Izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska

Podsumowanie

Zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ krwiotwórczy podczas rozwoju. Stwierdziliśmy, że macierzyste komórki krwiotwórcze (HSCs) są zarówno generowane, jak i powielane w łożysku w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych. W niniejszej pracy opisujemy techniki eksperymentalne niezbędne do izolacji i wizualizacji HSCs w łożysku myszy.

Streszczenie

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSCs) posiadają zdolność do samoodnawiania oraz generowania wszystkich typów komórek linii krwi w ciągu całego życia organizmu. Wszystkie HSCs powstają podczas rozwoju embrionalnego, po czym wielkość ich puli jest utrzymywana dzięki podziałom komórkowym prowadzącym do samoodnawiania. Identyfikacja anatomicznego pochodzenia HSCs oraz kluczowych zdarzeń rozwojowych regulujących proces ich powstawania była utrudniona, ponieważ w fetalnej hematopoezie uczestniczy wiele miejsc anatomicznych. Niedawno zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ hematopoetyczny, w którym HSCs są generowane i powielane w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). W konsekwencji łożysko stanowi istotne źródło HSCs podczas ich powstawania i wstępnej ekspansji.

W niniejszym artykule przedstawiamy techniki sekcji służące do izolacji łożyska mysiego z embrionów w dniach E10.5 i E12.5, co odpowiada odpowiednio etapom rozwojowym inicjacji HSC oraz szczytowej liczebności puli HSC w łożysku. Ponadto prezentujemy zoptymalizowany protokół enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji tkanki łożyskowej do zawiesiny pojedynczych komórek, przeznaczonej do zastosowania w cytometrii przepływowej lub testach funkcjonalnych. Stwierdziliśmy, że zastosowanie kolagenazy do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek łożyska zapewnia wystarczającą wydajność pozyskiwania HSC. Ważnym czynnikiem wpływającym na wydajność HSC z łożyska jest stopień mechanicznej dysocjacji poprzedzającej obróbkę enzymatyczną oraz czas trwania tej ostatniej.

Zapewniamy również protokół przygotowania utrwalonych i zamrożonych skrawków tkanki łożyskowej w celu wizualizacji rozwijających się HSC za pomocą immunohistochemii w ich precyzyjnych niszach komórkowych. Ponieważ antygeny specyficzne dla hematopoezy nie są zachowywane podczas przygotowania skrawków zatopionych w parafinie, rutynowo stosujemy skrawki utrwalone i zamrożone do lokalizacji łożyskowych HSC i progenitorów.

Protokół

1. Wyjęcie zarodka i sekcja łożyska

1. Na początek należy wyizolować zarodki z organizmów ciężarnych samic.
2. Zwierzęta są uśmiercane zgodnie z zatwierdzonymi procedurami – w naszym przypadku zastosujemy dawkę śmiertelną środka znieczulającego, izofluranu.
3. Najpierw spryskaj brzuch etanolem i wykonaj niewielkie nacięcie nożyczkami.
4. Rozsuń skórę obiema rękami, aby odsłonić jamę brzuszną, a następnie rozetnij otrzewną.
5. Za pomocą pęsety chwyć rogi macicy i pobierz je, odcinając nożyczkami na każdym z końców dystalnych. Umieść rogi macicy w szalce Petriego wypełnionej PBS i postaw na lodzie. Pamiętaj również o kilkukrotnym przemyciu PBS przed izolacją łożyska. Teraz możemy przystąpić do izolacji łożyska.
6. Używając dwóch pęset, zacznij ostrożnie oddzielać tkankę endometrium otaczającą koncepcje zarodkowe. Należy uważać, aby nie przebić i nie uszkodzić strukturalnie zarodków, ponieważ utrudni to kolejne etapy sekcji.
7. Umieść wyizolowane koncepcje w nowej szalce Petriego z PBS na lodzie i kontynuuj proces, aż wszystkie koncepcje zostaną uwolnione z endometrium.
8. Przenieś jedną koncepcję do nowej szalki Petriego z PBS, umieść ją pod mikroskopem i za pomocą dwóch pęset oddziel deciduę od łożyska. Usuń jak największą ilość decidui, ponieważ komórki decidui będą zakłócać przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek i analizę cytometryczną. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, zaleca się płynny, ciągły ruch oddzielania.
9. Odetnij worek żółtkowy od łożyska w miejscu połączenia obu organów, a następnie delikatnie odsuń worek żółtkowy i naczynia witelialne od łożyska. Należy uważać, aby nie uszkodzić płytki chorialnej łożyska, szczególnie w przypadku wczesnych zarodków.
10. Trzymając ostrożnie płytkę chorialną łożyska jedną pęsetą, a pępowinę drugą, pociągnij pępowinę wraz z przymocowanym zarodkiem, oddzielając je od łożyska.
11. Usuń nadmiar tkanki z komórek olbrzymich na krawędziach łożyska, aby zminimalizować zlepianie się komórek podczas przygotowywania zawiesiny pojedynczych komórek.
12. Zabierz łożysko do odpowiedniego pojemnika, np. probówki Falcona o pojemności 15 ml, z PBS+5% FCS i utrzymaj na lodzie. Powtórz tę czynność dla wszystkich wypreparowanych łożysk.
13. Na tym etapie można przejść do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek do cytometrii przepływowej, testów funkcjonalnych, takich jak hodowla in vitro lub transplantacja, lub przygotować całe łożysko do fiksacji tkanek i mrożenia w blokach do późniejszej immunohistochemii.

2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z tkanki łożyska

1. Poniżej przedstawiamy sposób przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek z łożyska do analizy FACS.
2. Aby przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z łożyska, wymagana jest dysocjacja mechaniczna i enzymatyczna. W pierwszej kolejności należy przygotować 0,1% roztwór kolagenazy w PBS z dodatkiem 10% FCS i 1% roztworu penicyliny/streptomycyny.
3. Do tkanek łożyska należy dodać odpowiednią objętość roztworu kolagenazy, zależnie od liczby próbek. Zaleca się objętość dwukrotnie większą niż objętość łożyska, w zakresie od 2-5 ml.
4. Aby mechanicznie rozbić tkankę, należy użyć igły 16-G zamocowanej na strzykawce 5-ml i trzykrotnie przepuścić roztwór kolagenazy wraz z łożyskiem przez igłę. Procedurę należy powtórzyć z użyciem igły 18-G.
5. Próbkę należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂ na 45 minut.
6. Po 45-minutowej inkubacji w kolagenazie, roztwór komórkowy należy przepuścić przez igłę 20-G, a następnie inkubować przez kolejne 45 minut w temperaturze 37°C.
7. Po łącznym czasie inkubacji w kolagenazie wynoszącym 1,5 h, roztwór komórkowy należy przepuścić trzykrotnie przez igłę 22-G, a następnie trzykrotnie przez igłę 25-G.
8. Próbkę należy przefiltrować przez filtr 50-µm zamocowany do nowej probówki Falcon 15-ml, przemyć PBS+5% FCS i odwirować w temperaturze 4°C przez 5 minut przy 300 × g.
9. W tym momencie otrzymano zawiesinę pojedynczych komórek odpowiednią do analizy FACS lub testów funkcjonalnych.

3. Fixacja tkanek do skrawków mrożonych

1. Bezpośrednio po wyizolowaniu łożyska z każdego embrionu, należy umieścić je w zimnym 1X PBS. Zazwyczaj w przypadku młodych łożysk (E8.5-11.5) najlepiej sprawdza się płytka 96-dołkowa, natomiast dla łożysk starszych, od E12.5 wzwyż, wygodniejsza może być płytka 24-dołkowa.
2. Każde łożysko przenosi się do nowego dołka wypełnionego świeżo rozmrożonym 4% paraformaldehydem lub PFA. W przypadku łożysk E12.5 tkankę przenosi się do nowego dołka ręcznie, natomiast dla E10.5 można ostrożnie odessać PBS za pomocą pipety i dodać PFA. Ważne jest, aby łożysko było całkowicie zanurzone przez 2-4 godziny w temperaturze 4°C, w zależności od wieku i wielkości tkanki.
3. Przenieść tkankę do 30% sacharozy, a jeśli tkanki są bardzo małe i delikatne, odessać PFA i dodać sacharozę bezpośrednio. Na tym etapie łożyska będą unosić się w roztworze. Pozostawić tkanki na noc w temperaturze 4°C.
4. Po nocnym etapie w 30% sacharozie tkanki powinny ostatecznie opaść na dno dołka, co świadczy o prawidłowej kriokonserwacji. Odlać połowę roztworu sacharozy i uzupełnić objętość OCT, a następnie ponownie umieścić tkankę w 4°C na 1-2 godziny. Ułatwia to penetrację OCT.
5. Przenieść tkankę do 100% OCT na 1 godzinę, po czym można przystąpić do zatapiania w medium.

4. Zatapianie utrwalonej tkanki

1. Oznakować plastikowe formy odpowiednią identyfikacją tkanki (pokazać przykładową formę).
2. Wyjąć tkankę z roztworu OCT i przekroić łożysko na pół, układając łożysko w kształcie dysku stroną pępowiny do dołu i ostrożnie przecinając je czystą żyletką, przesuwając ostrze w przód i w tył przed zwolnieniem nacisku, aby zapewnić równy przekrój. Łożysko przecina się na pół, aby uzyskać najlepszą orientację do późniejszej wizualizacji łożyskowych HSCs.
3. Umieścić jedną połowę łożyska na dnie formy tak, aby krawędź cięcia stykała się z dolną powierzchnią formy. Powtórzyć czynność w nowej formie dla drugiej połowy. W przypadku łożysk z E10.5 obie połowy można umieścić w jednej formie, stosując tę samą technikę.
4. Podczas wlewania OCT do formy może być trudno utrzymać łożyska w odpowiedniej orientacji. Unieruchomić łożysko, trzymając połowę tkanki pęsetą. Powoli wlewać roztwór OCT do formy, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. W przypadku łożysk z E10.5 trzymać jedną połowę tkanki pęsetą, a drugą połowę tkanki oprzeć o zewnętrzną stronę pęsety. Powoli wlewać roztwór OCT w sposób opisany dla łożysk z E12.5.
5. Po napełnieniu formy OCT szybko umieścić ją na suchym lodzie; OCT zmieni kolor na biały, powodując błyskawiczne zamrożenie tkanki.
6. Umieścić formę w małej plastikowej torebce zawierającej Drierite i niezwłocznie schować do zamrażarki -80°C.

Dyskusja

Procedury eksperymentalne opisane w niniejszym protokole pozwolą na izolację i wizualizację tkanki łożyska oraz hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych. W celu uzyskania szczegółowego podsumowania dotyczącego oczekiwanej wydajności komórkowej i liczby HSC w łożysku oraz innych płodowych organach hematopoetycznych w trakcie rozwoju płodu, odsyłamy do pracy Gekas, et al. 2005. W kwestii lokalizacji rozwijających się HSC oraz innych komórek hematopoetycznych w łożysku odsyłamy do pracy Rhodes, et al. 2008.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100 mM glukozy
10 mM NaN3
probówki stożkowe 15 ml (BD)
igły 16-G, 18-G, 20-G, 22-G i 25-G (BD)
30% roztwór sacharozy
szalki Petri 35 mm (BD)
4% Paraformaldehyd
filtry komórkowe 50 μm (Celltrics)
strzykawki 5 ml (BD)
Zestaw substratu do fosfatazy alkalicznej I (Vector Red, Vector)
Zestaw substratu fosfatazy alkalicznej III (Vector Blue, Vector)
Roztwór antybiotyku (penicylina/streptomycyna, P/S)
Kolagenaza typu I (Sigma)
Jednorazowe winylowe formy do tkanek Cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm, Tissue-Tek)
przeciwciało pierwotne przeciwko cytokeratynie (DakoCytomation)
Pinceta anatomiczna, stal nierdzewna lub tytan, numer 5 lub 55
Drierite
płodowa surowica bydlęca (FBS)
Plastikowy pojemnik do transportu szkiełek mikroskopowych Fisherbrand (Fisher)
Oksydaza glukozowa 1000 j/ml
Lewamizol (Wektor)
Media montażowe, wodne medium montażowe (VectamountTM AQ)
Normalna surowica konia (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Zestaw substratu peroksydazy DAB (Vector)
Bufor fosforanowy (PBS) z dodatkiem wapnia i magnezu (z Ca2+/Mg2+)
bufor fosforanowy (PBS) bez jonów wapnia i magnezu (bez $\text{Ca}^{2+}/\text{Mg}^{2+}$)
Plastikowe pudełko na preparaty (mieści 100 szkiełek)
Przewód plastikowy (Nalgene 180 PVC nietoksyczny autoklawowalny)
Probiówka z polipropylenu o okrągłym dnie, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon)
Roztwór proteinazy K 20 mg/ml (Amresco)
Markery do szkiełek Research Products International Corp Super Pap Pen HT* (2,5 mm, Fisher)
Płytki 96- lub 24-dołkowe z dnem w kształcie litery U (okrągłe), przystosowane do hodowli tkankowej (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Zestaw do amplifikacji tyramidowej (Invitrogen)
Standardowy zestaw Vectastain ABC do oznaczania fosfatazy alkalicznej (Vector)
Zestaw Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)