Wywiad: Wycinanie prowiralnego DNA HIV-1 przy użyciu ewoluowanej rekombinazy

Podsumowanie

Obecne strategie walki z HIV-1 dążą do zahamowania cyklu życiowego wirusa, lecz nie eliminują skutecznie infekcji. W niniejszej pracy wykazujemy, że zmodyfikowana rekombinaza może efektywnie wycinać zintegrowane prowiralne DNA HIV-1 z genomu zainfekowanych komórek.

Streszczenie

HIV-1 integruje się z chromosomem gospodarza w zainfekowanych komórkach i utrzymuje się w postaci prowirusa flankowanego przez długie powtórzenia końcowe (LTR). Obecne strategie leczenia koncentrują się głównie na enzymach wirusowych lub fuzji wirusa z komórką, co hamuje cykl życiowy wirusa, ale nie eliminuje infekcji. Ponieważ zintegrowany prowirus nie jest celem tych podejść, mogą pojawić się nowe, oporne szczepy HIV-1. W niniejszej pracy wykazujemy, że zmodyfikowana rekombinaza Tre (patrz Molecular evolution of the Tre recombinase , Buchholz, F., Max Planck Institute for Cell Biology and Genetics, Dresden) efektywnie wycina zintegrowane DNA prowirusowe HIV-1 z genomu zainfekowanych komórek. Wytworzyliśmy pseudotypy wirusowe zawierające loxLTR i zainfekowaliśmy komórki HeLa, aby sprawdzić, czy rekombinaza Tre potrafi wyciąć prowirus z genomu ludzkich komórek zainfekowanych HIV-1. Sklonowano linię komórkową uwalniającą cząstki wirusa, a następnie przetransfekowano ją plazmidem wykazującym ekspresję Tre lub wektorem kontrolnym. Monitorowano aktywność rekombinazy oraz produkcję wirusa. Wszystkie analizy wykazały efektywne usunięcie prowirusa z zainfekowanych komórek bez widocznych efektów cytotoksycznych. Wyniki te stanowią dowód koncepcyjny, że możliwe jest wyewoluowanie rekombinazy specyficznie celującej w LTR HIV-1 oraz że rekombinaza ta jest zdolna do wycinania prowirusa HIV-1 z genomu ludzkich komórek zainfekowanych HIV-1.

Zanim jednak zmodyfikowana rekombinaza mogłaby zostać zastosowana w praktyce terapeutycznej, konieczne jest pokonanie istotnych przeszkód. Do najkrytyczniejszych problemów, z którymi się mierzymy, należą efektywne i bezpieczne dostarczanie do komórek docelowych oraz brak efektów ubocznych.

Protokół

W celu uzyskania szerszych informacji na temat rekombinacji specyficznej dla miejsca oraz inżynierii specyficzności miejsca enzymów rekombinaz, prosimy o obejrzenie powiązanych filmów zatytułowanych Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology oraz Molecular Evolution of the Tre Recombinase.