Wytwarzanie stabilnych transgenicznych C. elegans za pomocą mikroiniekcji

Podsumowanie

Ten film demonstruje technikę mikroiniekcji do gonady C. elegans w celu stworzenia transgenicznych zwierząt.

Streszczenie

Transgeniczne Caenorhabditis elegans mogą być łatwo tworzone poprzez mikroiniekcję roztworu plazmidu DNA do gonady ¹. Plazmidowy DNA przegrupowuje się, tworząc pozachromosomalne konkatamery, które są stabilnie dziedziczone, choć nie z taką samą wydajnością jak rzeczywiste chromosomy ². Gen będący przedmiotem zainteresowania jest wstrzykiwany jednocześnie z oczywistym markerem fenotypowym, takim jak rol-6 lub GFP, aby umożliwić selekcję zwierząt transgenicznych pod mikroskopem preparacyjnym. Gen egzogenny może być eksprymowany przez jego natywny promotor do badań lokalizacji komórkowej. Alternatywnie, transgen może być sterowany przez inny specyficzny dla tkanki promotor w celu oceny roli produktu genu w tej konkretnej komórce lub tkance. Technika ta skutecznie napędza ekspresję genów we wszystkich tkankach C. elegans z wyjątkiem linii zarodkowej lub wczesnego zarodka ³. Tworzenie zwierząt transgenicznych jest szeroko wykorzystywane w wielu paradygmatach eksperymentalnych. Ten film pokazuje procedurę mikroiniekcji w celu wygenerowania transgenicznych robaków. Ponadto opisano selekcję i utrzymanie stabilnych transgenicznych linii C. elegans.

Protokół

Budowa plazmidu ekspresji

Wymagane są dwa plazmidy: jeden do specyficznej tkankowo ekspresji interesującego genu, a drugi jako selektywny marker transformacji.

Eksperymentalny plazmid

1. Wybierz promotor, który ulega ekspresji w interesującym typie tkanki/komórki, na przykład promotor specyficzny dla nerwów lub mięśni. Jeśli ma dojść do ekspresji wielu genów w tej samej tkance, można użyć plazmidu kasety promotora w systemie Gateway (Invitrogen). Takie podejście pozwala na wprowadzenie dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania za promotorem poprzez klonowanie rekombinacyjne ^4. Ogólnie rzecz biorąc, 2-5 kb sekwencji nadrzędnych wystarcza do uzyskania poprawnego i dokładnego wyrażenia.
   
   
2. CDNA interesującego genu można sklonować na dwa sposoby:
   1. Konwencjonalne klonowanie przy użyciu enzymów restrykcyjnych.
   2. W przypadku klonowania Gateway jest on amplifikowany PCR przy użyciu starterów, które zawierają sekwencję rekombinacyjną Gateway att B. Amplifikowane cDNA jest najpierw rekombinowane w wektor dawcy pDONR201 w celu utworzenia wektora wejściowego, a następnie przekształcane w szczep E. coli DH5a. Po wybraniu udanych rekombinantów i mini-prep izolacji DNA, wektor wejściowy jest rekombinowany w wektor docelowy zawierający promotor w celu wytworzenia plazmidu ekspresyjnego. Szczegółowe informacje na temat klonowania rekombinacyjnego są dostępne w podręczniku Invitrogen Gateway lub w Caldwell et al. ⁵.

Marker do wyboru plazmid

Przykłady transgenicznych plazmidów markerowych obejmują rol-6 lub użycie promotora mięśni ściany ciała unc-54 do napędzania ekspresji białek fluorescencyjnych. Te plazmidy markerowe są zwykle dostępne w społeczności badawczej na żądanie.

Mikroiniekcja C. elegans

Przygotowanie

1. Wykonaj izolację DNA dwóch plazmidów, które mają zostać wstrzyknięte. Zmierz je ilościowo i wymieszaj ze sobą w stosunku 1:1 po 50 ng/μl.
   
   
2. Przygotuj podkładki agarowe:
   1. Przygotuj 2% roztwór agarozy w wodzie; podgrzewaj lub mikrofalówkę, aż się rozpuści.
   2. Ustaw kilka okularów nakrywkowych o wymiarach 22 x 50 mm na blacie.
   3. Za pomocą pipety Pasteura umieść kroplę stopionej agarozy na jednym szkle nakrywkowym i natychmiast umieść drugą szklankę nakrywkową na kropli pod kątem 90 do pierwszej. Powtórz tę czynność dla kilku innych okularów nakrywkowych. Średnica spłaszczonego krążka agarozy powinna wynosić od 15 do 20 mm.
   4. Po zestaleniu się agarozy (zajmuje to tylko chwilę) zdejmij szklankę nakrywkową i pozostaw podkładkę do całkowitego wyschnięcia na powietrzu (od kilku godzin do nocy).
   5. Przechowuj podkładki w szklanym pudełku nakrywkowym w temperaturze pokojowej.
      
      
3. Wykonaj ładowarki igłowe do roztworu DNA:
   
   Ładowarki igłowe są tworzone z rurek kapilarnych o pojemności 100 μl, które są podgrzewane w środku nad otwartym płomieniem i szybko ciągnięte do około dwukrotności ich długości. Dwie połówki są rozdzielane, gdy rurka kapilarna ostygnie. Zgromadź 10-20 ładowarek igłowych do wstrzykiwań. Przechowywać w pozycji pionowej w stojaku na probówki do mikrowirówek. Zachowaj ostrożność, aby nie nabić się na punkty.
   
   
4. Wykonaj igły do mikroiniekcji:
   
   Igła jest wykonana ze specjalnej rurki kapilarnej, która zawiera wewnętrzne włókno szklane; włókno to służy jako dla roztworu DNA. Są one ciągnięte na maszynie do ściągania igieł. Używamy ściągacza Narishige PP-830 o ustawieniu grzania 24,8. Kilka igieł jest wyciąganych na raz i przechowywanych w małym plastikowym pudełku. Wiele igieł można łatwo "zamontować" na pasku plasteliny w celu długotrwałego przechowywania.
   
   
5. "Łamacze" końcówki igły:
   
   Końcówka igły do mikroiniekcji jest ciągnięta tak drobno, że jest faktycznie zamknięta na końcu i powinna zostać rozbita za pomocą małych odłamków szkła nakrywkowego. Przygotowuje się je, zawijając szklankę nakrywkową o wymiarach 18 x 18 mm w ręcznik papierowy i delikatnie dociskając, aż rozpadnie się na kilka kawałków. Odłamki o użytecznym rozmiarze to około 3 x 4 mm.
   
   
6. Hodować robaki typu dzikiego (N2) do wczesnej fazy dorosłej w celu wstrzyknięcia przy użyciu standardowych procedur ⁶. Przygotuj około 100 odpowiednio przygotowanych robaków/wstrzykniętych konstruktów.

Procedura

1. Otwórz główny zawór w zbiorniku helu, który jest połączony z ramieniem igły do mikroiniekcji i uchwytem. Zamknij zawór regulatora, aby gaz mógł dostać się do przewodu, doprowadzając ciśnienie do 35 psi. Zwróć uwagę, że gaz można zwolnić za pomocą pedału nożnego.
   
   
2. Włożyć ładowarkę igłową do standardowej rurki do pipety ustnej (znajdującej się w pojemnikach ze szklanymi rurkami kapilarnymi) i pobrać niewielką ilość mieszaniny plazmidu (~1 μl).
   
   
3. Ładowarkę igłową ostrożnie umieszcza się w tylnym końcu igły iniekcyjnej i delikatnie wkłada przez całą długość igły, aż do wyczucia oporu. Wyrzuć roztwór DNA, delikatnie, a następnie wyjmij ładowarkę.
   
   
4. Włóż igłę do ramienia do mikroiniekcji, uważając, aby umieścić ją w małej wewnętrznej gumowej uszczelce.
   
   
5. Umieść odłamek szkła nakrywkowego łamiącego igłę na jednej krawędzi podkładki agarowej. Przykryj odłamek, a także całą powierzchnię podkładki agarowej, olejem halowęglowym. Umieść podkładkę agarową na stoliku odwróconego mikroskopu.
   
   
6. Umieść igłę na środku viewpole za pomocą obiektywu 4X i oświetlenia jasnego pola, ale jeszcze nie zanurzaj jej w oleju. Umieść również wewnętrzną krawędź odłamka szkła nakrywkowego na środku, a następnie skup się na nim (nadal używając obiektywu 4X). Opuść igłę w oleju, ustawiając ją w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, co odłamek szkła nakrywkowego. Zwiększ powiększenie, przełączając się na obiektyw 40X. Ponownie ustaw ostrość na krawędzi odłamka i w razie potrzeby zmień położenie końcówki igły.
   
   
7. Aby otworzyć końcówkę igły do wstrzykiwań, DELIKATNIE przysunąć igłę do krawędzi odłamka szkła nakrywkowego, jednocześnie wprowadzając krótki impuls gazu za pomocą pedału nożnego. Igła zostanie wystarczająco złamana, gdy małe kropelki płynu wydostaną się z końca igły. Nadmierny przepływ cieczy spowodowany zbyt dużym otworem nie jest pożądany, ponieważ zabije zwierzęta.
   
   
8. Zdejmij podkładkę agarową ze sceny, podnosząc igłę do góry, ale nie zmieniaj położenia osi X lub Y. Wysuń stolik spod igły, wyjmij podkładkę agarową i umieść ją na mikroskopie preparacyjnym. Przenieś robaka na podkładkę, poniżej powierzchni oleju. Jeśli robak się wierci, DELIKATNIE głaszcz go, aż zetknie się z podkładką agarową. Wilgotny robak powinien przylegać do suchej agarozy.
   
   
9. zastrzyk
   1. Szybko umieść podkładkę agarową z powrotem na scenie, wyśrodkowując robaka w polu widzenia.
   2. Opuść igłę do tej samej płaszczyzny ostrości co robak.
   3. Przełącz filtry na Hoffman Illumination (rodzaj filtra kontrastowego). Dzięki temu szczegóły morfologiczne robaka stają się widoczne. Jeśli optyka Nomarski/DIC jest dostępna w odwróconej lunecie, to również będzie działać. Korzystając z obiektywu 40X, skup się na "ziarnistym" syncytialnym środku gonady robaka,  poniżej wzoru "plastra miodu" jąder zarodkowych (wybierz gonadę, która jest umieszczona po stronie robaka skierowanej w stronę igły).
   4. Dostosuj położenie igły, aż końcówka również będzie ostra (ta sama płaszczyzna, co "ziarnistość" gonady).
   5. Delikatnie włóż igłę w środek gonady i zastosuj krótki impuls ciśnienia gazu, aby wyrzucić jedną lub dwie krople DNA do ramienia gonady. Powinieneś zaobserwować falę płynu rozchodzącą się po dystalnej gonadzie. Nie zakładaj, że więcej płynu jest lepsze, ponieważ zbyt dużo płynu może wpłynąć do proksymalnego zgięcia ramienia gonady, co może wyłączyć produkcję oocytów. Jeśli to możliwe, w zależności od pozycji robaka, wstrzyknij drugie ramię gonady w ten sam sposób.
   6. Ważne jest, aby pracować szybko podczas wstrzykiwania robaka, ponieważ może on łatwo wyschnąć. Decyzja o wstrzyknięciu drugiego ramienia gonady zależy od tego, jak szybko można zmienić położenie igły i robaka. Cały proces powinien zająć mniej niż 1-2 minuty.
      
      
10. Zdejmij szklankę nakrywkową ze sceny i umieść ją na lunecie sekcyjnej. Nanieść 1 μl buforu M9 (22mM KH₂PO₄, 42mM Na₂HPO₄, 85mM NaCl, 1mM_MgSO4) bezpośrednio na wstrzykiwany robak (może to wiązać się z zanurzeniem końcówki pipety pod powierzchnią oleju halowęglowego). Bufor powinien ponownie nawodnić robaka; Następnie unosi się z powierzchni podkładki agarozowej. Przenieś robaka na zwykłą płytkę za pomocą wykałaczki do robaków. Podkładka agarozowa może być użyta jeszcze kilka razy, aż stanie się zbyt nasycona buforem i robaki przestaną przylegać.

Selekcja transgeniczna

1. Wstrzyknięte robaki generacji P₀ są przenoszone na pojedyncze świeże, bakteryjne płytki (60 mm) i pozostawiane do rozmnażania. Zazwyczaj zwierzęta, którym wstrzykuje się zastrzyki, wysiaduje się w temperaturze 20°C przez 2-3 dni, aż pojawi się potomstwo.
   
   
2. Potomstwo F₁ obserwuje się pod kątem śladów markera transgenicznego (takiego jak fluorescencja) za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Każde zwierzę fluorescencyjne, będące nosicielem F_1, jest oddzielnie klonowane na nowej płytce (ponieważ potomstwo z każdego zwierzęcia F₁ jest uważane za odrębną linię). Hermafrodyty F₁ mogą się rozmnażać. Ponownie, zwykle odbywa się to w temperaturze 20°C przez 2-3 dni, aż pojawi się potomstwo.
   
   
3. Pokolenie F₂ obserwuje się również u zwierząt transgenicznych. Zwierzęta F₂, które odziedziczyły i wykazują ekspresję transgenicznej macierzy, są uważane za "stabilną" linię.
   
   UWAGA: W stadium F₁ może być wiele zwierząt transgenicznych, ale nie są one stabilne. Większość zwierząt transgenicznych F₁ nie zostanie rozmnożona do stabilnych linii F₂.
   
   UWAGA: Aby kontrolować zmienność liczby kopii genu, wygeneruj co najmniej trzy niezależne stabilne linie na wstrzyknięty konstrukt.
   
   
4. Każda niezależna stabilna linia powinna być utrzymywana jako oddzielna linia robaków. Każda linia może być rozmnażana poprzez przeniesienie kilku zwierząt transgenicznych na nową płytkę w każdym pokoleniu; Należy to zrobić za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego, jeśli wybrany marker jest fluorescencyjny.

Dyskusja

Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o:
- wstrzykiwać bezpośrednio w środek gonady
- nie wstrzykiwać zbyt dużej ilości płynu
- Pracuj szybko, aby zapobiec wysuszeniu.

Jeśli napotkasz problemy z igłą, takie jak zbyt duże złamanie, najlepiej jest przerobić nową igłę, zamiast próbować wstrzykiwać ją za pomocą igły mniej niż idealnej.

Generowanie transgenicznych robaków ma wiele zastosowań, takich jak:
- identyfikacja zmutowanych genów, w metodz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Olej Halocarbon, Voltalef	Hulle 10S	elfatochem, Francja
Szkło nakrywkowe 18x18 mm		Fisher Scientific	12-548-A
Szkło nakrywkowe 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Szkło nakrywkowe 22x50 mm		Fisher Scientific	12-545-E
100 ul Kapilara		VWR international	53432-921
Szklana kapilara do igieł	"Kwik-Fil"	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Narzędzie do ściągania igieł		Narishige International	Model PP-830
System		Tritech Research, Inc.	Luneta MINJ-1000	stolik, manipulator
preparacyjny, z mikroskopem fluorescencyjnym		Nikon Instruments	SMZ800
Mikroskop	preparacyjny	Nikon Instruments	SMZ645