$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Roztwory
- Roztwór wewnątrzkomórkowy dla komórek zwojowych (w mM): 100 K-glukonian, 8 KCl, 1 MgCl2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, .5 GTP, 90 µM sulforodaminy B (do barwienia), pH dostosowane do 7.4 za pomocą KOH
- Roztwór wewnątrzkomórkowy dla komórek bipolarnych (w mM): 90 K-glukonian, 8 KCl , 1 MgCl2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, .5 GTP, 90 µM sulforodaminy B (do barwienia), pH dostosowane do 7.4 za pomocą KOH
- Pozakomórkowy roztwór Ringera (w mM): 112 NaCl, 5 glukoza, 5 HEPES, 2 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, pH dostosowane do 7.75 za pomocą NaOH. Natlenianie roztworu nie jest konieczne.
Przygotowanie komór rejestracyjnych
Nasza komora rejestracyjna składa się z szkiełka przedmiotowego z przylepnym dołkiem, w którym umieszczone są niewielkie bloki silikonowe wycięte z innego dołka, aby zapewnić stabilność skrawków tkanki.
Przygotowanie skrawków siatkówki
Aby uniknąć blaknięcia fotoreceptorów, sekcję przeprowadza się w świetle IR lub słabym czerwonym świetle. W przypadku chęci rejestracji odpowiedzi z drogi pręcików należy stosować wyłącznie światło IR (mikroskop sekcyjny IR i brak światła pokojowego; do procedur wykonywanych poza mikroskopem należy używać dodatkowych gogli IR). Jeśli głównym celem jest rejestracja odpowiedzi świetlnych czopków, można zastosować słabe czerwone światło pokojowe lub czerwoną latarkę. Mikroskop powinien jednak nadal być wyposażony w okulary IR.
Jeśli sygnały wejściowe z fotoreceptorów są nieistotne dla eksperymentu, procedury można przeprowadzać w normalnym świetle pokojowym, korzystając ze zwykłego mikroskopu.
- Przygotować dwa szkiełka przedmiotowe z silikonową studzienką adhezyjną: na każdym szkiełku nanieść dwa równoległe pasma smaru silikonowego (w odstępie ok. 0,5 cm), a następnie na jednej stronie szkiełka umieścić prostokątny kawałek papieru filtracyjnego, przecinający oba pasma smaru (docisnąć papier filtracyjny częścią żyletki, aby dobrze przylegał do szkiełka)
- Uśmiercić salamandrę zgodnie z ustalonymi protokołami: zwierzę umieszcza się w kąpieli lodowej na 30 minut, następnie dokonuje się dekapitacji i podwójnego zniszczenia rdzenia przedłużonego (double-pithing)
- Usunąć gałkę oczną z głowy salamandry i umieścić ją pod mikroskopem stereoskopowym na kawałku ręcznika papierowego zwilżonego lodowatym roztworem Ringera
- Usunąć tkankę łączną z oka
- Za pomocą żyletki wykonać niewielkie nacięcie w rogówce
- Przytrzymać naciętą rogówkę pęsetą, usuwając ją nożyczkami wzdłuż miejsca przyczepu do oka
- Usunąć soczewkę za pomocą pęsety
- Przytrzymać tęczówkę pęsetą i przeciąć wzdłuż ora serrata, aby usunąć tęczówkę
- Przeciąć czaszkę gałki ocznej na dwa prostokątne kawałki
- Podnieść jeden z kawałków i położyć go stroną twardówki do góry na papierze filtracyjnym (należy upewnić się, że fragment jest rozprostowany, dociskając go bardzo ostrożnie)
- Delikatnie oddzielić twardówkę od siatkówki, która powinna pozostać przyczepiona do papieru filtracyjnego
- Szybko dodać lodowaty roztwór Ringera do studzienki
- Powtórzyć tę samą procedurę dla drugiego fragmentu
- Użyć żyletki umieszczonej w specjalnie wykonanym przyrządzie do krojenia, aby wykonać plastry o szerokości 200-300µm
- Za pomocą pęsety podnieść plastry z brzegu papieru filtracyjnego, obrócić je tak, aby widoczne były warstwy siatkówki, i umieścić je na pasmach smaru próżniowego
- Wybrać plaster, który wygląda na nieuszkodzony i wykazuje poziome pasma wskazujące na warstwy siatkówki (warstwy te są czasami trudne do zauważenia pod mikroskopem stereoskopowym ze względu na zbyt małe powiększenie, jednak jeśli można rozpoznać pewną warstwowość, plaster jest zazwyczaj wystarczający. Ostateczna decyzja o wykorzystaniu plastra zapada po obejrzeniu go pod mikroskopem prostym). Przenieść go na szkiełko komory rejestracyjnej, tworząc mostek z roztworu Ringera między dwoma szkiełkami
- Upewnić się, że papier filtracyjny jest dociśnięty do bloków gumowych w komorze rejestracyjnej, tak aby plaster nie był pochylony (komórki zwojowe i fotoreceptory powinny znajdować się w ostrości jednocześnie)
Umieszczenie tkanki w zestawie rejestracyjnym
- Preparat na szkiełku do rejestracji umieszcza się pod mikroskopem i perfunduje roztworami Ringera za pomocą grawitacyjnego systemu perfuzji.
- Preparat wizualizuje się za pomocą mikroskopu pionowego z obiektywami imersyjnymi wodnymi 10x i 40x.
- Ponownie, w celu zapobiegania blaknięciu fotoreceptorów, stosuje się wyłącznie światło IR. Do portu bocznego mikroskopu przymocowana jest kamera IR, która jest połączona z ekranem telewizyjnym.
Stymulacja wzrokowa
Bodźce wzrokowe są programowane w środowisku Matlab z wykorzystaniem biblioteki Psychtoolbox i rzutowane na siatkówkę przez górny port mikroskopu za pomocą iniektora obrazu mikroskopowego (Mbf bioscience). Procesor wideo Bits++ Digital Video Processor (Cambridge Research Systems) służy do uzyskania 14-bitowej skali luminancji oraz do synchronizacji prezentacji bodźców z akwizycją danych. Bodźce wzrokowe wykorzystane w tym materiale wideo to jasne lub ciemne paski (szerokość = 460µm) o kontraście 100%, które były prezentowane przez dwie sekundy na stałym, jednolitym tle (luminancja = 8 * 104 photons/µm/s, rozmiar: 1.84 x 1.38mm).
Elektrofizjologia
- Elektrody do patch-clampu są wytwarzane z borokrzemowego szkła (OD: 1.5mm, ID: .84mm) przy użyciu wyciągacza mikropipet. W przypadku komórek zwojowych stosuje się rezystancje od 2 do 4 MOhms. Dla komórek bipolarnych stosowane są wyższe rezystancje, w zakresie od 4 do 8 MOhms.
- Rejestracje metodą Voltage Clamp są przeprowadzane przy użyciu wzmacniacza Multiclamp 700A (Molecular Devices) oraz wewnętrznego oprogramowania laboratoryjnego zaprogramowanego w Labview.
- Leki są podawane za pomocą 8-kanałowego systemu perfuzji. Elektrodę do mikroperfuzji umieszcza się blisko skrawka (tkanka powinna widocznie poruszać się podczas włączania i wyłączania perfuzji, jednak należy uważać, aby ciśnienie nie było zbyt silne, co mogłoby spowodować oddzielenie skrawka od papieru filtrującego). Podczas eksperymentów mikroperfuzja powinna być stale włączona (podając roztwór kontrolny, jeśli leki nie są wymagane), aby rejestracja nie była zakłócana przez włączanie i wyłączanie perfuzji.