Kilka klipów wideo demonstrujących mikroskopię w kontraście fazowym i DIC zostało pobranych z innego artykułu wideo zatytułowanego <a href="http://www.jove.com/details.stp?ID=197">Layers of Symbiosis</a>.&nbsp; JoVE z wdzięcznością uznaje ten wkład przekazany przez laboratorium Leadbettera.&nbsp;

Pełny protokół tekstowy dla tej metody eksperymentalnej jest dostępny w <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0401/current/abstract ">Current Protocols in Cell Biology.</a>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

mikroskopia kontrastowa fazowa i mikroskopia kontrastowa interferencyjna (dic)

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Mikroskopia fazowo-kontrastowa jest często stosowana w celu uzyskania kontrastu w przypadku przezroczystych, nieabsorbujących światła preparatów biologicznych. Technika ta została opracowana przez Zernike w 1942 roku, za co otrzymał on Nagrodę Nobla. Mikroskopia DIC, wprowadzona pod koniec lat 60. XX wieku, zyskała popularność w badaniach biomedycznych, ponieważ uwydatnia krawędzie szczegółów strukturalnych preparatu, umożliwia uzyskanie wysokorozdzielczych przekrojów optycznych grubych próbek, w tym komórek tkankowych, jaj i embrionów, oraz nie wykazuje efektu halo typowego dla obrazów fazowo-kontrastowych. Niniejszy protokół omawia zasady i praktyczne zastosowania tych technik mikroskopowych.

Niniejszy protokół przedstawia zasady i praktyczne zastosowania mikroskopii fazowo-kontrastowej oraz mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC)

Mikroskopia kontrastowa fazowa i mikroskopia kontrastowa interferencyjna (DIC)

Mikroskopia kontrastowa jest często stosowana w celu uzyskania kontrastu w przypadku przezroczystych, nieabsorbujących światła preparatów biologicznych. Technikę tę odkrył ...

Mikroskopia świetlna jest jednym z, jeśli nie najważniejszym narzędziem w dziedzinie badań biomedycznych. W zależności od zastosowania, do obserwacji preparatów pożądane są różne tryby oświetlenia. Niniejszy film zaprezentuje dwa optyczne tryby oświetlenia przeświecającego: kontrast fazowy oraz mikroskopię DIC, czyli kontrast interferencyjny różnicowy.Witam, nazywam się Victoria San Frolic i reprezentuję centralne laboratorium obrazowania optycznego na University of Texas Health Science Center w San Antonio. Dzisiaj pokażę Państwu, jak prawidłowo obserwować preparaty z wykorzystaniem mikroskopii fazowo-kontrastowej oraz mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC). Zacznijmy zatem.Standardowa mikroskopia w polu jasnym nie jest odpowiednia do obserwacji przezroczystych i bezbarwnych preparatów. Mikroskopia fazowo-kontrastowa jest często stosowana w celu uzyskania kontrastu w przypadku przezroczystych, nieabsorbujących światła preparatów biologicznych. Technika ta została opracowana w 1942 roku przez Zernike, który za to osiągnięcie otrzymał Nagrodę Nobla.Mikroskop fazowo-kontrastowy to jasnopolowy mikroskop świetlny wyposażony w specjalne obiektywy do kontrastu fazowego, które zawierają płytkę lub pierścień fazowy, oraz pierścień kondensora zamiast przysłony. Pierścień ten znajduje się zazwyczaj w obrotowej głowicy kondensora, a jego rozmiar należy dobrać do poszczególnych obiektywów. Po ustawieniu oświetlenia Köhlera należy wybrać odpowiedni obiektyw fazowy, a następnie ustawić właściwy pierścień fazowy w kondensorze.Po prawidłowym ustawieniu pierścienia fazowego obiektywu i pierścienia kondensora tak, aby były współśrodkowe i nakładały się na siebie, możemy obejrzeć preparat i odpowiednio dostroić ostrość. Zaprezentujmy zatem, jak wygląda kontrast fazowy w mikroskopie. Oto widok przekroju wątroby szczura.Pod mikroskopem w kontraście fazowym. Metoda ta poprawia widoczność materiału biologicznego, zmieniając kontrast z różnych odcieni szarości na odcienie od czerni do bieli. Zauważą Państwo jednak, że preparaty są otoczone aureolą, która zaciera drobne struktury.Ta aureola jest artefaktem oświetlenia przez pierścień fazowy. Teraz zauważą Państwo, że po przełączeniu na pole jasne, preparat ten jest bardzo trudny do obserwacji. Po powrocie do kontrastu fazowego możemy wyraźnie zobaczyć strukturę i kształt komórek w tkance wątroby szczura od czasu wprowadzenia tej metody pod koniec lat 60. XX wieku.Mikroskopia kontrastowa różnicowa, znana jako DIC, zyskała popularność w badaniach biomedycznych dzięki możliwości uzyskiwania obrazów struktur o wysokiej rozdzielczości poprzez wzmacnianie kontrastu na granicach faz; otrzymany obraz stanowi bardzo cienki przekrój optyczny. W rzeczywistości zdolność DIC do tworzenia przekrojów optycznych sprawiła, że stała się ona użyteczną metodą oświetlenia światłem przechodzącym, uzupełniającą mikroskopię konfokalną. Mikroskop DIC jest mikroskopem świetlnym w polu jasnym, wzbogaconym o następujące elementy: polaryzator umieszczony pomiędzy źródłem światła a kondensorem.Pryzmat rozdzielający wiązkę DIC w części kondensora, pryzmat łączący wiązkę DIC tuż za obiektywem oraz analizator w przestrzeni nieskończonej przed obiema soczewkami. Aby uzyskać najlepsze parametry optyki DIC, należy najpierw ustawić mikroskop świetlny zgodnie z zasadą oświetlenia Köhlera, a następnie umieścić elementy DIC w torze optycznym. Światło ze źródła przechodzi przez polaryzator, a następnie jest rozdzielane przez pierwszy pryzmat.Te sparowane wiązki biegną blisko siebie. Jeśli obie wiązki przechodzą przez ten sam materiał w preparacie, to po ponownym połączeniu przez drugi pryzmat nie interferują ze sobą i w związku z tym wydają się szare. Jednakże na krawędzi struktury jedna z wiązek pary przechodzi przez inny materiał niż jej odpowiednik i ulega zmianie.Kiedy wiązki te zostaną ponownie połączone przez drugi pryzmat, wystąpi interferencja konstruktywna, tworząca jasny punkt, lub destruktywna, tworząca ciemny punkt. Oto obraz okrzemek w kontraście DIC. Zauważą Państwo, że drobne szczegóły struktury okrzemek są wyraźnie widoczne.Jeśli jednak usuniemy optykę DIC, szczegóły te znikają. Kontrast w obrębie preparatu jest jasny po jednej stronie i ciemniejszy po drugiej. Daje to wrażenie topografii, lecz w rzeczywistości jest to złudzenie.Kierunek efektu rzucanego cienia można odwrócić, obracając polaryzator przez punkt przecięcia do przeciwnego kontrastu. Przeanalizowaliśmy właśnie tryby optyczne kontrastu fazowego i DIC. Przypominamy, że eliminacja kontrastu fazowego wzmacnia kontrast badanych obiektów, zmieniając czernie w biele, co jest przydatne do obserwacji preparatów bezbarwnych i przezroczystych.DIC generuje również kontrast w preparacie. Odbywa się to poprzez tworzenie obrazu o wysokiej rozdzielczości cienkiego przekroju optycznego. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w pracy z mikroskopią.

phase-contrast-and-differential-interference-contrast-dic-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroskopia kontrastu fazowego i różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC)

University of Texas Health Science Center at San Antonio (UTHSCSA).  Ten protokół podkreśla zasady i praktyczne zastosowania mikroskopii z kontrastem fazowym i różnicowym (DIC)

Summary

Mikroskopia fazowo-kontrastowa jest często stosowana w celu uzyskania kontrastu w przypadku przezroczystych, nieabsorbujących światła preparatów biologicznych. Technika ta została opracowana przez Zernike w 1942 roku, za co otrzymał on Nagrodę Nobla. Mikroskopia DIC, wprowadzona pod koniec lat 60. XX wieku, zyskała popularność w badaniach biomedycznych, ponieważ uwydatnia krawędzie szczegółów strukturalnych preparatu, umożliwia uzyskanie wysokorozdzielczych przekrojów optycznych grubych próbek, w tym komórek tkankowych, jaj i embrionów, oraz nie wykazuje efektu halo typowego dla obrazów fazowo-kontrastowych. Niniejszy protokół omawia zasady i praktyczne zastosowania tych technik mikroskopowych.

Mikroskopia kontrastowa fazowa i mikroskopia kontrastowa interferencyjna (DIC)

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Protokół

Oświadczenia

Podziękowania

Przedruki i uprawnienia

Tagi