Artykuł metodologiczny

Protokół izolacji neutrofili

DOI:

10.3791/745

⸱

23 lipca 2008

 ,  , 
1Institute for Medicine and Engineering, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile należą do pierwszych komórek docierających do miejsca zapalnej odpowiedzi immunologicznej, a ich funkcje i mechanizmy zostały szeroko zbadane in vitro. Prezentujemy standardową metodę separacji w gradiencie gęstości w celu wyizolowania ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu komercyjnie dostępnych mediów separacyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Neutrofilowe granulocyty wielojądrzaste (PMN) są najliczniejszą populacją leukocytów u ludzi i należą do pierwszych komórek docierających do miejsca zapalnej odpowiedzi immunologicznej. Ze względu na ich kluczową rolę w zapaleniu, szeroko bada się funkcje neutrofili, takie jak lokomocja, produkcja cytokin, fagocytoza oraz zwalczanie komórek nowotworowych. Aby scharakteryzować specyficzne funkcje neutrofili, w badaniach in vitro pożądana jest czysta, szybka i niezawodna metoda ich oddzielania od pozostałych komórek krwi, szczególnie że neutrofile mają krótki czas przeżycia i powinny zostać wykorzystane w ciągu 2–4 godzin od pobrania. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy standardową metodę rozdziału w gradiencie gęstości w celu izolacji ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu dostępnego komercyjnie medium do rozdziału, które stanowi mieszaninę metrizoanu sodu i Dextranu 500. Procedura polega na nałożeniu krwi pełnej na medium gradientowe, wirowaniu, oddzieleniu frakcji neutrofili oraz lizie pozostałych erytrocytów. Następnie komórki są płukane, liczone i resuspendowane w buforze do pożądanego stężenia. Wykazano, że przy prawidłowym przeprowadzeniu metoda ta pozwala na uzyskanie próbek zawierających >95% neutrofili o żywotności >95%.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

 Protokół izolacji neutrofili

  1. Doprowadzić wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej.
  2. Do probówki do wirowania odmierzyć 5,0 ml medium do izolacji neutrofili. Ostrożnie nanieść 5,0 ml krwi na medium separacyjne. Krok ten należy wykonywać powoli i ostrożnie, prowadząc końcówkę pipety blisko powierzchni medium, aby uniknąć zmieszania krwi z medium.
  3. Wirować przy 500 RCF przez 35 min w temperaturze 20-25°C. Krew powinna rozdzielić się na 6 wyraźnych warstw: plazmę, monocyty, medium do izolacji, neutrofile, kolejną warstwę medium do izolacji oraz osad erytrocytów (Rycina 1). Jeśli warstwy te nie są wyraźne, proces separacji nie przebiegł prawidłowo i należy go powtórzyć.
  4. Ostrożnie usunąć trzy górne warstwy (plazmę, monocyty i medium do izolacji) za pomocą pipety. Warstwy te należy zutylizować.
  5. Ostrożnie pobrać pipetą warstwę neutrofili oraz całe medium do izolacji znajdujące się pod neutrofilami. Przenieść roztwór do czystej probówki do wirowania.
  6. Rozcieńczyć roztwór neutrofili do objętości 10 ml za pomocą HBSS bez Ca2+/Mg2+. Odwrócić probówkę kilka razy, aby zawiesić komórki.
  7. Wirować roztwór neutrofili przy 350 RCF przez 10 minut. Na dnie probówki powinien pojawić się czerwony osad zawierający neutrofile i pozostałe erytrocyty (RBC). Ostrożnie usunąć nadsącz za pomocą pipety, tak aby nie naruszyć osadu.
  8. W celu lizy pozostałych erytrocytów dodać do probówki 2 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (Red Cell Lysis Buffer). Aby resuspenderć osad, mieszać fiolkę w wibratorze laboratoryjnym (vortex) przy ustawieniu 3-4. Należy unikać zwiększania mocy vortexu powyżej 4, ponieważ może to doprowadzić do aktywacji neutrofili. Może być konieczne mieszanie przez kilka sekund lub stosowanie krótkich impulsów w celu rozpuszczenia osadu.
  9. Wirować probówkę przy 250 RCF przez 5 min. Usunąć nadsącz pipetą. W razie potrzeby powtórzyć proces lizy.
  10. Dodać 500 μl HBSS bez Ca2+/Mg2+ do każdej probówki. Ponownie resuspenderć osad w vortexie przy ustawieniu 3-4. Rozcieńczyć do 10 ml za pomocą HBSS bez Ca2+/Mg2+.
  11. Wirować probówki przy 250 RCF przez 5 min. Odessać nadsącz i go zutylizować.
  12. Resuspenderć osad w 250 μl roztworu HBSS/HSA (2% HSA). Następnie można policzyć komórki i dostosować je do pożądanego stężenia.

 

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda separacji w gradiencie gęstości jest stosowana do izolacji ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu mieszaniny metrizoanu sodu i Dextran 500. Metoda ta opiera się na procedurze separacji leukocytów jednojądrowych opracowanej przez Boyuma (1968), która została zmodyfikowana pod kątem separacji neutrofili przez Ferrante i Thonga (1980).

Po pobraniu od dawcy, krew pełną można przeciwkrzeplić za pomocą EDTA, cytrynianu lub heparyny. Ze względu na krótki czas życia, neutrofile należy wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie z grantu NIH R01 HL56621.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Limfocyt Poly(R)OdczynnikCedarlane LabsPolymorphprepTM może być stosowany jako alternatywa
Hank’zrównoważony roztwór soli bez chlorku wapniaOdczynnikInvitrogen
Albumin surowicy ludzkiejOdczynnikZLB Bioplasma
Bufor do lizy erytrocytówOdczynnikGrupa Roche
WirówkaNarzędzie
Mieszadło wirusoweNarzędzie
Pipety Pasteura i gruszkiNarzędzie
PolymorphprepTMOdczynnikAxis-ShieldAlternatywny odczynnik dla Lymphocyte-Poly (R)
Filtr strzykawkowyInneEMD MilliporeSLGV033RSMillex-GV, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, sterylizowalny gamma
Hank’Zrównoważony roztwór soli z chlorkiem wapniaOdczynnikInvitrogen

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Separacja w gradiencie g sto ciwirowanie krwi pe nejlizy erytrocyt wprzygotowanie roztworu HBSSludzka albumina surowiczaocena ywotno ci neutrofiliprotok przemywania kom rekobs uga wir wkipost powanie z pr bkami krwi

Powiązane artykuły