Generowanie stabilnych transgenicznych *C. elegans* metodą mikrowstrzykiwania

Podsumowanie

W tym filmie zaprezentowano technikę mikroiniekcji do gonady C. elegans w celu stworzenia zwierząt transgenicznych.

Streszczenie

Transgeniczne osobniki Caenorhabditis elegans można łatwo stworzyć poprzez mikroiniekcję roztworu plazmidu DNA do gonady ¹. DNA plazmidowe ulega reorganizacji, tworząc pozachromosomalne konkatamery, które są stabilnie dziedziczone, choć z mniejszą wydajnością niż rzeczywiste chromosomy ². Gen zainteresowania jest wstrzykiwany wraz z wyraźnym markerem fenotypowym, takim jak rol-6 lub GFP, co umożliwia selekcję zwierząt transgenicznych pod mikroskopem stereoskopowym. Gen egzogenny może być ekspresowany z natywnego promotora w celu badania lokalizacji komórkowej. Alternatywnie transgen może być sterowany przez inny promoter tkankowo specyficzny, aby ocenić rolę produktu genu w konkretnej komórce lub tkance. Technika ta pozwala na wydajną ekspresję genu we wszystkich tkankach C. elegans, z wyjątkiem linii zarodkowej lub wczesnego embrionu ³. Tworzenie zwierząt transgenicznych jest powszechnie wykorzystywane w wielu paradygmatach eksperymentalnych. Niniejszy film prezentuje procedurę mikroiniekcji służącą do generowania transgenicznych nicieni. Ponadto opisano proces selekcji i utrzymywania stabilnych linii transgenicznych C. elegans.

Protokół

Konstrukcja plazmidu ekspresyjnego

Wymagane są dwa plazmidy: jeden do tkankowo swoistej ekspresji badanego genu oraz drugi jako selekcyjny marker transformacji.

Plazmid eksperymentalny

1. Wybierz promotor, który jest ekspresowany w interesującej tkance lub typie komórek, na przykład promotor specyficzny dla nerwów lub mięśni. W przypadku chęci ekspresji wielu genów w tej samej tkance można zastosować plazmid z kasetą promotorową w systemie Gateway (Invitrogen). Podejście to umożliwia wstawienie dowolnego interesującego genu za promotorem za pomocą klonowania rekombinacyjnego ^4. Zazwyczaj 2-5 kb sekwencji upstream jest wystarczające do zapewnienia prawidłowej i precyzyjnej ekspresji.
   
   
2. cDNA interesującego genu można sklonować na dwa sposoby:
   1. Klonowanie konwencjonalne z użyciem enzymów restrykcyjnych.
   2. W przypadku klonowania Gateway, cDNA jest amplifikowane metodą PCR przy użyciu starterów zawierających rekombinacyjną sekwencję Gateway att B. Amplifikowane cDNA jest najpierw rekombinowane do wektora donora pDONR201 w celu utworzenia wektora wejściowego, a następnie transformowane do szczepu E. coli DH5a. Po wyselekcjonowaniu udanych rekombinantów i izolacji DNA metodą mini-prep, wektor wejściowy jest rekombinowany do zawierającego promotor wektora docelowego w celu utworzenia plazmidu ekspresyjnego. Szczegółowe informacje na temat klonowania rekombinacyjnego są dostępne w instrukcji Invitrogen Gateway lub w pracy Caldwell i wsp. ⁵.

Plazmid z markerem selekcyjnym

Przykłady plazmidów markerowych dla transgenów obejmują rol-6 lub wykorzystanie promotora mięśni ścian ciała unc-54 do sterowania ekspresją białka fluorescencyjnego. Plazmidy markerowe te są zazwyczaj dostępne w obrębie społeczności badawczej na prośbę.

Mikroiniekcja C. elegans

Przygotowanie

1. Przeprowadź izolację DNA dwóch plazmidów przeznaczonych do wstrzyknięcia. Określ ich stężenie i zmieszaj w stosunku 1:1, tak aby każde z nich miało stężenie 50 ng/µl.
   
   
2. Przygotuj podkładki agarowe:
   1. Przygotuj 2% roztwór agarozy w wodzie; podgrzewaj lub użyj kuchenki mikrofalowej do całkowitego rozpuszczenia.
   2. Rozłóż na blacie kilka szkiełek nakrywkowych o wymiarach 22 x 50 mm.
   3. Za pomocą pipety Pasteura nanieś kroplę roztopionej agarozy na jedno szkiełko nakrywkowe i natychmiast połóż drugie szkiełko na kropli pod kątem 90° względem pierwszego. Powtórz czynność dla pozostałych szkiełek. Średnica spłaszczonego dysku agarozy powinna wynosić od 15 do 20 mm.
   4. Po zestaleniu się agarozy (trwa to tylko chwilę) zdejmij szkiełko nakrywkowe i pozostaw podkładkę do całkowitego wyschnięcia na powietrzu (od kilku godzin do całej nocy).
   5. Przechowuj podkładki w pudełku na szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej.
      
      
3. Przygotuj kapilary do ładowania igieł z roztworem DNA:
   
   Kapilary do ładowania igieł wykonuje się z kapilar o pojemności 100 µl, które podgrzewa się w połowie nad otwartym płomieniem i szybko rozciąga do około dwukrotności ich długości. Po ochłodzeniu kapilary obie połowy rozdziela się poprzez złamanie. Przygotuj zapas 10–20 kapilar do ładowania igieł na potrzeby iniekcji. Przechowuj je pionowo w statywie do probówek do mikrocentryfugi. Zachowaj ostrożność, aby nie skaleczyć się ostrzami.
   
   
4. Wykonaj igły do mikroiniekcji:
   
   Igłę wykonuje się ze specjalnej kapilary zawierającej wewnętrzne włókno szklane, które służy jako knot dla roztworu DNA. Są one rozciągane w maszynie do wyciągania igieł. Używamy wyciągarki Narishige PP-830 z ustawioną temperaturą 24,8. Kilka igieł wyciąga się jednocześnie, a następnie przechowuje w małym plastikowym pudełku. Wiele igieł można łatwo „zamontować” na pasku plasteliny w celu długoterminowego przechowywania.
   
   
5. „Łamacze” końcówek igieł:
   
   Końcówka igły do mikroiniekcji jest tak cienka, że jej otwór jest w rzeczywistości zamknięty i należy go otworzyć, używając małych odłamków szkiełka nakrywkowego. Przygotowuje się je, owijając szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 x 18 mm ręcznikiem papierowym i delikatnie naciskając, aż pęknie na kilka części. Odłamki o przydatnym rozmiarze mają około 3 x 4 mm.
   
   
6. Wyhoduj nicienie typu dzikiego (N2) do wczesnego stadium dorosłego w celu iniekcji, stosując standardowe procedury ⁶. Przygotuj około 100 nicieni we właściwym stadium dla każdego wstrzykniętego konstruktu.

Procedura

1. Otwórz główny zawór w butli z helem podłączonej do ramienia z igłą do mikroiniekcji i uchwytu. Zamknij zawór regulatora, aby dopuścić gaz do przewodu, doprowadzając ciśnienie do 35 psi. Zwróć uwagę, że gaz można uwalniać za pomocą pedału nożnego.
   
   
2. Włóż załadowywacz igieł do standardowej rurki pipety ustnej (znajdującej się w pojemnikach z szklanymi kapilarami) i pobierz niewielką ilość mieszaniny plazmidów (~1 µl).
   
   
3. Załadowywacz igieł ostrożnie umieść w tylnym końcu igły do iniekcji i delikatnie wsuń go przez całą długość igły, aż poczujesz opór. Wypchnij roztwór DNA, delikatnie dmuchając, a następnie wyjmij załadowywacz.
   
   
4. Wsuń igłę do ramienia mikroiniekcyjnego, uważając, aby umieścić ją wewnątrz małej wewnętrznej gumowej uszczelki.
   
   
5. Umieść odłamek szkła kryjącego służący do łamania igieł na krawędzi podkładki agarowej. Przykryj odłamek oraz całą powierzchnię podkładki agarowej olejem halokarbonowym. Umieść podkładkę agarową na stoliku mikroskopu odwróconego.
   
   
6. Ustaw igłę w centrum pola widzenia, korzystając z obiektywu 4X i oświetlenia w jasnym polu, ale nie opuszczaj jej jeszcze do oleju. Następnie ustaw wewnętrzną krawędź odłamka szkła kryjącego w centrum i ustaw ostrość na niej (nadal używając obiektywu 4X). Opuść igłę do oleju, wprowadzając ją w tę samą płaszczyznę ogniskowania co odłamek szkła kryjącego. Zwiększ powiększenie, przełączając się na obiektyw 40X. Ponownie ustaw ostrość na krawędzi odłamka i w razie potrzeby skoryguj pozycję końcówki igły.
   
   
7. Aby otworzyć końcówkę igły do iniekcji, DELIKATNIE dociśnij igłę do krawędzi odłamka szkła kryjącego, jednocześnie podając krótki impuls gazu za pomocą pedału nożnego. Igła zostanie wystarczająco otwarta, gdy z jej końca zaczną wydostawać się małe kropelki cieczy. Nadmierny przepływ cieczy spowodowany zbyt dużym otworem jest niepożądany, ponieważ może doprowadzić do śmierci zwierząt.
   
   
8. Usuń podkładkę agarową ze stolika, podnosząc igłę, ale nie zmieniaj pozycji osi X lub Y. Wysuń stolik spod igły, zdejmij podkładkę agarową i umieść ją pod mikroskopem dissectingowym. Przenieś nicienia na podkładkę, poniżej powierzchni oleju. Jeśli nicień się wyrywa, DELIKATNIE go dotknij, aż zetknie się z podkładką agarową. Wilgotny nicień powinien przylgnąć do suchego agarozu.
   
   
9. Iniekcja
   1. Szybko umieść podkładkę agarową z powrotem na stoliku, centrując nicienia w polu widzenia.
   2. Opuść igłę w tę samą płaszczyznę ogniskowania co nicień.
   3. Przełącz filtry na oświetlenie Hoffmana (rodzaj filtra kontrastowego). Pozwala to na uwidocznienie szczegółów morfologicznych nicienia. Jeśli w mikroskopie odwróconym dostępna jest optyka Nomarski/DIC, ona również będzie odpowiednia. Używając obiektywu 40X, ustaw ostrość na „ziarniste” syncytialne centrum gonady nicienia,  poniżej wzoru „plastra miodu” jąder zarodkowych (wybierz tę gonadę, która znajduje się po stronie nicienia zwróconej w stronę igły).
   4. Precyzyjnie dostrój pozycję igły, aż jej końcówka również znajdzie się w ostrości (w tej samej płaszczyźnie co „ziarnistość” gonady).
   5. Delikatnie wprowadź igłę do centrum gonady i podaj krótki impuls ciśnienia gazu, aby wprowadzić jedną lub dwie kropelki DNA do ramienia gonady. Powinna być widoczna fala cieczy rozprzestrzeniająca się wzdłuż dystalnej części gonady. Nie należy zakładać, że większa ilość cieczy jest lepsza, ponieważ nadmiar cieczy może wpłynąć do proksymalnego zgięcia ramienia gonady, co może zahamować produkcję oocytów. Jeśli to możliwe, w zależności od pozycji nicienia, w ten sam sposób wykonaj iniekcję do drugiego ramienia gonady.
   6. Ważne jest, aby pracować szybko podczas iniekcji nicienia, ponieważ może on łatwo wyschnąć. Decyzja o iniekcji drugiego ramienia gonady zależy od tego, jak szybko można ponownie ustawić igłę i nicienia. Cały proces powinien idealnie trwać mniej niż 1-2 minuty.
      
      
10. Zdejmij szkło kryjące ze stolika i umieść je pod mikroskopem dissectingowym. Nanieś 1 µl buforu M9 (22mM KH₂PO₄, 42mM Na₂HPO₄, 85mM NaCl, 1mM MgSO₄) bezpośrednio na iniektowanego nicienia (może to wymagać zanurzenia końcówki pipety poniżej powierzchni oleju halokarbonowego). Bufor powinien nawodnić nicienia, który następnie odklei się od powierzchni podkładki agarozowej. Przenieś nicienia na zwykłą płytkę za pomocą pęsety do nicieni. Podkładkę agarozową można wykorzystać jeszcze kilka razy, dopóki nie nasyci się zbyt mocno buforem i nicienie przestaną do niej przylegać.

Selekcja transgeniczna

1. Wstrzyknięte nicienie, pokolenie P₀, przenosi się na oddzielne, świeże płytki (60 mm) z zasianymi bakteriami i pozwala im się rozmnażać. Zazwyczaj zwierzęta po wstrzyknięciu inkubuje się w temperaturze 20°C przez 2-3 dni, aż pojawią się potomstwo.
   
   
2. Potomstwo F₁ obserwuje się pod kątem obecności markera transgenicznego (takiego jak fluorescencja) przy użyciu fluorescencyjnego stereomikroskopu. Każde fluorescencyjne zwierzę F₁ będące nośnikiem jest osobno klonowane na nową płytkę (ponieważ potomstwo z każdego osobnika F₁ jest uznawane za odrębną linię). Obojnaki F₁ pozostawia się do rozmnażania. Ponownie, proces ten zazwyczaj przeprowadza się w 20°C przez 2-3 dni, aż pojawi się potomstwo.
   
   
3. W pokoleniu F₂ również poszukuje się zwierząt transgenicznych. Zwierzęta F₂, które odziedziczyły i wykazują ekspresję macierzy transgenicznej, uznaje się za linię „stabilną”.
   
   UWAGA: Na etapie F₁ może pojawić się wiele zwierząt transgenicznych, ale nie są one stabilne. Większość transgenicznych zwierząt F₁ nie zostanie przekształcona w stabilne linie F₂.
   
   UWAGA: Aby kontrolować zmienność liczby kopii genu, należy wygenerować minimum trzy niezależne linie stabilne dla każdego wstrzykniętego konstruktu.
   
   
4. Każda niezależna linia stabilna powinna być utrzymywana jako oddzielna linia nicieni. Każdą linię można powielać, przenosząc kilka zwierząt transgenicznych na nową płytkę w każdym pokoleniu; czynność tę należy wykonywać przy użyciu fluorescencyjnego stereomikroskopu, jeśli marker selekcyjny jest fluorescencyjny.

Dyskusja

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby:
- wstrzykiwać bezpośrednio do centrum gonady
- nie wstrzykiwać zbyt dużej ilości płynu
- pracować szybko, aby zapobiec wysuszeniu.

W przypadku problemów z igłą, takich jak zbyt duże uszkodzenie, najlepiej przygotować nową igłę, zamiast próbować wykonywać wtryskiwanie za pomocą igły w stanie nieidealnym.

Tworzenie nicieni transgenicznych ma wiele zastosowań, takich jak:
- identyfikacj...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Olej halogenowany, Voltalef	Hulle 10S	elfatochem, Francja
Kapturka 18x18 mm		Fisher Scientific	12-548-A
Kapturka 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Kapturka 22x50 mm		Fisher Scientific	12-545-E
Kapilara 100 ul		VWR international	53432-921
Kapilara szklana do igieł	"Kwik-Fil"	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Wyciągarka do igieł	Narzędzie	Narishige International	Model PP-830
System mikroiniekcyjny microINJECTOR		Tritech Research, Inc.	MINJ-1000	Okular, stolik, manipulator
Stereomikroskop do sekcji z fluorescencją	Mikroskop	Nikon Instruments	SMZ800
Stereomikroskop do sekcji	Mikroskop	Nikon Instruments	SMZ645