Prosimy odwiedzić stronę <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-457-5_18">Springer Protocols</a>, aby dowiedzieć się więcej o inżynierii baculowirusów jako czynników owadobójczych oraz o technikach mikroaplikacji stosowanych w tym badaniu.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

protokoły zakażania larw motyli (lepidoptera) baculowirusami przy użyciu mikroaplikatora

Protocols for Microapplicator-assisted Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculowirusy są szeroko stosowane zarówno jako wektory ekspresji białek, jak i środki do zwalczania szkodników owadziego pochodzenia. W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób larwy motyli można zakażać za pomocą technik mikroaplikatora – w obrębie przewodu pokarmowego za pomocą poliedrów baculowirusa oraz w hemolimfy za pomocą wirusa pączkującego. Towarzysząca temu sekcja Springer Protocols zawiera przegląd cyklu życiowego baculowirusów oraz ich zastosowania jako środków owadobójczych. Formułowanie i aplikacja baculowirusów w celu zwalczania szkodników zostały opisane w innej publikacji.

W niniejszym filmie prezentujemy dwie techniki z użyciem mikroaplikatora do zakażania larw motyli z rzędu Lepidoptera baculowirusem w celu określenia efektywności owadobójczej.

Protokoły zakażania larw motyli (Lepidoptera) baculowirusami przy użyciu mikroaplikatora

Bakulowirusy są szeroko stosowane zarówno jako wektory ekspresji białek, jak i środki do zwalczania szkodniczych owadów. Niniejsze nagranie pokazuje, w jaki sposób larwy motyli mogą zostać...

Podczas gdy specyficzny dla stawonogów wirus baculovirus jest wykorzystywany jako standardowe narzędzie badawcze w systemach ekspresji białek eukariotycznych, jest on również rozwijany jako bezpieczny dla środowiska środek owadobójczy, który może zwalczać owady roślinożerne, takie jak lepidoptera, w naturze. Larwy lepidoptera zostają zainfekowane przez wirusy baculovirus podczas spożywania zainfekowanych liści. Larwy lub gąsienice przyjmują wirusa baculovirus w formie znanej jako wielościen, który stanowi kompleks cząsteczek wirusa zamkniętych w dużej krystalicznej strukturze białkowej chroniącej wirusa przed wysychaniem.Po zainfekowaniu larwy, wirus rozprzestrzenia infekcję w obrębie owada. Wirus przejmuje mechanizmy syntezy kwasów nukleinowych i białek gospodarza, aby produkować więcej wirionów i poliedrów. W końcu larwy zostają tak silnie zainfekowane wirusem, że rozkładają się w gęstą masę poliedrów, która ścieka na powierzchnie roślin zjadane przez owady, a następnie cykl rozpoczyna się od nowa, aby określić skuteczność owadobójczą konkretnego Baca.Techniki mikroaplikacji szczepów Avir oraz bioanalizy mogą być stosowane łącznie. Larwy Leid dorin można zakażać poprzez wstrzyknięcie wirusa bezpośrednio do HemosIL lub jamy ciała, a następnie ocenić wskaźniki śmiertelności. Ponadto larwy mogą być zakażane polihedrami za pomocą wstrzykiwania wspomaganego mikroaplikatorem doustnym, co pozwala na badanie czasu zakażenia jelit oraz innych tkanek.Witam, jestem Wendy Sparks z laboratorium Briana E. Boninga na Wydziale Entomologii Uniwersytetu Stanowego Iowa oraz z Boning Snap. Dzisiaj zaprezentujemy dwie procedury zakażania laboratoryjnych osobników *Drosophila melanogaster* wirusem 백락 (backlog virus). Obie metody wykorzystują mikroaplikator.Najpierw pokażę, jak użyć mikroaplikatora do podania wirusa do głowy poprzez przedsionek. Następnie pokażę, jak użyć mikroaplikatora do podania polihidratu do środkowej części gardła poprzez pysk. Zatem zacznijmy.W przypadku opracowywania wirusów z rodzaju balo w celach owadobójczych, zazwyczaj zawierają one gen poliedru, aby ułatwić infekcję doustną larw szkodników. Niemniej jednak, zdarzają się sytuacje, w których istnieją powody, by przetestować wirusa baccula pozbawionego poliedru pod kątem potencjalnych efektów owadobójczych lub aby ominąć przewód pokarmowy owada. W takim przypadku, przed rozpoczęciem testu, można przeprowadzić wstrzyknięcie wirusa przy użyciu mikroaplikatora w celu zainfekowania larw.Miano roztworu roboczego wirusa zbuforowanego należy oznaczyć za pomocą metody płytek wirusowych lub testów rozcieńczeń końcowych. W eksperymentach fizjologicznych typowe są iniekcje w dawce 5 × 10⁴ PFU na jeden H VNS piątego stadium larwalnego. Aby rozpocząć ten bioassay, należy nalać każde rozcieńczenie wirusa zbuforowanego do plastikowej strzykawki Herkule o pojemności 1 cc z ostrzem o rozmiarze 28.5 lub 32 G.Zazwyczaj dla każdej larwy można użyć od 1 do 3 µL roztworu wirusa o mianie od 10⁷ do 10⁸ na ml, tak że pobranie od 300 do 500 µL do strzykawki jest wystarczające w większości przypadków. Następnie należy usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki, trzymając ją pionowo, aby powietrze przemieściło się do końcówki igły, i wypuścić je.Następnie przymocuj strzykawkę do rurki wsporczej strzykawki. Teraz ustaw objętość na 1,0 µl. Przed podaniem każdej kropli należy najpierw skalibrować jednostkę sterującą mikroaplikatora w mikroprocesorowej jednostce sterującej, aby upewnić się, że dozowana jest prawidłowa objętość; prędkość dozowania kropli można ustawić w zakresie od 0 do 9.Zazwyczaj stosuje się zakres od zera do jednego. Naciśnij przełącznik nożny, aby upewnić się, że roztwór jest dozowany prawidłowo. Pamiętaj, że jeśli dozowany jest zbyt duży объем roztworu lub jeśli aplikacja przebiega zbyt wolno, ustawienia objętości i prędkości można regulować do momentu, aż odpowiednia ilość roztworu będzie aplikowana z właściwą prędkością.Jestem teraz gotowy do rozpoczęcia iniekcji w celu wywołania infekcji H VNS. Zazwyczaj iniekcje wykonuje się u larw we wczesnym piątym stadium rozwojowym, ponieważ większy rozmiar późniejszych stadiów ułatwia proces wstrzykiwania. Wprowadź końcówkę igły przez stopę jednej z odnóży krocznych do jam ciała.Należy pamiętać, że podczas wprowadzania końcówki igły do przedsionka, należy zmienić pozycję ciała larwy, aby uniknąć uszkodzenia jelita i ściany ciała. Następnie należy nacisnąć przełącznik nożny cztery razy, aby podać 4 µL roztworu wirusa do hemocelu. Po zakończeniu iniekcji wszystkie larwy należy przenieść z powrotem do inkubatora w temperaturze 28 °C. Należy często sprawdzać, czy nie ma martwych larv oraz upewnić się, że przeżyłe larwy mają dostęp do odpowiedniej diety.Mimo że późne stadia larwalne nie giną w wyniku uszkodzenia kutykuli powstałego podczas wstrzykiwania, larwy należy mimo to sprawdzić 24 godziny po zabiegu w przypadku uszkodzenia jelita, które mogłoby wynikać z infekcji bakteryjnej. Tę wczesną śmiertelność należy wykluczyć z analizy danych. W przypadku stosowania bioanalizy z pomocą mikroaplikatora z użyciem wirusa w celu wyznaczenia dawki letalnej, bioanalizę należy powtórzyć trzy lub cztery razy w oddzielnych próbach.Użyj 30 osobników na dawkę dla każdego wirusa lub grupy kontrolnej. Użyj odpowiedniego programu do analizy probitowej, takiego jak polo lub SAS, aby obliczyć wartości lc 50, 95% przedziały ufności oraz odpowiednie statystyki. Ten biotest może być również wykorzystany do wyznaczenia wartości czasu przeżycia ST 50 po inokulacji stałą dawką wirusa.W tym przypadku śmiertelność larw ocenia się co cztery do ośmiu godzin, przeprowadzając częstsze obserwacje. Jeśli wskaźnik śmiertelności jest wysoki, mediany czasu przeżycia w granicach przedziału ufności 95% oblicza się za pomocą estymatora Kaplana-梅ера, korzystając z programu S-Plus lub SAS. Harran zaprezentował Państwu bioanalizę wspomaganą mikroaplikatorem z użyciem wirusa zbuforowanego.Przedstawię teraz analizę. W przypadku stosowania poliedrów, doustna inokulacja poliedrów bezpośrednio do jelita owada jest wykorzystywana, gdy kluczowe jest dokładne określenie czasu zakażenia. Na przykład podczas monitorowania rozprzestrzeniania się wirusa w organizmie owada, aby rozpocząć tę analizę, należy zawiesić poliedry w obojętnym wypornościowo roztworze gliceryny i wody w proporcji 3:2 w stężeniu od 10 do 300.Wielościenne ciało inkluzyjne (polyhedra) można wykorzystać na przykład w przypadku poczwarki czwartego stadium. Następnie należy nabić ten roztwór do plastikowej lub szklanej strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 CC z tępą igłą o rozmiarze 32 G. Pod mikroskopem należy umieścić strzykawkę na rurce wsporczej mikroaplikatora.Przytrzymaj czwartą lub piątą larvę w stadium gwiazdy, wprowadź igłę przez otwory gębowe do przedniego odcinka jelita środkowego, a następnie podaj poliedra. Technika ta wymaga pewnej wprawy. Po pierwsze, przy założonych rękawiczkach może być trudno utrzymać larwy, nie zgniatając ich.Po drugie, przeprowadzenie igły obok aparatów gębowych wymaga pewnej wprawy. Zalecamy przećwiczenie inokulacji około 30 larw za pomocą PBS. Jeśli dojdzie do przebicia jelita, będzie to oczywiste, ponieważ larwy ulegną melanizacji i szybko poczernieją.Ponownie, ponieważ inokulacja doustna wspomagana mikroaplikatorem pozwala na określenie dokładnego czasu zakażenia, metoda ta jest najbardziej przydatna w eksperymentach, w których czas infekcji jest istotny dla ustalenia sposobu rozprzestrzeniania się wirusa w organizmie owada. Na przykład wirusy wykazujące aktywność beta-galaktozydazy mogą być podane doustnie larwom, które następnie poddaje się sekcji w różnych punktach czasowych, aby ustalić, które tkanki zostają zainfekowane. Przedstawimy dwa sposoby zakażenia owadów z użyciem mikroaplikatora. Pierwszym z nich jest bezpośrednia inokulacja poprzez odnoga kroczną, co pozwala pominąć fizjologię jelita i ocenić śmiertelność oraz czas przeżycia po zakażeniu badanym wirusem.Drugą techniką była bezpośrednia inokulacja do jelita środkowego z wykorzystaniem poliedrów. Pozwala to na dostarczenie bardzo precyzyjnej dawki bezpośrednio do jelita środkowego, a także na ścisłą kontrolę czasu wystąpienia zdarzenia. Następnie można badać śmiertelność oraz inne fenotypy wirusa.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że larwy zabite wirusem baula są zazwyczaj delikatne i mogą łatwo pęknąć, uwalniając wirusa. Należy zatem wysterylizować powierzchnie robocze oraz w odpowiedni sposób zutylizować skażone rękawiczki i materiały jednorazowe, aby zapobiec kontaminacji. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie. Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

protocols-for-microapplicator-assisted-infection-lepidopteran-larvae

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokoły wspomaganego mikroaplikatorem zakażenia larw Lepidoptera bakulowirusem

Iowa State University.  W tym filmie demonstrujemy dwie techniki mikroaplikatora używane do infekowania larw lepidoptera bakulowirusem w celu określenia skuteczności insektycydów.

Summary

Baculowirusy są szeroko stosowane zarówno jako wektory ekspresji białek, jak i środki do zwalczania szkodników owadziego pochodzenia. W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób larwy motyli można zakażać za pomocą technik mikroaplikatora – w obrębie przewodu pokarmowego za pomocą poliedrów baculowirusa oraz w hemolimfy za pomocą wirusa pączkującego. Towarzysząca temu sekcja Springer Protocols zawiera przegląd cyklu życiowego baculowirusów oraz ich zastosowania jako środków owadobójczych. Formułowanie i aplikacja baculowirusów w celu zwalczania szkodników zostały opisane w innej publikacji.

Protokoły zakażania larw motyli (Lepidoptera) baculowirusami przy użyciu mikroaplikatora

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Protokół

Oświadczenia

Przedruki i uprawnienia

Tagi