W tym filmie pokazujemy, jak znakować ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) za pomocą chlorku manganu (MnCl2), który może wnikać do komórek poprzez napięciowo zależne kanały wapniowe, gdy komórki są biologicznie aktywne. Dodatkowo prezentujemy zastosowanie MnCl2 jako komórkowego środka kontrastowego w MRI w celu określenia żywotności hESC in vitro.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Znakowanie in vitro ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) wykazały zdolność do regeneracji uszkodzonego mięśnia sercowego. Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) stało się jedną z głównych metod obrazowania służących do oceny stopnia regeneracji uszkodzonego mięśnia sercowego. Ponadto, w celu śledzenia i lokalizacji przeszczepionych komórek macierzystych, stosowano markery ex-vivo, takie jak nanocząsteczki tlenku żelaza. Metoda ta nie pozwala jednak na monitorowanie fundamentalnej właściwości biologii komórkowej, jaką jest żywotność przeszczepionych komórek. Znane jest, że chlorek manganu (MnCl2) wnika do komórek poprzez napięciozależne kanały wapniowe (Ca2+) w sytuacji, gdy komórki są biologicznie aktywne, a następnie gromadzi się wewnątrzkomórkowo, powodując skrócenie czasu T1. Sugerujemy zatem, że MRI z wykorzystaniem manganu może być użyteczne do monitorowania żywotności komórek po przeszczepieniu hESC do mięśnia sercowego.
W tym filmie pokażemy, jak znakować hESC za pomocą MnCl2 oraz jak komórki te można wyraźnie zobrazować, wykorzystując MRI in vitro. Jednocześnie aktywność biologiczna kanałów Ca2+ zostanie zmodyfikowana przy użyciu agonisty i antagonisty kanałów Ca2+ w celu oceny towarzyszących zmian sygnału.
Protokół
znakowanie manganem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych
- Przez 5 minut poddaj trypsynizacji ludzkie komórki macierzyste zarodkowe hodowane w warunkach bezwarstwowych (feeder-free). Zneutralizuj trypsynę, dodając pożywkę hodowlaną.
- Odwirować komórki, centrifugując je przy 800 rpm przez 5 minut w temperaturze 20° Celsius. Po resuspensji granulatu komórkowego policz komórki metodą barwienia błękitem trypanu. Na podstawie otrzymanej liczby komórek podziel je na cztery aliquoty po 3 miliony komórek do probówek stożkowych. Ponownie osadź komórki poprzez wirowanie.
- Tuż przed rozpoczęciem znakowania manganem, rozpuść świeży chlorek manganu w 0,9% roztworze chlorku sodu, aby przygotować 0,1mM roztwór chlorku manganu.
- W celu zaobserwowania aktywności kanałów wapniowych przygotowano cztery próbki. Pierwszą próbką jest kontrola, zawierająca komórki inkubowane w samym 0,9% roztworze chlorku sodu. Druga próbka zawiera komórki inkubowane w 0,1 mM MnCl2. Próbki 3 i 4 zawierają komórki inkubowane w 0,1 mM MnCl2 z dodatkiem albo 5 μM agonisty kanałów Ca2+, (s)-(-)-Bay K8644, albo 250 μM antagonisty kanałów Ca2+, werapamilu. Inkubuj cztery próbki w temperaturze 37° Celsius przy 5% CO2 przez 30 minut.
- Po 30 minutach odwirować komórki przy 800 rpm przez 5 minut w temperaturze 20° Celsius. Następnie odessij supernatant i dwukrotnie przemyj znakowane komórki buforem PBS. Po przemyciu resuspenduj każdy granulat w 200 μL PBS i przenieś do probówek PCR. Granulaty te są zazwyczaj białe.
Oznaczanie żelazem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych
- Wymieszaj siarczan protaminy klasy klinicznej z wodą destylowaną, aby otrzymać roztwór zapasowy o stężeniu 1 mg/mL.
- Do probówki zawierającej pożywkę do hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych dodaj ferumoksydy w stężeniu 100 μg/mL, a następnie dodaj 12 μg/mL siarczanu protaminy. Intensywnie mieszaj roztwór przez pięć minut.
- Dodaj wymieszany roztwór do równoważnej objętości pożywki hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μg/mL ferumoksydów i 6 μg/mL siarczanu protaminy do znakowania komórek. Inkubuj komórki w tym roztworze przez 12 godzin.
- Przemyj komórki dwukrotnie PBS, przy czym ostatnie płukanie powinno zawierać 10U/ml heparyny w celu rozpuszczenia pozakomórkowego kompleksu ferumoksydów z siarczanem protaminy. Po przemyciu poddaj komórki trypsynizacji, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.
- Policz komórki i podziel je na wymaganą liczbę próbek. Po przemyciu resuspenduj każdy osad w 200 μL PBS i przenieś do probówek PCR. Osady powinny mieć ciemnopomarańczowo-brązowy kolor.
Wykonanie komórkowego obrazowania rezonansem magnetycznym
- Przygotuj fantom w celu stabilizacji probówek zawierających pellety komórkowe oraz uniknięcia artefaktów pochodzących z otaczającego powietrza podczas skanowania. W tym celu wymieszaj 0,8% agaru i 1% siarczanu miedzi w wodzie destylowanej i doprowadź do wrzenia w kuchence mikrofalowej przez 5-7 minut. Schłodź tę mieszaninę przez co najmniej 1 godzinę przed skanowaniem, aby uzyskać żel.
- Probówki zawierające znakowane pellety komórkowe umieść w fantomie do skanowania. In vitro obrazowanie MRI komórek wykonuje się na urządzeniu Signa HDx 3T MRI (GE Medical Systems), używając klinicznej cewki kolanowej.
- Zeskanuj komórki znakowane manganem dla każdej z trzech próbek, stosując sekwencję spin-echo: TR (czas repetycji) = 800 msec, TE (czas echa) = minimum, FOV (pole widzenia) = 12 x 12 cm, macierz = 256x256, NEX 1.
- Zeskanuj komórki znakowane żelazem, stosując sekwencję gradient-echo. Do tego obrazowania wykorzystano następujące parametry: TR = 100 msec, TE = 10 msec, FA (kąt odchylenia) = 30°, FOV = 12 x 12 cm, macierz = 256 x 256, NEX 1.
Analiza wyników MRI
- Przeanalizuj obrazy z badania MRI czterech różnych próbek komórek znakowanych manganem:
- Próbka nr 1 stanowi grupę kontrolną i zawiera komórki inkubowane w samym 0,9% chlorku sodu.
- Próbka nr 2 zawiera komórki inkubowane w 0,1 mM MnCl2.
- Próbka nr 3 zawiera komórki inkubowane w 0,1 mM MnCl2 z dodatkiem 5 μM agonisty kanałów Ca2+, (s)-(-)-Bay K8644.
- Próbka nr 4 zawiera komórki inkubowane w 0,1 mM MnCl2 z dodatkiem 250 μM antagonisty kanałów Ca2+, werapamilu.
- Zgodnie z przewidywaniami, widoczne są różnice w intensywności sygnału z komórek znakowanych manganem. W porównaniu do komórek znakowanych samym manganem, intensywność sygnału wyraźnie wzrasta w obecności agonisty kanałów wapniowych i spada w obecności antagonisty kanałów wapniowych. Obszar zwiększonej intensywności sygnału dla komórek znakowanych manganem mierzy się przy użyciu programu Image J (NIH, Bethesda, MD, USA). To samo oprogramowanie jest wykorzystywane do analizy obszaru ciemnego sygnału poza rezonansem z komórek znakowanych żelazem. Wielkość ciemnego sygnału z komórek znakowanych żelazem zależy od liczby komórek lub liczby cząsteczek żelaza zawartych w komórkach. W tym przypadku milion komórek wykazuje mniejszy obszar ciemnego sygnału w porównaniu do sygnału z trzech milionów komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wyniki te wskazują, że mangan przenika do wnętrza komórki poprzez napięciowo zależny kanał wapniowy i może być wykorzystany jako środek kontrastowy w MRI, który pozwala również ocenić żywotność komórek. Sugerujemy zatem, że MRI z wykorzystaniem manganu może być przydatne do monitorowania żywotności komórek po transplantacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do mięśnia sercowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Tetrahydrat chlorku manganu(II) | Odczynnik | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| (S)-(-)-Bay K8644 | Odczynnik | Sigma-Aldrich | B133 | |
| (+)-Werapamilu hydrochlorowodorek, miareczkowanie minimum 99,0% | Odczynnik | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Chlorek sodu 0,85-0,90% m/v | Odczynnik | VWR international | VW 3257-1 | |
| Feridex I.V. | Odczynnik | Berlex Laboratories | NDC 59338-7035-5 | roztwór do wstrzykiwań ferumoksydy 11,2 mg żelaza/ml |
| Siarczan protaminy | Odczynnik | American Pharmaceutical Partners | NDC 63323-229-05 | 50 mg (10 mg/ml) |
| Knockout SR (zamiennik surowicy dla komórek ES) | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | |
| DMEM/F12 (1:1) | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | |
| 2-merkapto–etanol 98+% | Odczynnik | Sigma-Aldrich | M 3148 | |
| L-glutamina 200 mM 100x | Odczynnik | GIBCO, firmy Life Technologies | 25030 | |
| penicylina-streptomycyna 10 000 j./ml | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| 100-krotny roztwór niezbędnych aminokwasów MEM (MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution) | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Signa HDx 3T MRI | Narzędzie | GE Healthcare | ||
| kliniczna cewka kolanowa | Narzędzie | GE Healthcare | ||
| DPBS | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 14190 |
Bibliografia
- Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts. Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).
- Aoki, I., et al. Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride. NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).
- Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Arbab, A. S., Frank, J. A. Cellular MRI and its role in stem cell therapy. Regen Med. 3, 199-215 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
