Zastosowanie testu degeneracji neuronów dopaminergicznych u C. elegans w celu walidacji potencjalnych genów choroby Parkinsona

Podsumowanie

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wykorzystania C. elegans do oceny neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych jako modelu choroby Parkinsona. Ponadto zastosowano przesiewy genetyczne w celu zidentyfikowania czynników, które albo nasilają degenerację, albo wykazują działanie neuroprotekcyjne.

Streszczenie

Udoskonalenie diagnostyki i leczenia choroby Parkinsona (PD) zależy od wiedzy na temat czynników podatności, które narażają określone populacje na ryzyko zachorowania. W procesie prób identyfikacji nowych czynników genetycznych związanych z PD naukowcy opracowali wiele list genów kandydackich, polimorfizmów i białek, które stanowią istotny postęp, jednak mechanizmy działania tych czynników pozostają nieokreślone. Nasza praca jest nakierowana na znaczne zawężenie takich list poprzez wykorzystanie zalet prostego modelu zwierzęcego. Podczas gdy ludzie posiadają miliardy neuronów, mikroskopijny niciel okrągły Caenorhabditis elegans posiada dokładnie 302, z czego tylko osiem produkuje dopaminę (DA) u hermafrodytów. Ekspresja ludzkiego genu kodującego białko związane z PD, alfa-synukleinę, w neuronach DA C. elegans prowadzi do neurodegeneracji zależnej od dawki i wieku.

Nicienie wykazujące ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny w neuronach DA są izogeniczne i wykazują ekspresję zarówno GFP, jak i ludzkiej alfa-synukleiny pod promotorem transportera DA (Pdat-1). Obecność GFP służy jako łatwo wizualizowany marker do śledzenia neurodegeneracji DA u tych zwierząt. Początkowo wykazaliśmy, że neurodegeneracja DA indukowana przez alfa-synukleinę może zostać zahamowana u tych zwierząt przez torsynę A, białko o aktywności chaperonowej ¹. Następnie w neuronach DA C. elegans nadekspresowano potencjalne geny związane z PD, zidentyfikowane w naszym laboratorium w ramach szeroko zakrojonych badań RNAi z wykorzystaniem testu błędnego fałdowania alfa-synukleiny. Ustaliliśmy, że pięć z siedmiu przetestowanych genów stanowi istotne potencjalne modulatory PD, ponieważ hamowały one indukowaną alfa-synukleiną neurodegenerację DA ². Dodatkowo zespół Lindquista (w niniejszym numerze JoVE) przeprowadził badania przesiewowe na drożdżach, w których toksyczność zależna od alfa-synukleiny była wykorzystywana jako odczyt dla genów mogących nasilać lub tłumić cytotoksyczność. Następnie zbadaliśmy te potencjalne geny drożdżowe w naszym teście neurodegeneracji indukowanej alfa-synukleiną u C. elegans i pomyślnie zwalidowaliśmy wiele z tych celów ^{3, 4}.

Nasza metodologia obejmuje generowanie wektora ekspresyjnego specyficznego dla neuronów DA u C. elegans przy użyciu klonowania rekombinacyjnego cDNA genów kandydackich pod kontrolą promotora Pdat-1. Plazmidy te są następnie wstrzykiwane metodą mikroiniekcji do glist typu dzikiego (N2), wraz z markerem selekcyjnym umożliwiającym identyfikację udanej transformacji. Uzyskujemy wiele stabilnych linii transgenicznych produkujących białko kandydackie w neuronach DA, które następnie są niezależnie krzyżowane ze szczepem degeneracyjnym alfa-synukleiny i oceniane pod kątem neurodegeneracji, zarówno na poziomie całego organizmu, jak i pojedynczych neuronów, w procesie starzenia.

Protokół

A. Konstrukcja plazmidu ekspresyjnego

Wymagane są dwa plazmidy: jeden do tkankowo specyficznej ekspresji badanego genu oraz drugi jako selekcyjny marker transformacji (choć plazmid markerowy jest zazwyczaj dostępny w obrębie społeczności badawczej).

Plazmid eksperymentalny

1. Wybierz promotor, który ulega ekspresji w interesującej tkance lub typie komórek; w tym przypadku zastosowano promotor transportera DA (Pdat-1). Plazmid ekspresyjny ten został stworzony jako wektor docelowy kompatybilny z systemem Invitrogen Gateway (pDEST-DAT-1), aby umożliwić wstawienie dowolnego interesującego genu poniżej promotora za pomocą klonowania rekombinacyjnego ¹.
2. cDNA interesującego genu poddaje się amplifikacji PCR przy użyciu starterów zawierających rekombinacyjną sekwencję Gateway att B. Amplifikowane cDNA jest najpierw rekombinowane do wektora donora pDONR201 w celu utworzenia wektora wejściowego, a następnie transformowane do szczepu E. coli DH5α. Po selekcji udanych rekombinantów i izolacji DNA metodą mini-prep, wektor wejściowy jest rekombinowany do wektora docelowego pDEST-DAT-1 w celu utworzenia plazmidu ekspresyjnego. Szczegółowe informacje na temat klonowania rekombinacyjnego znajdują się w instrukcji Invitrogen Gateway lub w pracy Caldwell i wsp. ⁵.

Plazmid z markerem selekcyjnym

Transgeniczny plazmid markerowy składa się z wektora z promotorem sterującym ekspresją białka fluorescencyjnego w określonej tkance. W tej konkretnej procedurze promotor unc-54 steruje ekspresją białka cherry w mięśniach ściany ciała (Punc-54::cherry).

B. Generowanie transgenicznych C. elegans poprzez mikroiniekcję

Zobacz powiązany artykuł JoVE : https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833

C. Krzyżówki genetyczne do analizy neurodegeneracji DA

1. Nicienie są hodowane zgodnie ze standardowymi procedurami ⁶.
2. Umieść 10 samców Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP ^{1, 2} na płytce do kojarzenia z 3-4 transgenicznymi hermafrodytami w stadium L4 (wykazującymi ekspresję Pdat-1::gene X oraz Punc-54::cherry). Procedurę tę należy przeprowadzić oddzielnie dla każdej z trzech stworzonych stabilnych linii. Po dwóch dniach usuń samce.
3. Obejrzyj pokolenie F1; jeśli pojawiło sięy kilka potomnych samców, oznacza to, że kojarzenie przebiegło pomyślnie.
4. Wyizoluj 5 hermafrodyt w stadium L4 z każdego krzyżowania, które wykazują zarówno fluorescencyczny marker Pdat-1::GFP (odziedziczony po ojcu), jak i fluorescencyczny marker mięśni ściany ciała Punc-54::cherry (odziedziczony po rodzicu hermafrodycie). Wyizolowane zwierzęta muszą znajdować się w stadium L4, aby mieć pewność, że nie kopulowały jeszcze z samcami obecnymi na płytce. Pozostaw je do samozapłodnienia w celu uzyskania potomstwa F2.
5. Zwierzęta F2 uzyskane w kroku 3 zostają wyizolowane. W szczególności przenieś ~5-10 osobników wykazujących oba markery fluorescencyjne na oddzielne płytki. Przesiewaj pokolenie F3 w poszukiwaniu płytek, na których 100% zwierząt wykazuje ekspresję GFP w neuronach DA, a część zwierząt wykazuje ekspresję cherry w komórkach mięśni ściany ciała. Zwierzęta te będą homozygotyczne pod względem genu Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP, jednocześnie stabilnie przekazując nowo stworzony transgen (gene X).

D. Analiza neuronów dopaminergicznych

1. Przygotuj świeżą płytkę dla każdej z trzech linii utworzonych powyżej, a także dla szczepu Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP. Pozostaw je do osiągnięcia wieku dorosłego.
2. Przenieś 30-40 dorosłych osobników transgenicznych z każdej linii na świeżą płytkę. Pozostaw je do zniesienia embrionów przez 4 godziny w temperaturze 20ºC.
3. Usuń dorosłe osobniki. Pozostaw embriony do rozwoju przez 3-4 dni w temperaturze 20ºC, aż osiągną stadium L4.
4. Przenieś ~100 transgenicznych zwierząt w stadium L4 na płytkę zawierającą 0,04 mg/ml 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUDR). Ten analog nukleotydu blokuje rozwój następnego pokolenia poprzez hamowanie syntezy DNA, zapobiegając tym samym zdominowaniu zwierząt doświadczalnych przez potomstwo ⁷. Chronić płytki z FUDR przed światłem, ponieważ substancja ta jest światłoczuła.
5. Dorosłe zwierzęta będą analizowane w różne dni po zniesieniu jaj. Odpowiednie dni analizy określa się empirycznie. Na przykład ustaliliśmy, że odpowiednio 77%, 87% i 90% zwierząt Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP wykazuje zdegenerowane neurony DA w 6., 7. i 10. dniu po rozwoju. Dlatego, jeśli przewidujemy, że badany transgen może nasilać neurodegenerację, przeprowadzimy analizę w 6. i/lub 7. dniu. Podobnie, transgeny, które mogą hamować neurodegenerację, będą analizowane w 7. i 10. dniu.
6. Przygotuj 4 świeże podkładki agarozowe (w przeciwieństwie do podkładek agarowych do mikroiniekcji, te są używane na świeżo i nie mogą wyschnąć). Rozłóż dwa szkiełka przedmiotowe z naklejonym kawałkiem taśmy; taśma służy jako dystans dla zapewnienia równiej grubości podkładek. Połóż trzecie szkiełko pomiędzy nimi na blacie (powinny być ułożone obok siebie w jednej linii). Nałóż kroplę stopionej agarozy na środkowe szkiełko i szybko połóż kolejne szkiełko na wierzchu agarozy, prostopadle i poprzecznie do wszystkich trzech szkiełek. Przygotuj kilka dodatkowych podkładek, pozostawiając dwa szkiełka razem, dopóki podkładka nie będzie gotowa do użycia.
7. Aby przeanalizować neurony DA u nicieni, nanieś kroplę 6 μl 3 mM lewamisolu (środka anestetycznego) na szkiełko nakrywkę o wymiarach 22 x 30 mm. Przenieś 40 dorosłych zwierząt (10 dodatkowo ponad 30 przeznaczonych do oceny) do kropli, a następnie odwróć szkiełko nakrywkę na podkładce agarozowej. Powtórz czynność dla każdej z pozostałych linii.
8. Oceń obecność każdego neuronu CEP i ADE u 30 zwierząt na linię, używając mikroskopu złożonego z epifluorescencją i kostką filtrującą umożliwiającą wizualizację FITC lub GFP. Używamy kostki filtrującej Endow GFP HYQ (Chroma Technology). Zapisz dane w załączonej karcie oceny. Zwierzęta typu dzikiego zachowają pełną fluorescencję GFP we wszystkich 4 neuronach CEP i 2 neuronach ADE. Pojedyncze zwierzęta wykazujące utratę neuronów DA ocenia się jako nietypowe dla WT lub „degenerujące”. Podobnie stopień degeneracji można ocenić poprzez zliczenie całkowitej liczby utraconych neuronów w każdym zwierzęciu oraz w całej populacji.
9. Powtórz analizę jeszcze 2 razy (kolejne 30 zwierząt na linię w każdej próbie). Wyciągnięta zostanie średnia z całkowitej liczby nicieni wykazujących neurony DA typu dzikiego z trzech serii analiz. Analizę statystyczną w celu oceny neuroprotekcji wykonuje się następnie za pomocą testu t-studenta (p < 0,05), aby porównać nicienie kontrolne (Pdat-1::α-syn; Pdat-1::GFP) ze szczepami nadekspresyjnymi dla genów kandydackich w neuronach DA.

Dyskusja

Zależna od wieku utrata neuronów dopaminergicznych jest klinyczną cechą charakterystyczną choroby Parkinsona i wiąże się z akumulacją lub błędnym fałdowaniem białka zwanego alfa-synukleiną. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak za pomocą fluorescencyjnego transgenu znakować neurony dopaminergiczne C. elegans oraz jak naśladować neurodegenerację obserwowaną w chorobie Parkinsona poprzez koekspresję ludzkiej alfa-synukleiny w tych komórkach.

Film ten przedstawia metodologię hodowli, kr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Kryszalki 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Przeszkła mikroskopowe	Gładkie, 3x1"	Fisher Scientific	12-549
Mikroskop do sekcji z fluorescencją	Mikroskop	Nikon Instruments	SMZ800
Mikroskop do sekcji	Mikroskop	Nikon Instruments	SMZ645
Mikroskop epifluorescencyjny	Mikroskop	Nikon Instruments	Model E-800
Kostka filtrująca, GFP HYQ	Endow Bandpass	Chroma Technology Corp.