Zastosowanie testu degeneracji neuronów dopaminowych C. elegans do walidacji potencjalnych genów choroby Parkinsona

Podsumowanie

Ten film pokazuje, jak używać C. elegans do oceny neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych jako modelu choroby Parkinsona. Ponadto genetyczne badania przesiewowe są wykorzystywane do identyfikacji czynników, które albo nasilają zwyrodnienie, albo działają neuroprotekcyjnie.

Streszczenie

Poprawa w diagnozowaniu i leczeniu choroby Parkinsona (PD) zależy od wiedzy na temat czynników podatności, które sprawiają, że populacje są zagrożone. W procesie identyfikacji nowych czynników genetycznych związanych z chorobą Parkinsona naukowcy stworzyli wiele list genów kandydujących, polimorfizmów i białek, które reprezentują ważne postępy, ale te tropy pozostają mechanistycznie niezdefiniowane. Nasze prace mają na celu znaczne zawężenie takich list poprzez wykorzystanie zalet prostego systemu modeli zwierzęcych. Podczas gdy ludzie mają miliardy neuronów, mikroskopijny glista Caenorhabditis elegans ma dokładnie 302, z których tylko osiem wytwarza dopaminę (DA) u hemafrodytów. Ekspresja ludzkiego genu kodującego białko związane z chorobą Parkinsona, alfa-synukleinę, w neuronach DA C. elegans powoduje neurodegenerację zależną od dawki i wieku.

Robaki wyrażające ludzką alfa-synukleinę w neuronach DA są izogeniczne i wyrażają zarówno GFP, jak i ludzką alfa-synukleinę pod promotorem transportera DA (Pdat-1). Obecność GFP służy jako łatwy do wizualizacji marker śledzenia neurodegeneracji DA u tych zwierząt. Początkowo wykazaliśmy, że neurodegeneracja DA wywołana przez alfa-synukleinę może być uratowana u tych zwierząt przez torsinA, białko o molekularnej aktywności opiekuńczej ¹. Co więcej, kandydujące geny związane z chorobą Parkinsona zidentyfikowane w naszym laboratorium za pomocą zakrojonych na szeroką skalę badań przesiewowych RNAi przy użyciu testu nieprawidłowego fałdowania alfa-synukleiny uległy następnie nadmiernej ekspresji w neuronach DA C. elegans. Ustaliliśmy, że pięć z siedmiu testowanych genów reprezentowało istotnych kandydatów na modulatory PD, ponieważ ratowały neurodegenerację DA ^indukowaną przez alfa-synukleinę 2. Dodatkowo, Lindquist Lab (to wydanie JoVE) przeprowadziło badania przesiewowe drożdży, w których toksyczność zależna od alfa-synukleiny jest wykorzystywana jako odczyt genów, które mogą zwiększać lub tłumić cytotoksyczność. Następnie zbadaliśmy geny kandydujące na drożdże w naszym teście neurodegeneracji indukowanej alfa-synukleiną C. elegans i z powodzeniem zwalidowaliśmy wiele z tych celów ^{3, 4}.

Nasza metodologia polega na generowaniu specyficznego dla neuronu wektora ekspresyjnego C. elegans DA za pomocą rekombinacyjnego klonowania kandydujących genów cDNA pod kontrolą promotora Pdat-1. Plazmidy te są następnie mikrowstrzykiwane robakom typu dzikiego (N2) wraz z wybieralnym markerem w celu pomyślnej transformacji. Uzyskuje się wiele stabilnych linii transgenicznych wytwarzających białko kandydujące w neuronach DA, a następnie niezależnie krzyżuje się je ze szczepem zwyrodnieniowym alfa-synukleiny i ocenia pod kątem neurodegeneracji, zarówno na poziomie zwierzęcym, jak i indywidualnym neuronu, w trakcie starzenia się.

Protokół

A. Budowa plazmidu ekspresji

Wymagane są dwa plazmidy: jeden do specyficznej tkankowo ekspresji interesującego genu, a drugi jako selektywny marker transformacji (chociaż plazmid markerowy jest zwykle dostępny w społeczności badawczej).

Eksperymentalny plazmid

1. Należy wybrać promotor, który ulega ekspresji w interesującym typie tkanki/komórki; w tym przypadku stosuje się promotor transportera DA (Pdat-1). Ten plazmid ekspresyjny został stworzony jako wektor docelowy kompatybilny z systemem Invitrogen Gateway (pDEST-DAT-1), aby umożliwić wstawienie dowolnego genu zainteresowania za promotorem poprzez klonowanie rekombinacyjne ¹.
2. cDNA interesującego genu jest amplifikowane metodą PCR przy użyciu starterów, które zawierają sekwencję rekombinacyjną Gateway att B. Amplifikowane cDNA jest najpierw rekombinowane w wektor dawcy pDONR201 w celu utworzenia wektora wejściowego, a następnie przekształcane w szczep E. coli DH5α. Po wybraniu udanych rekombinantów i mini-preparacyjnej izolacji DNA, wektor wejściowy jest rekombinowany w wektor docelowy pDEST-DAT-1 w celu wytworzenia plazmidu ekspresyjnego. Szczegółowe informacje na temat klonowania rekombinacyjnego są dostępne w podręczniku Invitrogen Gateway lub w Caldwell et al. ⁵.

Marker do wyboru plazmid

Transgeniczny plazmid markerowy składa się z wektora z promotorem napędzającym ekspresję białka fluorescencyjnego w oczywistej tkance. W tej konkretnej procedurze promotor unc-54 napędza ekspresję białka wiśni w mięśniach ściany ciała (Punc-54::cherry).

B. Wytwarzanie transgenicznych C. elegans poprzez mikroiniekcję

Zobacz powiązany artykuł JoVe : https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833

C. Krzyżówki genetyczne dla neurodegeneracji DA Analiza

1. Robaki są hodowane przy użyciu standardowych procedur ⁶.
2. Miejsce 10 Pdat-1::α-syn; Samce Pdat-1::GFP ^{1, 2} na płytce kojarzeniowej z 3-4 transgenicznymi hermafrodytami w stadium L4 (eksprymujących Pdat-1::gen X i Punc-54::cherry). Należy to wykonać indywidualnie dla każdej z trzech oddzielnych utworzonych stabilnych linii. Po dwóch dniach usuń samce.
3. Zbadaj pokolenie F1; jeśli jest kilka męskich potomków, krycie zakończyło się sukcesem.
4. Sklonuj 5 hermafrodytycznych zwierząt L4 z każdej krzyżówki, które wykazują zarówno marker fluorescencyjny Pdat-1::GFP (odziedziczony po męskim rodzicu), jak i marker mięśni ściany ciała Punc-54::cherry (odziedziczony po rodzicu hermafrodyty). Sklonowane zwierzęta muszą znajdować się w stadium L4, aby upewnić się, że nie zostały jeszcze skopulowane z samcami obecnymi na talerzu. Pozwól im na samokrzyżowanie się i wytwarzanie potomstwa F2.
5. Zwierzęta F2 wyprodukowane w kroku 3 są klonowane. W szczególności przenieś ~ 5-10 zwierząt, które wykazują oba markery fluorescencyjne, na ich własne indywidualne płytki. Przeprowadź badanie przesiewowe generacji F3 pod kątem płytek, na których 100% zwierząt wyraża GFP w neuronach DA, a niektóre zwierzęta wykazują ekspresję wiśni w komórkach mięśniowych ściany ciała. Zwierzęta te będą homozygotyczne pod względem Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP gen podczas stabilnego przekazywania nowo utworzonego transgenu (genu X).

D. Analiza neuronów dopaminergicznych

1. Przygotuj nową płytkę dla każdej z trzech linii utworzonych powyżej, a także Pdat-1::α-syn; Sam szczep Pdat-1::GFP. Pozwól im dorosnąć do dorosłości.
2. Przenieś 30-40 transgenicznych dorosłych osobników z każdej linii na świeży talerz. Pozwól im składać zarodki przez 4 godziny w temperaturze 20ºC.
3. Usuń dorosłe osobniki. Pozwól zarodkom rozwijać się przez 3-4 dni w temperaturze 20ºC, aż osiągną stadium L4.
4. Wybierz ~ 100 transgenicznych zwierząt L4 na płytkę zawierającą 0,04 mg / ml 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUDR). Ten analog nukleotydu blokuje rozwój następnego pokolenia poprzez hamowanie syntezy DNA, zapobiegając w ten sposób przytłoczeniu zwierząt doświadczalnych przez potomstwo ⁷. Chroń płyty FUDR przed światłem, ponieważ są one wrażliwe na światło.
5. Dorosłe zwierzęta będą analizowane w różnych dniach po złożeniu jaj. Odpowiednie dni analizy są określane empirycznie. Na przykład ustaliliśmy, że 77%, 87% i 90% Pdat-1::α-syn; Zwierzęta Pdat-1::GFP wykazują zdegenerowane neurony DA odpowiednio w 6, 7 i 10 dniu po rozwoju. Dlatego, jeśli przewidujemy, że interesujący nas transgen może nasilać neurodegenerację, przeanalizujemy to w 6 i / lub 7 dniu. Podobnie, transgeny, które mogą hamować neurodegenerację, będą analizowane w 7 i 10 dniu.
6. Przygotuj 4 świeże płatki agarozowe (w przeciwieństwie do płatków agarowych do mikroiniekcji, są one używane świeże i nie mogą wyschnąć). Ustaw dwa szkiełka mikroskopowe, w poprzek których znajduje się kawałek taśmy; Taśma służy jako przekładka dla podkładek o jednakowej grubości. Połóż trzecią prowadnicę między nimi na ławce (są ustawione trzy obok siebie). Umieść kroplę stopionej agarozy na środkowym szkiełku i szybko połóż kolejne szkiełko na wierzchu agarozy, prostopadle do i w poprzek wszystkich trzech szkiełków. Wykonaj kilka dodatkowych padów, pozostawiając dwie szkiełka razem, aż podkładka będzie gotowa do użycia.
7. Aby przeanalizować neurony DA robaków, umieść kroplę 6 μl lewamizolu 3 mM (środka znieczulającego) na szkle nakrywkowym o wymiarach 22 x 30 mm. Wybierz 40 dorosłych zwierząt (10 dodatkowych poza 30 do zdobycia) do kropli, a następnie odwróć szkło nakrywkowe na podkładkę agarozową. Powtórz te czynności dla każdego z pozostałych wierszy.
8. Oceń 30 zwierząt na linię pod kątem obecności każdego neuronu i ADE za pomocą mikroskopu złożonego z epifluorescencją i kostką filtrującą, która umożliwia wizualizację FITC lub GFP. Używamy kostki filtracyjnej Endow GFP HYQ (Chroma Technology). Zapisz dane na załączonym arkuszu punktacji. Zwierzęta typu dzikiego zachowają pełną fluorescencję GFP we wszystkich 4 neuronach i 2 ADE. Poszczególne zwierzęta wykazujące utratę neuronów DA są oceniane jako nie-WT lub "degenerujące". Podobnie, zakres zwyrodnienia można ocenić, licząc całkowitą liczbę utraconych neuronów u każdego zwierzęcia, a także w populacji.
9. Powtórz analizę jeszcze 2 razy (30 zwierząt więcej na linię na próbę). Całkowita liczba robaków wykazujących neurony DA typu dzikiego z trzech rund analiz jest uśredniona. Następnie przeprowadza się analizę statystyczną pod kątem neuroprotekcji za pomocą testu t studenta (p < 0,05) w celu porównania robaków kontrolnych (Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP) ze szczepami, które nadmiernie eksprymują geny kandydujące w neuronach DA.

Dyskusja

Zależna od wieku utrata neuronów dopaminowych jest kliniczną cechą charakterystyczną choroby Parkinsona i jest związana z akumulacją lub nieprawidłowym fałdowaniem białka zwanego alfa-synukleiną. Tutaj pokazujemy, jak znakować, za pomocą fluorescencyjnego transgenu, neurony dopaminergiczne C. elegans i naśladować neurodegenerację obserwowaną w chorobie Parkinsona poprzez koekspresję ludzkiej alfa-synukleiny w tych komórkach.

Ten film przedstawia metodologię wzrostu, krzyżowania genet...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Szkło nakrywkowe 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Szkiełka mikroskopowe	gładkie, 3x1"	Fisher Scientific	12-549
mikroskopu	fluorescencyjnego	Nikon Instruments	SMZ800
Rozwarstwianie	Mikroskop	Nikon Instruments	SMZ645
Mikroskop epifluorescencyjny		Nikon Instruments	Model E-800
Kostka filtra, GFP HYQ	Endow Bandpass	Chroma Technology Corp.