Protokół izolacji neutrofili

Summary

Neutrofile są jednymi z pierwszych komórek, które docierają do miejsca zapalnej odpowiedzi immunologicznej, a ich funkcje i mechanizmy były intensywnie badane in vitro. Demonstrujemy standardową metodę separacji gradientu gęstości w celu wyizolowania ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu dostępnych na rynku pożywek separacyjnych.

Abstract

Granulocyty wielojądrzaste neutrofilów (PMN) są najliczniejszymi leukocytami u ludzi i jednymi z pierwszych komórek, które docierają do miejsca zapalnej odpowiedzi immunologicznej. Ze względu na ich kluczową rolę w zapaleniu, funkcje neutrofili, takie jak lokomocja, produkcja cytokin, fagocytoza i walka komórek nowotworowych, są szeroko badane. Aby scharakteryzować specyficzne funkcje neutrofili, w badaniach in vitro pożądana jest czysta, szybka i niezawodna metoda oddzielania ich od innych komórek krwi, zwłaszcza że neutrofile są krótkotrwałe i powinny być zużyte w ciągu 2-4 godzin od pobrania. Tutaj demonstrujemy standardową metodę separacji gradientu gęstości w celu wyizolowania ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu dostępnych na rynku pożywek separacyjnych, które są mieszaniną metrizoinianu sodu i dekstranu 500. Procedura polega na nałożeniu warstwy krwi pełnej na podłoże o gradiencie gęstości, odwirowaniu, oddzieleniu warstwy neutrofili i lizie pozostałych erytrocytów. Komórki są następnie przemywane, zliczane i ponownie zawieszane w buforze do pożądanego stężenia. Wykazano, że przy prawidłowym wykonaniu metoda daje próbki >95% neutrofili o żywotności >95%.

Protocol

 Protokół izolacji neutrofili

1. Doprowadź wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej.
2. Zebrać 5,0 ml pożywki do izolacji neutrofili w probówce wirówkowej. Ostrożnie nałożyć 5,0 ml krwi na podłoże separacyjne. Wykonaj ten krok powoli i ostrożnie, trzymając końcówkę pipety blisko powierzchni pożywki, aby uniknąć mieszania się krwi z podłożem.
3. Wirować przy 500 RCF przez 35 minut w temperaturze 20-25°C. Krew powinna rozdzielić się na 6 odrębnych prążków: osocze, monocyty, pożywki izolacyjne, neutrofile, więcej pożywek izolacyjnych i osad krwinek czerwonych (ryc. 1). Jeśli te pasma nie są wyraźne, oznacza to, że proces separacji nie był czysty i będzie musiał zostać powtórzony.
4. Ostrożnie usuń trzy górne warstwy (osocze, monocyty i pożywkę izolacyjną) za pomocą pipety. Pozbądź się tych warstw.
5. Ostrożnie odpipetować warstwę neutrofili i wszystkie pożywki izolacyjne znajdujące się pod neutrofilami. Umieść roztwór w czystej probówce wirówkowej.
6. Rozcieńczyć roztwór neutrofili do 10 ml HBSS bez Ca²+/Mg²+. Odwróć rurkę kilka razy, aby zawiesić komórki.
7. Odwirować roztwór neutrofili o stężeniu 350 RCF przez 10 minut. Na dnie probówki powinna znajdować się czerwona osadka zawierająca neutrofile i resztkowe krwinki czerwone (RBC). Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety, aby nie naruszyć osadu.
8. Aby zlizować resztki krwinek czerwonych, dodaj do probówki 2 ml buforu do lizy krwinek czerwonych. Aby ponownie zawiesić osad, należy przemieszać fiolkę z nastawem 3-4. Unikaj zwiększania ustawienia wiru powyżej 4, ponieważ może to spowodować aktywację neutrofili. Może być konieczne wirowanie przez kilka sekund lub "pulsowanie" wiru w celu rozpuszczenia granulki.
9. Odwirować probówkę o temperaturze 250 RCF przez 5 minut. Usunąć supernatant za pomocą pipety. W razie potrzeby powtórz proces lizy.
10. Do każdej probówki dodać 500 μl HBSS bez Ca²+/Mg²+. Ponownie przekręć wir, aby ponownie zawiesić granulkę w ustawieniu 3-4. Rozcieńczyć do 10 ml HBSS bez Ca²+/Mg²+.
11. Odwirować probówki o temperaturze 250 RCF przez 5 minut. Odessać supernatant i wyrzucić.
12. Zawiesić osad w 250 μl roztworu HBSS/HSA (2% HSA). Komórki można następnie policzyć i dostosować do pożądanego stężenia.

 

Discussion

Metoda separacji w gradionym gradiencie gęstości służy do izolowania ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu mieszaniny metrizoinianu sodu i dekstranu 500. Metoda ta opiera się na metodzie rozdzielania leukocytów jednojądrzastych przez Bojuma (1968), która została zmodyfikowana do separacji neutrofili przez Ferrante i Thonga (1980).

Po pobraniu od dawcy krew pełna może być antykoagulowana EDTA, cytrynianem lub heparyną. Ponieważ są krótkotrwałe, neutrofile należy zużyć w ciągu 2-4 godzin...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynnik Lymphocyte Poly(R)	Reagent	Cedarlane Labs		PolymorphprepTM może być stosowany jako alternatywa
Hank' s Zrównoważony roztwór soli bez odczynnika chlorku wapnia	Odczynnik	Invitrogen
Odczynnik	buforowy do lizy czerwonych krwinek
	Narzędzie
PolymorphprepTM	Odczynnik	Axis-Shield		Alternatywny odczynnik do filtra strzykawkowego z limfocytów i poli(R)
Inne		EMD Millipore	SLGV033RS	Millex-GV, 0,22 μ m, PVDF, 33 mm, Hank' ze sterylizacją promieniową
s Równoważący roztwór soli z odczynnikiem chlorku wapnia		Invitrogen