Artykuł metodologiczny

Protokół izolacji neutrofili

DOI:

10.3791/745

⸱

23 lipca 2008

 ,  , 
1Institute for Medicine and Engineering, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile są jednymi z pierwszych komórek, które docierają do miejsca zapalnej odpowiedzi immunologicznej, a ich funkcje i mechanizmy były intensywnie badane in vitro. Demonstrujemy standardową metodę separacji gradientu gęstości w celu wyizolowania ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu dostępnych na rynku pożywek separacyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Granulocyty wielojądrzaste neutrofilów (PMN) są najliczniejszymi leukocytami u ludzi i jednymi z pierwszych komórek, które docierają do miejsca zapalnej odpowiedzi immunologicznej. Ze względu na ich kluczową rolę w zapaleniu, funkcje neutrofili, takie jak lokomocja, produkcja cytokin, fagocytoza i walka komórek nowotworowych, są szeroko badane. Aby scharakteryzować specyficzne funkcje neutrofili, w badaniach in vitro pożądana jest czysta, szybka i niezawodna metoda oddzielania ich od innych komórek krwi, zwłaszcza że neutrofile są krótkotrwałe i powinny być zużyte w ciągu 2-4 godzin od pobrania. Tutaj demonstrujemy standardową metodę separacji gradientu gęstości w celu wyizolowania ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu dostępnych na rynku pożywek separacyjnych, które są mieszaniną metrizoinianu sodu i dekstranu 500. Procedura polega na nałożeniu warstwy krwi pełnej na podłoże o gradiencie gęstości, odwirowaniu, oddzieleniu warstwy neutrofili i lizie pozostałych erytrocytów. Komórki są następnie przemywane, zliczane i ponownie zawieszane w buforze do pożądanego stężenia. Wykazano, że przy prawidłowym wykonaniu metoda daje próbki >95% neutrofili o żywotności >95%.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

 Protokół izolacji neutrofili

  1. Doprowadź wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej.
  2. Zebrać 5,0 ml pożywki do izolacji neutrofili w probówce wirówkowej. Ostrożnie nałożyć 5,0 ml krwi na podłoże separacyjne. Wykonaj ten krok powoli i ostrożnie, trzymając końcówkę pipety blisko powierzchni pożywki, aby uniknąć mieszania się krwi z podłożem.
  3. Wirować przy 500 RCF przez 35 minut w temperaturze 20-25°C. Krew powinna rozdzielić się na 6 odrębnych prążków: osocze, monocyty, pożywki izolacyjne, neutrofile, więcej pożywek izolacyjnych i osad krwinek czerwonych (ryc. 1). Jeśli te pasma nie są wyraźne, oznacza to, że proces separacji nie był czysty i będzie musiał zostać powtórzony.
  4. Ostrożnie usuń trzy górne warstwy (osocze, monocyty i pożywkę izolacyjną) za pomocą pipety. Pozbądź się tych warstw.
  5. Ostrożnie odpipetować warstwę neutrofili i wszystkie pożywki izolacyjne znajdujące się pod neutrofilami. Umieść roztwór w czystej probówce wirówkowej.
  6. Rozcieńczyć roztwór neutrofili do 10 ml HBSS bez Ca2+/Mg2+. Odwróć rurkę kilka razy, aby zawiesić komórki.
  7. Odwirować roztwór neutrofili o stężeniu 350 RCF przez 10 minut. Na dnie probówki powinna znajdować się czerwona osadka zawierająca neutrofile i resztkowe krwinki czerwone (RBC). Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety, aby nie naruszyć osadu.
  8. Aby zlizować resztki krwinek czerwonych, dodaj do probówki 2 ml buforu do lizy krwinek czerwonych. Aby ponownie zawiesić osad, należy przemieszać fiolkę z nastawem 3-4. Unikaj zwiększania ustawienia wiru powyżej 4, ponieważ może to spowodować aktywację neutrofili. Może być konieczne wirowanie przez kilka sekund lub "pulsowanie" wiru w celu rozpuszczenia granulki.
  9. Odwirować probówkę o temperaturze 250 RCF przez 5 minut. Usunąć supernatant za pomocą pipety. W razie potrzeby powtórz proces lizy.
  10. Do każdej probówki dodać 500 μl HBSS bez Ca2+/Mg2+. Ponownie przekręć wir, aby ponownie zawiesić granulkę w ustawieniu 3-4. Rozcieńczyć do 10 ml HBSS bez Ca2+/Mg2+.
  11. Odwirować probówki o temperaturze 250 RCF przez 5 minut. Odessać supernatant i wyrzucić.
  12. Zawiesić osad w 250 μl roztworu HBSS/HSA (2% HSA). Komórki można następnie policzyć i dostosować do pożądanego stężenia.

 

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda separacji w gradionym gradiencie gęstości służy do izolowania ludzkich neutrofili z krwi pełnej przy użyciu mieszaniny metrizoinianu sodu i dekstranu 500. Metoda ta opiera się na metodzie rozdzielania leukocytów jednojądrzastych przez Bojuma (1968), która została zmodyfikowana do separacji neutrofili przez Ferrante i Thonga (1980).

Po pobraniu od dawcy krew pełna może być antykoagulowana EDTA, cytrynianem lub heparyną. Ponieważ są krótkotrwałe, neutrofile należy zużyć w ciągu 2-4 godzin...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie z NIH R01 HL56621.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik Lymphocyte Poly(R)ReagentCedarlane LabsPolymorphprepTM może być stosowany jako alternatywa
Hank' s Zrównoważony roztwór soli bez odczynnika chlorku wapniaOdczynnikInvitrogen
Odczynnikbuforowy do lizy czerwonych krwinek
Narzędzie
PolymorphprepTMOdczynnikAxis-ShieldAlternatywny odczynnik do filtra strzykawkowego z limfocytów i poli(R)
InneEMD MilliporeSLGV033RSMillex-GV, 0,22 μ m, PVDF, 33 mm, Hank' ze sterylizacją promieniową
s Równoważący roztwór soli z odczynnikiem chlorku wapniaInvitrogen
albuminy ludzkiej surowicy bioplazmy Narzędzie do wirówki Grupy Roche Narzędzie do wirowania Pipety Pasteura i żarówka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neutrophil IsolationDensity Gradient SeparationWhole Blood CentrifugationRed Blood Cell LysisHBSS Solution PreparationHuman Serum AlbuminNeutrophil Viability AssessmentCell Washing ProtocolCentrifuge OperationBlood Sample Handling

Powiązane artykuły