Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe w kierunku agregacji amyloidu za pomocą elektroforezy żelu z półdenaturacją detergentu i agarozy

DOI:

10.3791/838

⸱

16 lipca 2008

 , 
1Whitehead Institute for Biomedical Research, 2Department of Biology, MIT - Massachusetts Institute of Technology, 3Howard Hughes Medical Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SDD-AGE jest użyteczną techniką do wykrywania i charakteryzowania polimerów podobnych do amyloidu w komórkach. Tutaj pokazujemy adaptację, która sprawia, że ta technika jest podatna na zastosowania na dużą skalę.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Agregacja amyloidu jest związana z licznymi patologiami nieprawidłowego fałdowania białek i leży u podstaw zakaźnych właściwości prionów, które są konformacyjnie samodoskonalącymi się białkami, o których uważa się, że odgrywają korzystne role w organizmach niższych. Amyloidy są niezwykle trudne do zbadania ze względu na ich nierozpuszczalność i niejednorodność strukturalną. Jednak rozdzielczość polimerów amyloidowych na podstawie wielkości i nierozpuszczalności detergentu była możliwa dzięki elektroforezie w żelu agarozowym (SDD-AGE) z częściowym denaturacją. Technika ta znajduje szerokie zastosowanie w wykrywaniu i charakteryzowaniu wariantów konformacyjnych amyloidu. W tym miejscu demonstrujemy adaptację tej techniki, która ułatwia jej wykorzystanie w zastosowaniach na dużą skalę, takich jak badania przesiewowe nowych prionów i innych białek amyloidogennych. Nowa metoda SDD-AGE wykorzystuje transfer kapilarny w celu zapewnienia większej niezawodności i łatwości użycia oraz pozwala na umieszczenie żelu o dowolnej wielkości. W ten sposób duża liczba próbek, przygotowanych z komórek lub oczyszczonych białek, może być przetwarzana jednocześnie pod kątem obecności nierozpuszczalnych w SDS konformerów znakowanych białek.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Część 1: Przygotowanie żelu

  1. Zamontuj tackę do odlewania żelu. Można stosować standardowe urządzenia do poziomej elektroforezy DNA. W przypadku dużej liczby próbek przygotowujemy płytę o wymiarach 20 cm x 24 cm z maksymalnie czterema 50-dołkowymi grzebieniami. Upewnij się, że płyta nie ma zadrapań, ponieważ mogą one zniekształcić obraz plamy.
  2. Stwórz 1,5% roztwór agarozy (średnia lub wysoka moc żelu, niskie EEO) w 1X TAE. Objętość powinna być wystarczająca, aby całkowicie zanurzyć zęby grzebienia - będziesz chciał załadować jak najwięcej próbki, aby zmaksymalizować wykrywanie. Mieszaninę należy podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
  3. Szybko dodaj SDS do 0,1% z 10% zapasu. Zamieszaj, aby wymieszać. Jeśli na tym etapie trochę agarozy stwardnieje, rozpuść ją ponownie za pomocą gorącej płyty i uważaj, aby uniknąć wrzenia.
  4. Wlej roztwór do tacki odlewniczej. Użyj grzebienia, aby zgrabić wszelkie bąbelki, ponieważ mogą one później przeszkadzać w przenoszeniu.
  5. Po stwardnieniu żelu usuń grzebienie i umieść żel w zbiorniku żelu. Całkowicie zanurz żel w 1X TAE zawierającym 0,1% SDS.

Część 2: Przygotowanie próbek

  1. W przypadku wysokoprzepustowej analizy lizatów drożdży zaczynamy od 2 ml kultur hodowanych przez noc z szybkim mieszaniem w 96-dołkowych blokach. W tym przypadku każda kultura wykazuje nadekspresję interesującego białka. Podczas analizy białek o niskiej liczebności należy użyć większych objętości kultur
  2. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 2000 RCF przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Ponownie zawieś komórki w wodzie i ponownie odwiruj.
  4. Zawiesić w 1 ml roztworu sferoplastycznego. Inkubować przez około 30 minut w temperaturze 30°C (skuteczność sferoplastyki można potwierdzić za pomocą mikroskopii).
  5. Wirować przy 800 RCF przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie usunąć supernatant.
  6. Zawiesić granulowane sferoplasty w 100 ml buforu do lizy.
  7. Przykryj blok taśmą i wiruj na wysokich obrotach przez 2 minuty.
  8. Granulki szczątków komórkowych przy 4000 RCF przez 2 min.
  9. Ostrożnie przenieść supernatant do nowego pojemnika, np. 96-dołkowej płytki PCR.
  10. W razie potrzeby należy określić stężenie białka w lizatach.
  11. Dodaj 4X bufor próbki do próbek, aby wygenerować lizaty zawierające 1X bufor próbki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Załaduj żel. W razie potrzeby zachowaj połowę objętości próbki i zagotuj ją do analizy SDS-PAGE. Aby później monitorować zakres transferu, dołącz wstępnie wybarwiony marker SDS-PAGE. Dodatkowo, marker masy cząsteczkowej składający się z bardzo dużych białek (np. ekstrakt z piersi kurczaka) może być wykorzystany do oszacowania wielkości rozwiązanych kompleksów.
  13. Uruchom przy niskim napięciu (długość żelu ≤ 3 V/cm), aż czoło barwnika osiągnie ~1 cm od końca żelu. Zajmie to kilka godzin. Ważne jest, aby żel pozostał chłodny; w przeciwnym razie dyfuzja białek o niskiej masie cząsteczkowej (np. monomerów) może ograniczyć ich wykrywanie.

Część 3: Transfer

  1. Wytnij kawałek nitrocelulozy do tych samych wymiarów co żel.
  2. Wytnij 20 kawałków bibuły GB004 i 8 kawałków bibuły GB002 do tych samych wymiarów co żel. Wytnij dodatkowy kawałek GB004, który będzie używany jako; Spraw, aby był o około 20 centymetrów szerszy niż żel.
  3. Zanurz nitrocelulozę, i 4 kawałki GB002 w 1X TBS.
  4. W plastikowym pojemniku złóż stos papierów w następujący sposób: 20 sztuk suchego GB004, następnie 4 kawałki suchego GB002, a następnie jeden kawałek wstępnie zwilżonego GB002. Połóż nitrocelulozę na wierzchu tego stosu.
  5. Krótko wypłucz żel na tacy odlewniczej w wodzie, aby usunąć nadmiar buforu. Następnie ostrożnie zacznij zsuwać żel z tacki na stos. Zsuwając żel z tacki, w razie potrzeby oblaj membranę TBS. Dodatkowy bufor zapobiega uwięzieniu pęcherzyków pod żelem. Do tego celu dobrze nadaje się pipeta transferowa.
  6. Po przeniesieniu żelu do stosu należy dokładnie sprawdzić, czy nie ma pęcherzyków. Jeśli są obecne, podnieś krawędź żelu i ponownie nałóż bufor, aż pęcherzyki będą mogły zostać wypracowane.
  7. Połóż pozostałe trzy wstępnie zwilżone kawałki GB002 na wierzchu żelu. Zapewnij dokładny kontakt między wszystkimi warstwami, mocno przetaczając pipetę po górnej części stosu.
  8. Umieść stos transferowy z dwiema podniesionymi tacami zawierającymi TBS. Ułóż wstępnie zwilżony w poprzek stosu tak, aby oba końce były zanurzone w TBS.
  9. Przykryj zmontowany stos transferowy dodatkową plastikową tacą o dodatkowym ciężarze (np. butelką wody o pojemności 500 ml).
  10. Pozwól, aby transfer trwał co najmniej trzy godziny lub przez noc.
  11. Po przeniesieniu membrana może być przetwarzana za pomocą standardowego Western blotting.

Roztwór sferoplastyczny
1,2 M D-sorbitol
0,5 mM MgCl2
20 mM Tris, pH 7,5
50 mM BME (dodaj świeży)
0,5 mg/ml Zymoliaza 100T (dodaj świeżą)

Bufor do lizy
100 mM Tris 7,5
50 mM NaCl
10 mM BME (dodaj świeży)
inhibitory proteazy (dodaj świeże)

4X Bufor próbki
2X TAE
20% glicerolu
8% SDS
bromofenol niebieski według preferencji

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SDD-AGE został po raz pierwszy opisany przez Kryndushkina i wsp.1 w celu zbadania opornych na SDS kompleksów prionów [PSI+] w drożdżach i od tego czasu znalazł szerokie zastosowanie w badaniu zarówno agregatów prionowych, jak i nieprionowych 2-9. Jednak przeniesienie białek do błony po elektroforezie w żelu agarozowym jest problematyczne i może skutkować zniekształconym obrazem plamy 5. Dodatkowo, najczęściej stosowana technika elektroblottingu zanurzeniowego wprowadza praktyczne ograniczenia co do wielkości żelu, a co za tym idzie liczby próbek, które można przetworzyć. Rozwiązaliśmy te problemy, stosując transfer kapilarny w dół 10, prostą procedurę, która wykorzystuje stos suchych bibuł do przenoszenia białek z żelu do membrany nitrocelulozowej. Transfer kapilarny zapobiega zniekształceniom i umożliwia łatwą obróbkę dużych żeli. Jest kilka rzeczy, które należy wziąć pod uwagę przed użyciem SDD-AGE. W przypadku próbek surowych (np. lizatów) konieczne jest immunowykrywanie określonych białek. SDD-AGE nie denaturuje w pełni kompleksów białkowych będących przedmiotem zainteresowania, więc białko(-a), które ma być wykryte, musi mieć znacznik epitopowy poza regionem amyloidogennym. Lizaty można generalnie przygotować tak, jak w przypadku zwykłej karty charakterystyki, z dwiema istotnymi różnicami. Po pierwsze, należy zachować większą ostrożność, aby zapobiec degradacji przez proteolizę. Zastosowane tutaj warunki częściowej denaturacji nie są wystarczające do inaktywacji proteaz, a także mogą sprawić, że białka docelowe będą bardziej podatne na proteolizę. Użyj kompletnego koktajlu inhibitorów proteazy w stężeniu co najmniej dwukrotnie większym niż zalecane. Po drugie, należy unikać podgrzewania próbek. Jeśli pożądana jest kontrola ujemna obejmująca całkowicie monomery, na przykład w celu potwierdzenia, że gatunki o dużej masie cząsteczkowej nie są spowodowane modyfikacjami kowalencyjnymi, można zastosować 10-minutową inkubację w temperaturze 95°C, która przywróci większość amyloidów do białka monomerycznego.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Simonowi Albertiemu za pomoc w opracowaniu tego protokołu. Praca ta była wspierana przez grant z National Institutes of Health (GM25874), Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (dla S.L.) oraz grant na szkolenie przeddoktoranckie National Science Foundation (dla R.H.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
zymoliaza 100TSeikagaku Corporation120493-1
Koktajl inhibitorów proteazy HaltThermo Fisher Scientific, Inc.78429
Bibuła proteinowa Hybond-C extra nitrocelulozaAmershamRPN303E
GB004Whatman, GE Healthcare10427926
GB002 (3MM Chr) bibułaWhatman, GE Healthcare3030-917
Agaroza (UltraPure)Invitrogen15510-027

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).
  2. Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION. J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).
  3. Allen, K. D., et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics. 169, 1227-1242 (2005).
  4. Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation. The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).
  5. Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
  6. Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase. Current Genetics. 49, 21-29 (2006).
  7. Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).
  8. Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability. Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).
  9. Douglas, P. M., et al. Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).
  10. Nagy, B., Costello, R., Csako, G. Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping. Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie agregacji amyloiduprzesiewanie prion wtransfer kapilarnykonformery nierozpuszczalne w SDSprzygotowanie lizatu dro d ykoktajl inhibitor w proteaztransfer na membran nitrocelulozowmarkery masy cz steczkowejpozioma elektroforeza DNA

Powiązane artykuły