Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie pęsety laserowej do manipulowania izolowanymi neuronami in vitro

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/911

⸱

11 września 2008

 ,  , 
1Department of Neurology and Neuroscience, School of Medicine, University of Medicine and Dentistry of New Jersey - UMDNJ

W tym artykule

Podsumowanie

W tym filmie opisano manipulację hodowanymi neuronami z wykorzystaniem pęsety laserowej in vitro.

Streszczenie

W niniejszej pracy i filmie opisujemy protokoły stosowane w naszym laboratorium do badania preferencji kierunkowych regenerujących się wypustek komórkowych dorosłych neuronów siatkówki in vitro. Procedury przygotowania kultur komórek siatkówki rozpoczynają się od wycięcia, trawienia i trituracji siatkówki, a kończą na wysiewaniu wyizolowanych komórek siatkówki na szalki wykonane specjalnie do zastosowań z pęsetą laserową. Szalki te są podzielone na połowę adhezyjną dla komórek oraz połowę repelującą komórki. Strona adhezyjna jest pokryta warstwą przeciwciał Sal-1, które stanowią podłoże umożliwiające wzrost komórek. W przypadku innych typów komórek można zastosować inne podłoża adhezyjne. Strona repelująca jest pokryta cienką warstwą poly-HEMA. Komórki wysiane na stronę z poly-HEMA są chwytane pęsetą laserową, transportowane, a następnie umieszczane obok komórki na stronie z Sal-1 w celu utworzenia pary. Dzięki tej technice możliwe powinno być tworzenie grup komórek o dowolnym rozmiarze. „Mikromanipulacja sterowana pęsetą laserową” oznacza, że badacz może wybrać, które komórki przenieść, a pożądana odległość między komórkami może zostać ustandaryzowana. Ponieważ wiązka lasera przechodzi przez przezroczyste powierzchnie naczynia hodowlanego, wybór i rozmieszczenie komórek odbywają się w zamkniętym, sterylnym środowisku. Komórki mogą być monitorowane za pomocą wideografii time-lapse i poddawane dowolnej wymaganej technice biologii komórki. Technika ta może pomóc w badaniach nad oddziaływaniami międzykomórkowymi.

Protokół

Pincety optyczne do manipulowania izolowanymi komórkami w hodowli

Siły pułapkowania w pęsetach optycznych powstają z pędu światła (Ashkin, 1991; Ashkin et al., 1986). Chociaż siły te łatwo pułapkują komórki w zawiesinie, nie są one w stanie przemieścić komórek przylegających do powierzchni. Dlatego, aby zmniejszyć adhezję do szalki hodowlanej w miejscu pułapkowania komórek, szkiełko nakrywkowe pokrywa się poli(2-hydroksyetylometakrylanem) (poly-HEMA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) – nietoksycznym związkiem o właściwościach odpychających komórki, wykorzystywanym wcześniej w badaniach nad adhezją komórek śródbłonka (Folkman and Moscona, 1978). Podczas gdy poly-HEMA pokrywa jedną połowę szalki hodowlanej, druga połowa jest powlekana podłożem wspierającym wzrost komórek. W naszym laboratorium jako podłoże do hodowli komórek siatkówki salamandry stosuje się Sal-1. Procedura przygotowania szalek pokrytych Sal-1 oraz poly-HEMA opisana jest poniżej:

Przygotowanie naczyń hodowlanych

  1. Oczyścić krawędki szkiełek podstawowych (#1 VWR Scientific Inc., Media, PA) w kwasie. Wybrano te szkiełka ze względu na ich grubość wynoszącą zaledwie 0.1mm, co jest niezbędne dla obiektywów o wysokiej aperturze numerycznej wymaganych do ogniskowania lasera.
  2. Aby stworzyć obszar odpychający komórki, rozpuścić 20 mg poly-HEMA (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) w 1ml 95% etanolu przez noc w temperaturze pokojowej. Zaleca się, aby roztwór ten został użyty w ciągu 1 miesiąca od przygotowania.
  3. Ustawić szkiełka podstawowe niemal pionowo w środowisku wolnym od kurzu, np. w dygestorium.
  4. Nanieść jedną lub dwie krople roztworu poly-HEMA w pobliżu górnej krawędzi szkiełka za pomocą końcówki mikropipety o objętości 200μl. Krople (około 50-100µl każda) powinny ograniczać się do jednej połowy szkiełka. Duży kąt nachylenia zapewnia spływanie cieczy po powierzchni szkiełka do dołu, co pozwala na uzyskanie cienkiej, równomiernej warstwy poly-HEMA. Pozostawić pokryte poly-HEMA szkiełka do wyschnięcia w dygestorium przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Oznaczyć stronę pokrytą poly-HEMA na szkle cienkopisem blisko krawędzi.
  6. Wywiercić otwór o średnicy 1 cm w dnie naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm.
  7. Przykleić szkiełko pokryte poly-HEMA do dna naczynia hodowlanego za pomocą Sylgard 184 (Dow Corning Co., Midland, MI) w taki sposób, aby strona z poly-HEMA była skierowana do wnętrza naczynia. Należy upewnić się, że krawędź powłoki poly-HEMA przebiega przez środek otworu. Pozostawić naczynia do wyschnięcia na 1-3 dni w temperaturze pokojowej w środowisku wolnym od kurzu.
  8. Narysować linię na zewnętrznej stronie szkiełka za pomocą rysika diamentowego, prowadząc go wzdłuż krawędzi powłoki poly-HEMA. Następnie narysować dwie przecinające się linie prostopadle do niej w odstępie około 2mm. Dwa punkty przecięcia służą jako punkty referencyjne (fiducyjne), które pozwalają na odtworzenie tej samej orientacji naczynia hodowlanego na stoliku mikroskopu.
  9. Sterylizować naczynia pod światłem ultrafioletowym przez noc.
  10. Aby stworzyć połowę naczynia hodowlanego przylegającą do komórek, pokryć połowę niepokrytą poly-HEMA preparatem Sal-1, który zawiera mysie przeciwciało przeciwko salamandrze opracowane przeciwko błonom komórkowym siatkówki (uprzejmie udostępnione przez dr. Petera MacLeisha, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA; patrz MacLeish et al. (1983)).  Najpierw pokryć stronę Sal-1 około 100µl sterylnego przeciwciała koziego anty-mysiego IgG o stężeniu 0.1 mg/ml (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis IN), uważając, aby ciecz nie przelała się na stronę z poly-HEMA. Pozostawić na trzy godziny, a następnie usunąć. Przemyć ten sam obszar sterylnym roztworem Ringera raz lub dwa razy, następnie nanieść 100µl supernatantu Sal-1, dbając o to, aby ciecz nie przedostała się na stronę z poly-HEMA. Pierwsze przeciwciało zapewnia pokrycie Sal-1 w znanym stężeniu.
  11. Inkubować naczynia z Sal-1 przez noc.
  12. Usunąć roztwór przeciwciała Sal-1 i wypłukać obszar sterylnym roztworem Ringera. Przed samym wysianiem komórek wprowadzić do naczynia 2 ml pożywki.

Skład roztworu Ringera dla płazów, bezsurowiczego medium dla płazów oraz roztworu Ringera do trawienia enzymatycznego znajduje się w publikacjach MacLeish i Townes-Anderson (1988) oraz Mandell i wsp. (1993).

Przygotowanie kultur komórkowych

Komórki użyte w tym filmie pochodziły od dorosłych, zaadaptowanych do światła salamander tygrysich w fazie wodnej (Ambystoma tigrinum), o długości 17–22 cm (Charles Sullivan Inc., Nashville, TN), utrzymywanych w temperaturze 5°C w cyklu światło-ciemność 12 h:12 h. Protokoły zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na University of Medicine and Dentistry of New Jersey w ścisłej zgodności z wytycznymi National Institutes of Health. Procedury przygotowania kultur komórek siatkówki zostały opisane przez Nachman-Clewner i Townes-Anderson (1996) i przebiegają w następujący sposób:

  1. Zdekapituj i przeprowadź pithing zwierząt. Usuń gałki oczne, a następnie wypreparuj rogówki i tęczówki. Siatkówki powinny być lekko oddzielone od ścianki gałki ocznej. Używając zakrzywionej pęsety umieszczonej pod siatkówką, wyjmij siatkówki. Na tym etapie nie ma znaczenia, czy soczewka pozostaje przytwierdzona do siatkówki.
  2. Traw siatkówki w roztworze papainy o stężeniu 14 U/ml (Worthington, Freehold, NJ) w roztworze Ringera dla salamandry przez 40 min.
  3. Przed użyciem roztwór Ringera z papainą należy napowietrzać mieszaniną gazów 95% O2 / 5% CO2  przez 30 min, a następnie wysterylizować, przepuszczając przez filtr 0,22 mikrona (Millipore, Carrigtwohill, Irlandia).
  4. Przepłucz siatkówki sterylnym roztworem Ringera dla salamandry trzykrotnie.
  5. Wyjmij preparaty z roztworu Ringera, a następnie delikatnie rozcieraj tkankę siatkówki za pomocą pipety o średnicy 3 mm, aby uzyskać zawiesinę komórkową.

Manipulacja wyizolowanymi neuronami za pomocą pęsety laserowej

  1. Umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu, orientując je poprzez dopasowanie znaku na naczyniu do punktu odniesienia na stoliku. Zapisz współrzędne punktów referencyjnych w komputerze.
  2. Wysej komórki na obie połowy naczynia: Sal-1 oraz poly-HEMA.
  3. Pozostaw komórki na około 20 mins, aby osiadły; jest to czas wystarczający do przywierania komórek na adhezyjnej stronie naczynia do podłoża przeciwciał.
  4. Wybierz komórkę po adhezyjnej stronie Sal-1 naczynia. Zaznacz współrzędne x i y stolika w pozycji blisko komórki. W naszym przypadku punkt ten znajdował się w odległości około 10µm od dendrytów pierwotnych wybranej komórki. Zapisz współrzędne w komputerze.
  5. Wybierz drugi neuron, w naszym przypadku fotoreceptor, po stronie poly-HEMA naczynia i użyj pęsety laserowej do jego przechwycenia.  Przechwycenie można osiągnąć w szerokim zakresie poziomów mocy. Ustawiliśmy jednak moc lasera na 10%–20%, co jest wartością wystarczająco niską, aby uniknąć przechwytywania zanieczyszczeń wraz z komórką, ale wystarczającą do transportu komórki przez medium.
  6. Trzymając komórkę w pułapce, obniż stolik tak, aby komórka znajdowała się znacznie powyżej powierzchni naczynia hodowlanego i powyżej wszystkich przywierających neuronów. Przesuń stolik pod kontrolą komputera, aby doprowadzić komórkę do wcześniej zapisanych współrzędnych x i y po stronie Sal-1. Prędkość ruchu stolika ustawiono na 8–20µm/s, jednak maksymalna prędkość powinna zostać określona empirycznie. Po dotarciu do punktu docelowego po stronie Sal-1, podnieś stolik, aby zbliżyć przechwyconą komórkę do powierzchni naczynia. Umiejscowienie komórki można wykonać z dokładnością do kilku mikronów. Pozostaw komórkę do czasu przywiernięcia do podłoża Sal-1.
  7. Uzyskanie zdigitalizowanych obrazów obu komórek w parze przed i po sformowaniu pary stanowi użyteczną dokumentację.
  8. Utrzymuj pary komórek w inkubatorze. W przypadku komórek salamandry umieść naczynia w komorze nawilżanej w temperaturze 10°C. Komórki mogą być monitorowane za pomocą poklatkowego nagrywania wideo i wykorzystywane w dowolnej wymaganej technice biologii komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Światło posiada pęd, a gdy promień świetlny ulega refrakcji przechodząc przez komórkę, wymagana jest siła, aby zmienić kierunek tego pędu. Zgodnie z prawem zachowania pędu, siła o przeciwnym kierunku musi w zamian oddziaływać na komórkę. Ashkin (1991) wykazał, że siła generowana przez wiązkę laserową skupioną przez obiektyw mikroskopu przesuwa komórkę w stronę centrum ogniska. Mimo że wiązka laserowa generuje zaledwie kilka pikonิวtonów siły, jest ona wystarczająca, aby przeciągnąć komórkę przez ośrodek. W celu uniknięci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Badania były wspierane przez granty NIH EY012031 i EY0182175 oraz Fundację F.M. Kirby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
rondelka z deactivate szkła kryształowego nr 1, 25mmVWR international48380 080
poli-2-hydroksyetylometakrylan (poly-HEMA)Sigma-AldrichP-3932rozpuścić w 95% etanolu
Kozie przeciwciała anty-mysie IgGChemicon InternationalAP181 1mg w 1ml, rozcieńczyć 10x przed użyciem
naddatek Sal-1 zawierający mysie przeciwciała anty-salamandroweuprzejmie dostarczone przez dr. Petera MacLeishadr Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA
jednorazowe pipety pyrex o średnicy otworu 3 mm i pojemności 5mlCorning7078A-5
szalki do hodowli komórkowej 35mm x 10mmCorning430165
zestaw elastomeru silikonowego Sylgard 184Dow Corning
pinceta optyczna-mikronarzędzie lub pinceta laserowaCell Robotics Inc.
laser diodowy w trybie ciągłym o mocy 1 W i długości fali 980nmCell Robotics Inc.
odwrócony mikroskop świetlny Axiovert 100Carl Zeiss, Inc.
obiektyw plan neofluor z immersją olejową 40xCarl Zeiss, Inc.apertura numeryczna (N.A. 1.3)
czarno-biała kamera CCDSony Corporation
komputer i joystick z oprogramowaniemCell Robotics Inc.do sterowania zmotoryzowanym stolikiem

Bibliografia

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
  2. Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
  3. Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
  4. Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
  5. MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
  6. MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
  7. Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
  8. Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
  9. Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pu apki optyczneneurony siatk wkimanipulacja kom rkamiwykonywanie naczypowlekanie poly HEMAprzeciwcia a Sal 1adhezja kom reksubstancja odpychaj ca kom rkiizolacja kom rek siatk wki

Powiązane artykuły