Hodowle mysich macierzystych komórek grzebienia neuronalnego naskórka (EPI-NCSC)

Podsumowanie

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę izolacji mysich komórek macierzystych grzebienia neuronalnego naskórka (EPI-NCSC). Technika ta polega na mikrodysekcji mieszków włosów wibrysów, izolacji wybrzuszenia (bulge) i umieszczeniu go w hodowli tkankowej. EPI-NCSC zaczynają emigrować z eksplantów wybrzuszenia na podłoże w ciągu 3 - 4 dni.

Streszczenie

EPI-NCSC są pozostałościami embrionalnej grzebieni neuralnej zlokalizowanymi w tkankach dorosłego organizmu, konkretnie w wybrzuszeniu (bulge) mieszków włosowych. Są to multipotentne komórki macierzyste, które posiadają fizjologiczną zdolność do generowania szerokiego spektrum zróżnicowanych typów komórek, w tym neuronów, komórek wspierających nerwy, komórek mięśni gładkich, komórek kostnych/chrzęstnych oraz melanocytów. EPI-NCSC są łatwo dostępne w skórze owłosionej i mogą być izolowane jako wysoce czysta populacja komórek macierzystych. Niniejsze wideo przedstawia szczegółowy protokół przygotowania kultur mysich EPI-NCSC z mieszków wibrysów. Wycinany jest obszar wibrysów dorosłej myszy, a następnie dokonuje się sekcji mieszków wibrysów. Mieszki są przecinane wzdłużnie, a następnie poprzecznie powyżej i poniżej obszaru wybrzuszenia. Wybrzuszenie jest usuwane z torebki kolagenowej i umieszczane na płytce hodowlanej. EPI-NCSC zaczynają emigrować z eksplantów wybrzuszenia po 3 do 4 dniach.

Protokół

Wypreparowanie wybrzuszenia z mieszków włosowych wibrysów dorosłej myszy

1. Stosujemy myszy w wieku od 10 tygodni do 6 miesięcy. Młodsze myszy często dają więcej komórek. Uśmierć mysz i zanurz całe zwierzę w mieszaninie betadyny (roztworu jodu) i nadtlenku wodoru (dostępnych w aptece) w stosunku 1:1 na około 3 minuty.
   
2. Spryskaj całą mysz, zwłaszcza okolicę pyska, 75% etanolem, a następnie przenieś zwierzę pod mikroskop sekcyjny w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
3. Wydziel poduszeczki wibrysów, uważając, aby nie przeciąć opuszków włosa, i umieść je w HBSS.
4. Wyizoluj mieszkowe wibrysów i zbierz je w HBSS w temperaturze pokojowej. W tym celu przytrzymaj pęsetą skórę obok mieszka włosowego, a następnie przetnij tkankę wokół mieszka prostymi nożyczkami. Tnij głęboko, aby uniknąć uszkodzenia opuszków włosa.
5. Wyjmij mieszek wibrysa z poduszeczki i przełóż do nowej płytki ze świeżym HBSS.
6. Wypłucz luźną tkankę tłuszczową i skórną strumieniami buforu, aż mieszki wibrysów będą czyste. W razie potrzeby przetnij nerw prowadzący do mieszka wibrysa i usuń przylegającą tkankę poprzez skrobanie i wielokrotne płukanie HBSS.
7. Przymocuj czysty mieszek włosowy do szklanej szalki Petriego powleczonej Sylgardem za pomocą zaostrzonych igieł wolframowych, używając mikropęsety do trzymania fragmentu skóry obok mieszka.
8. Przetnij mieszek wibrysa wzdłuż za pomocą mikroostrza. Unikaj zbyt głębokiego cięcia, ponieważ może to uszkodzić wybrzuszenie (bulge). Usuwaj krew wielokrotnymi strumieniami HBSS, aż całkowicie zniknie. Pojawienie się krwi jest dobrym wskaźnikiem, że cięcie było wystarczająco głębokie. Jeśli cięcie wzdłużne nie jest wystarczająco długie, można je wydłużyć za pomocą zagiętych mikronożyczek.
9. Wykonaj cięcie poprzeczne powyżej poziomu zatoki jamistej, a następnie drugie cięcie poprzeczne na poziomie zatoki pierścieniowej, blisko skóry.
10. Teraz wewnątrz torebki będzie widoczne wybrzuszenie.
11. Chwyć pęsetą koniec torebki kolagenowej i wyroluj wybrzuszenie za pomocą zagiętej igły wolframowej. Zobaczysz teraz pustą torebkę i wyizolowane wybrzuszenie.
12. Zbierz wyizolowane wybrzuszenia do osobnej płytki hodowlanej z HBSS w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że do zebranych wybrzuszeń nie dostały się inne tkanki.

Hodowla eksplantów wybrzuszeń

1. Pokryć płytki hodowlane o średnicy 35 mm kolagenem, nakładając obok siebie 50 µl kolagenu i 10 µl sterylnego 6% NaCl. Dobrze wymieszać za pomocą dwukrotnie zgiętej pipety Pasteura i rozprowadzić w stronę krawędzi płytki hodowlanej. Inkubować przez noc w czystym eksykatorem, nie dopuszczając do wyschnięcia. Przed użyciem wypłukać płytki solą fizjologiczną.
2. Przedinkubować pokryte kolagenem i wypłukane płytki hodowlane przez około 3 h w pożywce hodowlanej. Pożywka hodowlana składa się z 85% zmodyfikowanego Alpha-MEM, 10% płodowej surowicy bydlęcej i 5% ekstraktu z zarodka kurczaka z 11. dnia.
3. Po ponownej inkubacji usunąć pożywkę z płytek i dodać kilka wyrostków (bulges), używając jak najmniejszej ilości pożywki. Usunąć nadmiar pożywki hodowlanej.
4. Inkubować przez 1 h, nie dłużej, w inkubatorze do hodowli komórkowych w uwilgotnionej atmosferze z 10% tlenu i 5% CO₂.
5. Po 1 h delikatnie dodać 1,5 ml pożywki hodowlanej. Eksplanty z wyrostków powinny przylgnąć do podłoża kolagenowego. Wymieniać 50% pożywki hodowlanej codziennie.
6. W ciągu 3 - 4 dni z eksplantów wyrostków wyemitrują wysoce migrujące komórki. Zwrócić uwagę na ich gwiaździstą morfologię, ruchliwość oraz przeważający brak kontaktów międzykomórkowych. W ciągu kolejnych kilku dni wyemitruje więcej komórek, a komórki te będą szybko proliferować.
7. Usunąć wyrostek 2 - 3 dni po rozpoczęciu emigracji EPI-NCSC za pomocą zaostrzonej igły wolframowej. Jeśli wyrostki zostaną pozostawione na dłużej, mają tendencję do spłaszczania się, co uniemożliwia uzyskanie czystych kultur EPI-NCSC.
8. Ważne: Rzadkie komórki o spłaszczonej morfologii, które czasami pojawiają się kilka dni później niż EPI-NCSC i są mniej ruchliwe, NIE SĄ komórkami EPI-NCSC, lecz prawdopodobnymi komórkami macierzystymi/progenitorami naskórka. Kultury składające się z tych komórek lub kultury mieszane zawierające EPI-NCSC i prawdopodobne komórki macierzyste/progenitory naskórka należy odrzucić.
9. Wskazówka: NIE trzymać komórek zbyt długo w pożywce do pierwotnych eksplantów, ponieważ mają one tendencję do szybkiego różnicowania się przy wysokiej gęstości komórkowej, prawdopodobnie z powodu autokrynnego/parakrynnego sygnalizowania czynników wzrostu.

Dyskusja

Dzięki zdolności do migracji, EPI-NCSC mogą być izolowane jako wysoce czysta populacja komórek macierzystych, które można powiększać in vitro. Jako pozostałości embrionalne w lokalizacji dorosłej, EPI-NCSC są potencjalnie atrakcyjnymi kandydatami do przyszłych terapii zastępczych komórek, inżynierii biomedycznej i/lub medycyny regeneracyjnej. Przetestowaliśmy EPI-NCSC w mysim modelu urazu rdzenia kręgowego, w którym wykazują one pożądane cechy. Poprzez profilowanie ekspresji genów za pomocą metody LongSAGE (www.ncbi.nlm....