Izolacja wczesnych hematopoetycznych komórek macierzystych z worka żółtkowego i obszaru AGM myszy

Podsumowanie

W tym filmie pokazano, jak przeprowadzić mikrodysekcję pęcherzyka żółtkowego oraz regionu aorta-gonady-metanefrosy z embrionów i wykorzystać cytometrię przepływową do sortowania hematopoetycznych komórek macierzystych.

Streszczenie

W embrionie myszy wczesna hematopoeza zachodzi jednocześnie w wielu organach, w tym w worku żółtkowym oraz w regionie aorty, gonad i mezonefry. Obszary te są kluczowe dla ustanowienia układu krwiotwórczego w embrionach, co prowadzi do późniejszej migracji komórek macierzystych do wątroby płodowej, a następnie do rozwoju dorosłych komórek macierzystych w szpiku kostnym. Wczesne hematopoetyczne komórki macierzyste można wyizolować z tych organów poprzez mikrodysekcję embrionu, a następnie sortowanie cytometryczne w celu uzyskania czystszej populacji. Pozostaje niejasne, w jaki sposób populacje tych komórek macierzystych przyczyniają się do tworzenia puli komórek macierzystych płodu i osobników dorosłych. Ponadto nasze laboratorium bada, czym wczesne komórki macierzyste różnią się funkcjonalnie od hematopoetycznych komórek macierzystych płodu i osobników dorosłych. Nasz zespół sortuje również różne populacje hematopoetycznych komórek macierzystych i testuje ich rolę funkcjonalną w kontekście różnorodnych modeli genetycznych. W niniejszym materiale wideo demonstrujemy powszechnie stosowaną przez nas procedurę mikrodysekcji oraz przedstawiamy wyniki typowego wykresu FACS. Po wyizolowaniu tych rzadkich populacji możliwe jest przeprowadzenie szeregu testów funkcjonalnych, w tym testów kolonogennych i przeszczepów szpiku kostnego.

Protokół

Disekcja i izolacja wczesnych hematopoetycznych komórek macierzystych z pęcherzyka żółtkowego oraz obszaru aorta-gonada-meznefros myszy

1. Przed rozpoczęciem pracy należy przygotować wszystkie odczynniki i narzędzia niezbędne do procedury:
   
   • Nożyczki
   • Pinceta rozmiar 4 oraz chirurgiczna pinceta z zakrzywionym końcem rozmiar 5/45 (opcjonalnie)
   • Igły 30G z strzykawką
   • Szalki Petriego 35mm  oraz 100mm
   • PBS z 10% i 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS)
   • oraz na koniec kolagenaza
2. Aby rozpocząć sekcję, należy pobrać rogi macicy od ciężarnej samicy w 10,5 dniu po zapłodnieniu.
3. Zwierzęta są uśmiercane zgodnie z zatwierdzonymi procedurami. Stosujemy uduszenie dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcie stawów szyjnych.
4. Brzuch samicy zwilżamy etanolem, a skórę rozcinamy nożyczkami.
5. Przytrzymując skórę pincetą, wykonujemy dodatkowe nacięcia w celu otwarcia otrzewnej.
6. Po otwarciu jamy brzusznej widoczne stają się rogi macicy. Przytrzymując rogi macicy pincetą, odcinamy każdy z końców dystalnych oraz środek, aby wyciąć oba rogi.
7. Rogi macicy umieszcza się następnie w szalce Petriego zawierającej zimny PBS z 10% FBS w celu usunięcia tkanek macicy.
8. Korzystając z pincety rozmiar 4 i pracując pod mikroskopem, delikatnie usuwamy tkankę endometrium z otoczenia każdego konceptusu embrionalnego, uważając, aby nie przebić łożyska.
9. Po usunięciu embriony umieszcza się w nowej szalce z zimnym PBS i 10% FBS.
10. Ostrożnie usuwamy tkankę łożyska, aby odsłonić embrion otoczony pęcherzykiem żółtkowym, używając pincety do odcięcia pęcherzyka z embrionem od łożyska w miejscu ich połączenia. Pęcherzyk żółtkowy zawierający tętnice witelinowe oraz fragment pępowiny można delikatnie oddzielić od embrionu i odstawić na lód do dysocjacji.
11. Embrion przenosi się do małej szalki Petriego z minimalną ilością PBS z 10% FBS – w ilości wystarczającej do zwilżenia embrionu, ale nie nadmiernej. Optymalny poziom cieczy powoduje, że embrion pozostaje nieruchomy podczas powolnego wstrząsania płytką, co zapewnia stabilne ułożenie embrionu podczas sekcji.
12. Należy przejść do użycia igieł 30G, które służą do usunięcia górnej i dolnej części embrionu poprzez cięcie powyżej kończyn przednich i poniżej kończyn tylnych. Opanowanie używania igieł jako narzędzi tnących może wymagać pewnej praktyki. Metoda wykonywania powtarzalnych małych nacięć poprzez krzyżowanie igieł pozwoli na rozcięcie tkanki; igła trzymana w dłoni dominującej służy jako prowadnica dla igły trzymanej w dłoni niedominującej.
13. Usuwamy część grzbietową embrionu. Jest to tkanka zawierająca somity. Delikatnie wycinamy najbardziej grzbietową tkankę, zachowując bezpieczny odstęp od aorty (czerwona linia), aby uniknąć jej uszkodzenia. Przecięcie aorty spowodowałoby utratę krwi i utrudniło wizualizację jej położenia.  Ponownie, wykonywanie małych nacięć igłami jest kluczowe dla zachowania precyzji cięcia.
14. Odsuwamy nadmiar tkanki poza pole widzenia i obracamy embrion, aby wyciąć tkankę brzuszna, ponownie tnąc jak najbliżej aorty, tak aby jej nie uszkodzić.  Nacięcia wykonane zbyt daleko od optymalnego miejsca spowodują obecność tkanek brzusznych, które można usunąć po wyizolowaniu AGM.
15. Ustawiamy embrion stroną grzbietową do dołu lub plecami do płytki. Delikatnie rozkładamy embrion, dociskając boki i lokalizując grzebienie gonadalne. Znajdują się one nieco poza centrum jako struktury rurkowate po obu stronach aorty.
16. Sekcję kończymy poprzez usunięcie nadmiaru tkanek bocznych, stosując te same techniki cięcia co wcześniej. Po usunięciu tkanki bocznej embrionu, obraca się go do góry nogami, aby usunąć pozostałą tkankę boczną.
17. Na tym etapie dokonuje się inspekcji AGM pod kątem obecności nadmiaru tkanki, którą można łatwo usunąć za pomocą igieł bez uszkodzenia aorty lub gonad. Usunięcie jak największej ilości nadmiaru tkanek pozwala na lepszą izolację populacji komórek macierzystych, ponieważ do ich oczyszczania wykorzystujemy tylko kilka markerów powierzchniowych.
18. Używając pincety z zakrzywionym końcem, delikatnie pobieramy każde AGM i umieszczamy w zimnym PBS z 10% FBS do momentu rozpoczęcia dysocjacji.

Dysocjacja i analiza FACS

1. Aby rozdzielić tkanki, należy najpierw umieścić worki żółtkowe i obszary AGM w osobnych probówkach. 
2. Krótko wirować, abyt stworzyć osad z tkanek, a następnie usunąć PBS z 10% FBS.
3. Resuspender tkanki w 0,25% kolagenazie w PBS z 20% FBS, stosując objętość wystarczającą do całkowitego przykrycia tkanek.
4. Inkubować tkanki w temperaturze 37°C.  Przez 25-30 min dla AGM i 35-40 min dla worków żółtkowych.
5. Po zakończeniu inkubacji delikatnie pipetować tkanki w górę i w dół, aby rozdzielić je do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.
6. Przemyć tkanki nadmiarem PBS z 10% FBS, odwirować komórki i resuspender w świeżym sterylnym PBS z 10% FBS.
7. Do analizy FACS komórki barwi się zgodnie z zaleceniami producenta. Do przeprowadzenia cytometrii przepływowej wykorzystujemy urządzenie FACSAria firmy BD Biosciences. Ze względu na rozmiar i kruchość komórek embrionalnych, aperturę sortowania dostosowuje się do większej średnicy niż w przypadku dorosłych komórek krwiotwórczych, które również badamy w laboratorium. Podobnie ciśnienie jest ustawione na niższe niż wymagane dla dorosłych komórek krwiotwórczych. Na przykład podczas sortowania na urządzeniu FACSAria rozmiar dyszy wynosi 100 mikronów, a ciśnienie sortowania 30 psi.
8. W analizach komórek macierzystych metodą FACS z worka żółtkowego izoluje się i sortuje komórki potrójnie dodatnie wykazujące markery cKit, CD34 i CD41, natomiast z obszaru AGM izoluje się komórki podwójnie dodatnie (cKit, CD34). Typowy wykres wyglądałby następująco: komórki cKit dodatnie są analizowane pod kątem CD34 i CD41 jednocześnie lub indywidualnie. Zazwyczaj komórki wykazują stopniowalną dodatniość dla każdego markera, przy czym populacja komórek macierzystych stanowi podzbiór populacji dodatnich.  Wykresy te wskazują, że uzyskano dobrą wydajność komórek, na poziomie 100-300 komórek na jeden worek żółtkowy i na jeden obszar AGM.