Przesiewowe badanie agregacji amyloidu metodą półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z detergentem

Podsumowanie

SDD-AGE jest użyteczną techniką wykrywania i charakteryzacji polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Przedstawiamy tutaj adaptację, która sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań na szeroką skalę.

Streszczenie

Agregacja amyloidu wiąże się z licznymi patologiami wynikającymi z błędnego fałdowania białek i leży u podstaw właściwości zakaźnych prionów, które są białkami o konformacyjnej zdolności do samomotywacji (self-templating) i u których przypisuje się korzystne role u organizmów niższego rzędu. Amyloidy są znane z tego, że są niezwykle trudne do badania ze względu na ich nierozpuszczalność i heterogeniczność strukturalną. Jednak rozdzielenie polimerów amyloidu na podstawie wielkości i nierozpuszczalności w detergentach stało się możliwe dzięki zastosowaniu półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowo-detergentowym (SDD-AGE). Technika ta znajduje szerokie zastosowanie w wykrywaniu i charakteryzacji wariantów konformacyjnych amyloidu. W niniejszej pracy prezentujemy adaptację tej metody, która ułatwia jej wykorzystanie w zastosowaniach na szeroką skalę, takich jak przesiewy w poszukiwaniu nowych prionów i innych białek amyloidogennych. Nowa metoda SDD-AGE wykorzystuje transfer kapilarny w celu zwiększenia niezawodności i łatwości obsługi oraz pozwala na zastosowanie żeli o dowolnym rozmiarze. W ten sposób można jednocześnie przetwarzać dużą liczbę próbek, przygotowanych z komórek lub oczyszczonych białek, w celu wykrycia obecności nierozpuszczalnych w SDS konformerów białek znakowanych.

Protokół

Część 1: Przygotowanie żelu

1. Zmontuj formę do odlewania żelu. Można użyć standardowego sprzętu do poziomej elektroforezy DNA. W przypadku dużej liczby próbek przygotowujemy płytkę o wymiarach 20 cm x 24 cm z maksymalnie czterema grzebieniami 50-dołkowymi. Upewnij się, że płytka nie posiada zarysowań, ponieważ mogą one zniekształcić obraz po transferze.
2. Przygotuj 1,5% roztwór agarozy (o średniej lub wysokiej wytrzymałości żelu, niskiej zawartości EEO) w 1X TAE. Objętość powinna być wystarczająca do całkowitego zanurzenia zębów grzebienia – należy nałożyć jak najwięcej próbek, aby zmaksymalizować detekcję. Podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
3. Szybko dodaj SDS z roztworu stokowego 10% do stężenia końcowego 0,1%. Zamieszaj ruchem wirowym. Jeśli w tym kroku część agarozy stężeje, rozpuść ją ponownie za pomocą płyty grzejnej, uważając, aby nie doprowadzić do wrzenia.
4. Wlej roztwór do formy odlewniczej. Użyj grzebienia, aby usunąć pęcherzyki powietrza, ponieważ mogą one później zakłócić transfer.
5. Po stężeniu żelu wyjmij grzebienie i umieść żel w kuwecie elektroforetycznej. Całkowicie zanurz żel w 1X TAE zawierającym 0,1% SDS.

Część 2: Przygotowanie próbek

1. W przypadku wysokoprzepustowej analizy lizatów drożdży rozpoczynamy od kultur o objętości 2 ml, hodowanych przez noc z szybkim mieszaniem w blokach 96-dołkowych. W tym przypadku każda kultura nadekspresuje białko docelowe. Przy analizie białek występujących w niskich stężeniach należy użyć większych objętości kultur.
2. Zbiór komórek przeprowadza się poprzez wirowanie przy 2000 RCF przez 5 min w temperaturze pokojowej.
3. Komórki resuspenduje się w wodzie i ponownie wiruje.
4. Resuspenduje się je w 1 ml roztworu do sferoplastowania. Inkubuje się przez około 30 min w 30°C (wydajność sferoplastowania można potwierdzić za pomocą mikroskopii).
5. Wiruje się przy 800 RCF przez 5 min w temperaturze pokojowej. Całkowicie usuwa się nadsącz.
6. Osad sferoplastów resuspenduje się w 100 ml buforu do lizy.
7. Blok zakleja się taśmą i miesza w wortexie z dużą prędkością przez 2 min.
8. Zanieczyszczenia komórkowe osadza się przez wirowanie przy 4000 RCF przez 2 min.
9. Nadsącz ostrożnie przenosi się do nowego naczynia, np. płytki PCR 96-dołkowej.
10. W razie potrzeby określa się stężenie białka w lizatach.
11. Do próbek dodaje się 4X bufor do próbek, aby uzyskać lizaty zawierające 1X bufor do próbek. Inkubuje się przez 5 min w temperaturze pokojowej.
12. Nakłada się na żel. W razie potrzeby połowę objętości próbki należy zachować i zagotować do analizy SDS-PAGE. Aby później monitorować stopień transferu, należy dołączyć wstępnie zabarwiony marker SDS-PAGE. Dodatkowo, do szacowania rozmiarów rozdzielonych kompleksów można użyć markera masy cząsteczkowej składającego się z bardzo dużych białek (np. ekstraktu z mięśnia piersiowego kurczaka).
13. Elektroforezę prowadzi się przy niskim napięciu (≤ 3 V/cm długości żelu), aż front barwnika dotrze do ok. 1 cm od końca żelu. Proces ten trwa kilka godzin. Ważne jest, aby żel pozostał chłodny; w przeciwnym razie dyfuzja białek o niskiej masie cząsteczkowej (np. monomerów) może ograniczyć ich detekcję.
    

Część 3: Transfer

1. Wytnij kawałek nitrocelulozy o wymiarach odpowiadających wymiarom żelu.
2. Wytnij 20 kawałków papieru do transferu GB004 oraz 8 kawałków papieru GB002 o wymiarach odpowiadających wymiarom żelu. Wytnij dodatkowy kawałek GB004 do wykorzystania jako knot; powinien on być o około 20 cm szerszy niż żel.
3. Zanurz nitrocelulozę, knot oraz 4 kawałki GB002 w 1X TBS.
4. W plastikowym pojemniku ułóż stos papierów w następującej kolejności: 20 suchych kawałków GB004, następnie 4 suche kawałki GB002, a na koniec jeden namoczony wcześniej kawałek GB002. Na wierzchu tego stosu połóż nitrocelulozę.
5. Krótko opłucz żel na tacy odlewniczej wodą, aby usunąć nadmiar buforu do elektroforezy. Następnie ostrożnie zacznij przesuwać żel z tacy na stos. Podczas przesuwania żelu zwilżaj membranę buforem TBS w razie potrzeby. Dodatkowy bufor pomaga zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza pod żelem. Do tego celu dobrze nadaje się pipeta transferowa.
6. Po przeniesieniu żelu na stos dokładnie sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli jakieś wystąpią, unieś krawędź żelu i ponownie nanieś bufor, aż pęcherzyki zostaną usunięte.
7. Połóż pozostałe trzy namoczone kawałki GB002 na wierzchu żelu. Aby zapewnić dokładny kontakt między wszystkimi warstwami, mocno przeturlaj pipetą po wierzchu stosu.
8. Umieść stos transferowy pomiędzy dwiema podwyższonymi tacami zawierającymi TBS. Połóż namoczony knot na stosie w taki sposób, aby oba końce knota były zanurzone w TBS.
9. Przykryj złożony stos transferowy dodatkową plastikową tacą z obciążeniem (np. butelką wody o pojemności 500 ml).
10. Pozostaw transfer na minimum trzy godziny lub na całą noc.
11. Po transferze membranę można poddać standardowej procedurze Western blotting.

Roztwór do sferoplastyki
1.2 M D-sorbitol
0.5 mM MgCl₂
20 mM Tris, pH 7.5
50 mM BME (dodać świeżo)
0.5 mg/ml Zymolyase 100T (dodać świeżo)

Bufor do lizy
100 mM Tris 7.5
50 mM NaCl
10 mM BME (dodać bezpośrednio przed użyciem)
inhibitory proteaz (dodać bezpośrednio przed użyciem)

4X Bufor do próbek
2X TAE
20% glicerolu
8% SDS
błękit bromofenolowy według uznania

Dyskusja

Metoda SDD-AGE została po raz pierwszy opisana przez Kryndushkina i współpracowników¹ w celu badania kompleksów prionu [PSI+] w drożdżach odpornych na SDS, a od tego czasu znajduje szerokie zastosowanie w badaniu agregatów prionowych i nieprionowych ^2-9. Jednakże transfer białek na membranę po elektroforezie w żelu agarozowym jest problematyczny i może prowadzić do zniekształcenia obrazu na blocie ⁵. Ponadto powszechnie stosowana technika zanurzeniowego transferu elektroforetycznego wprowadza praktyczne ograniczenia dotyczące rozmiaru żelu, a tym samym liczby próbek, które można przetworzyć. Rozwiązaliśmy te problemy, stosując transfer kapilarny w dół ¹⁰, prostą procedurę wykorzystującą stos suchych papierów do transferu w celu przeniesienia białek z żelu na membranę nitrocelulozową. Transfer kapilarny zapobiega zniekształceniom i umożliwia łatwe przetwarzanie dużych żeli. Przed zastosowaniem SDD-AGE należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. W przypadku próbek surowych (np. lizatów) konieczna jest immunodetekcja specyficznych białek. SDD-AGE nie denaturuje w pełni badanych kompleksów białkowych, dlatego białka poddawane detekcji muszą posiadać znacznik epitopowy poza regionem amyloidogennym. Lizaty można zazwyczaj przygotowywać tak samo, jak do standardowej elektroforezy SDS-PAGE, z dwoma istotnymi różnicami. Po pierwsze, należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec degradacji proteolitycznej. Warunki częściowej denaturacji stosowane w tej metodzie nie są wystarczające do inaktywacji proteaz, a ponadto mogą zwiększyć podatność białek docelowych na proteolizę. Należy użyć kompletnego koktajlu inhibitorów proteaz w stężeniu co najmniej dwukrotnie wyższym od zalecanego. Po drugie, należy unikać podgrzewania próbek. Jeśli wymagana jest ujemna kontrola złożona wyłącznie z monomerów, na przykład w celu potwierdzenia, że formy o wysokiej masie cząsteczkowej nie wynikają z modyfikacji kowalencyjnych, można zastosować 10-minutową inkubację w 95°C, co przywróci większość amyloidów do postaci białka monomerowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
zymolyaza 100T	Seikagaku Corporation	120493-1
koktajl inhibitorów proteaz Halt	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78429
nitroceluloza Hybond-C extra	Amersham	RPN303E
papier do transferu GB004	Whatman, GE Healthcare	10427926
papier do transferu GB002 (3MM Chr)	Whatman, GE Healthcare	3030-917
agaroza (UltraPure)	Invitrogen	15510-027