Wsteczna znakowanie komórek zwojowych siatkówki poprzez aplikację Fluoro-Gold na powierzchnię wzgórka górnego

Podsumowanie

W niniejszym filmie opisano metodę znakowania wstecznego komórek zwojowych siatkówki (RGC) poprzez aplikację fluoro-gold (FG) na powierzchnię wzgórka górnego (SC). Technika ta obejmuje wykonanie otworu trepanacyjnego w czaszce, aspirację kory oraz nałożenie gąbki żelatynowej na całą grzbietową powierzchnię SC.

Streszczenie

Liczenie komórek zwojowych siatkówki (RGC) jest niezbędne do oceny degeneracji siatkówki, szczególnie w przypadku jaskry. Wiarygodne znakowanie RGC jest kluczowe dla oceny efektów każdej terapii. U szczura wiadomo, że około 98% RGC wysyła projekcje do przeciwległego wzgórza górnego (SC) (Forrester i Peters, 1967). Aplikacja fluoro-gold (FG) na powierzchnię SC pozwala oznakować niemal wszystkie RGC, co umożliwia skupienie uwagi na tych najbardziej podatnych na uszkodzenia neuronach siatkówki w przebiegu jaskry. FG jest pobierany przez zakończenia aksonalne komórek zwojowych siatkówki i transportowany drogą retrogradną obustronnie do ich ciał komórkowych w siatkówce. W porównaniu z retrogradnym znakowaniem RGC poprzez umieszczenie FG na kikutie przeciętego nerwu wzrokowego przez 2 dni, w tej metodzie zminimalizowany jest wpływ na przeżywalność RGC. W porównaniu z barwieniem fioletem krezylowym, które barwi RGC, komórki amakrynowe oraz śródbłonek naczyń krwionośnych w warstwie komórek zwojowych siatkówki, ta metoda znakowania jest bardziej specyficzna dla RGC. Niniejsze wideo opisuje metodę retrogradnego znakowania RGC poprzez aplikację FG na powierzchnię SC. Przedstawione zostają procedury chirurgiczne, obejmujące trepanację czaszki, aspirację kory w celu odsłonięcia SC oraz aplikację gąbki żelatynowej na całą grzbietową powierzchnię SC. Podano przydatne wskazówki pozwalające uniknąć masywnego krwawienia wewnątrzczaszkowego oraz aspiracji SC.

Protokół

1. Zanurz szczura w narkozie poprzez doszpikowe wstrzyknięcie ketaminy (80mg/kg) i ksylazyny (8mg/kg) (stosunek objętości 2:1). Nałóż sterylną maść nawilżającą do oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówek podczas operacji.
2. Wygol sierść na głowie (od poziomu oczu do uszu), unieruchom głowę na statywie za pomocą zacisku i umieść siekacze w prowadnicy.
3. Zdezynfekuj pole operacyjne 10% roztworem powidonu jodowego, a następnie 70% alkoholem.
4. Nacinaj skórę i mięśnie, aby odsłonić czaszkę i szwy (szew strzałkowy, wieńcowy i poprzeczny) (Rycina 1). Na obszar nacięcia nanieś środek przeciwbólowy, bupiwakainę w formie sprayu (dawka nie może przekroczyć 2 mg/kg).
5. Wywierć w czaszce otwór (ø 2x2 mm, 0,5 mm od szwu strzałkowego i poprzecznego) po każdej stronie szwu strzałkowego. Unikaj przerwania opon mózgowych oraz zatoki znajdującej się pod szwami.
   
   
   Rycina 1. Punkty orientacyjne na czaszce żywego szczura.
   
   
6. Przetnij opony mózgowe nożyczkami sprężynowymi, unikając ich rozdarcia.
7. Ostrożnie odessij za pomocą pompy próżniowej treść mózgową znajdującą się nad powierzchnią grzbietową wzgórka górnego, kierując się trzema punktami kontrolnymi:
   1. zmiana koloru tkanki mózgowej z szarej na białą, a następnie ponownie na szarą
   2. zaprzestanie aspiracji w momencie pojawienia się bezbarwnego płynu mózgowo-rdzeniowego
   3. ostrożne poziome poszerzenie najniższego poziomu ssania w celu odsłonięcia żółtawego wzgórka górnego pokrytego oponą twardą
8. Aspiruj treść mózgową nad wzgórkiem górnym, aż cztery krawędzie wzgórka górnego będą widoczne bezpośrednio pod mikroskopem. Usunięta część kory mózgowej powinna być ograniczona do minimum, aby uniknąć niepożądanych skutków ubocznych (np. dysfunkcji ruchowych). Należy uważać, aby nie dotknąć zatoki.
9. Osusz płyn w otworze za pomocą cienkiego, sterylnego paska bawełny, aby powierzchnia wzgórka górnego była jak najbardziej sucha. Następnie na powierzchnię wzgórka górnego nałóż cienką warstwę gąbki żelatynowej uprzednio nasączonej 6% Fluoro-Gold (FG jest pobierany przez zakończenia aksonów komórek zwojowych siatkówki i transportowany wstecznie obustronnie do ich ciał komórkowych w siatkówce).
10. Wypełnij otwór gąbką żelatynową i zamknij ranę skórną za pomocą klipsów chirurgicznych.
11. Zwierzęta pozostawiono do regeneracji pod lampą żarową w celu utrzymania ciepła. Przeciwbólowca, buprenorfinę (100mcg/kg), podawano doustnie w wodzie pitnej przez 5 dni po znakowaniu wzgórka górnego.

Dyskusja

1. Dlaczego w celu zliczenia komórek zwojowych siatkówki stosuje się tę metodę chirurgiczną?
   
   U szczura wiadomo, że około 98% komórek zwojowych siatkówki (RGC) rzutuje do przeciwległego wzgórza górnego (SC). Aplikacja fluoro-gold na powierzchnię SC pozwala na oznakowanie niemal wszystkich RGC, dzięki czemu możemy skupić się na tych najbardziej podatnych na uszkodzenia neuronach siatkówki w jaskrze. W porównaniu z transportem wstecznym RGC poprzez umieszczenie FG na kikutcie przeciętego nerwu wzrokowego przez 2 dni, wpływ na prz...