lokalizacji łożyskowych HSC i progenitorów.
Protokół
1. Wyjęcie zarodka i sekcja łożyska
- Na początek należy wyizolować zarodki z organizmów ciężarnych samic.
- Zwierzęta są uśmiercane zgodnie z zatwierdzonymi procedurami – w naszym przypadku zastosujemy dawkę śmiertelną środka znieczulającego, izofluranu.
- Najpierw spryskaj brzuch etanolem i wykonaj niewielkie nacięcie nożyczkami.
- Rozsuń skórę obiema rękami, aby odsłonić jamę brzuszną, a następnie rozetnij otrzewną.
- Za pomocą pęsety chwyć rogi macicy i pobierz je, odcinając nożyczkami na każdym z końców dystalnych. Umieść rogi macicy w szalce Petriego wypełnionej PBS i postaw na lodzie. Pamiętaj również o kilkukrotnym przemyciu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Procedury eksperymentalne opisane w niniejszym protokole pozwolą na izolację i wizualizację tkanki łożyska oraz hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych. W celu uzyskania szczegółowego podsumowania dotyczącego oczekiwanej wydajności komórkowej i liczby HSC w łożysku oraz innych płodowych organach hematopoetycznych w trakcie rozwoju płodu, odsyłamy do pracy Gekas, et al. 2005. W kwestii lokalizacji rozwijających się HSC oraz innych komórek hematopoetycznych w łożysku odsyłamy do pracy Rhodes, et al. 2008.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100 mM glukozy | |||
| 10 mM NaN3 | |||
| probówki stożkowe 15 ml (BD) | |||
| igły 16-G, 18-G, 20-G, 22-G i 25-G (BD) | |||
| 30% roztwór sacharozy | |||
| szalki Petri 35 mm (BD) | |||
| 4% Paraformaldehyd | |||
| filtry komórkowe 50 μm (Celltrics) | |||
| strzykawki 5 ml (BD) | |||
| Zestaw substratu do fosfatazy alkalicznej I (Vector Red, Vector) | |||
| Zestaw substratu fosfatazy alkalicznej III (Vector Blue, Vector) | |||
| Roztwór antybiotyku (penicylina/streptomycyna, P/S) | |||
| Kolagenaza typu I (Sigma) | |||
| Jednorazowe winylowe formy do tkanek Cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm, Tissue-Tek) | |||
| przeciwciało pierwotne przeciwko cytokeratynie (DakoCytomation) | |||
| Pinceta anatomiczna, stal nierdzewna lub tytan, numer 5 lub 55 | |||
| Drierite | |||
| płodowa surowica bydlęca (FBS) | |||
| Plastikowy pojemnik do transportu szkiełek mikroskopowych Fisherbrand (Fisher) | |||
| Oksydaza glukozowa 1000 j/ml | |||
| Lewamizol (Wektor) | |||
| Media montażowe, wodne medium montażowe (VectamountTM AQ) | |||
| Normalna surowica konia (Vector) | |||
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek) | |||
| Zestaw substratu peroksydazy DAB (Vector) | |||
| Bufor fosforanowy (PBS) z dodatkiem wapnia i magnezu (z Ca2+/Mg2+) | |||
| bufor fosforanowy (PBS) bez jonów wapnia i magnezu (bez $\text{Ca}^{2+}/\text{Mg}^{2+}$) | |||
| Plastikowe pudełko na preparaty (mieści 100 szkiełek) | |||
| Przewód plastikowy (Nalgene 180 PVC nietoksyczny autoklawowalny) | |||
| Probiówka z polipropylenu o okrągłym dnie, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) | |||
| Roztwór proteinazy K 20 mg/ml (Amresco) | |||
| Markery do szkiełek Research Products International Corp Super Pap Pen HT* (2,5 mm, Fisher) | |||
| Płytki 96- lub 24-dołkowe z dnem w kształcie litery U (okrągłe), przystosowane do hodowli tkankowej (BD Falcon) | |||
| Tween20, SigmaUltra (Sigma) | |||
| Zestaw do amplifikacji tyramidowej (Invitrogen) | |||
| Standardowy zestaw Vectastain ABC do oznaczania fosfatazy alkalicznej (Vector) | |||
| Zestaw Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector) |
Bibliografia
- Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. The placenta is a niche for hematopoietic stem cells. Dev Cell. 8, 365-375 (2005).
- Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
