Badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy procedury badania zmian w ekspresji genów indukowanej fagocytozą z wykorzystaniem podejścia opartego na genach reporterowych lucyferazy, stosując system Dual-GloTM Luciferase Assay System firmy Promega.

Streszczenie

Aby zbadać koordynację różnych szlaków syntezy lipidów podczas biogenezy błon, warto zastosować system eksperymentalny, w którym biogeneza błon zachodzi szybko i w sposób indukowalny. Stwierdzono, że fagocytoza kulek lateksowych jest praktyczna do tych celów, ponieważ komórki szybko syntetyzują lipidy błonowe, aby uzupełnić zasoby błon utracone jako materiał otaczający podczas pochłaniania cząstek. W niniejszej pracy opisujemy procedury badania zmian w ekspresji genów indukowanej fagocytozą z wykorzystaniem podejścia opartego na genach reporterowych lucyferazy przy użyciu systemu Dual-Glo Luciferase Assay System firmy Promega.

Protokół

Hodowla komórek

1. Kultury macierzyste ludzkich komórek embrionalnych nerki 293 (HEK293) hoduje się w naczyniach hodowlanych o średnicy 10 cm w „medium A”, składającym się z DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) uzupełnionego o koktajl antybiotyków (100 jednostek na ml penicyliny i 100 µg na ml siarczanu streptomycyny) oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
2. W celu przygotowania komórek do eksperymentu odsysa się medium, a komórki płucze dwukrotnie 5 ml roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
3. Następnie usuwa się PBS i zastępuje go 0,6 ml roztworu zawierającego 0,25% trypsyny.
4. Naczynie inkubuje się w temperaturze 37˚C przez około 2 min, aż komórki zaczną się odrywać.
5. Dodaje się 5,5 ml medium A w celu neutralizacji trypsyny, a następnie zlicza komórki za pomocą hemocytometru.
6. Komórki rozcieńcza się do stężenia 320 000 komórek na ml i nanosi po 0,1 ml na studzienkę do 96-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej poliłyzyną.
7. Płytkę umieszcza się w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37˚C w atmosferze zawierającej 8,8% CO2 i inkubuje przez 24 h.

Transfekcje

1. Przygotowując się do transfekcji, należy określić liczbę powtórzeń dla każdego z warunków eksperymentalnych oraz ilość plazmidu do transfekcji. Standardowo wszystkie warunki wykonujemy w trzech powtórzeniach, transfekując łącznie od 50 do 100 ng DNA plazmidowego na dołek. Mieszaniny plazmidów powinny zawierać co najmniej konstrukt reporterowy wykazujący ekspresję lucyferazy świetlika oraz plazmid kontrolny wykazujący ekspresję lucyferazy Renilla pod promotorem konstytutywnym.
2. Roztwory plazmidów przenosi się pipetą do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i uzupełnia o 10 µl na próbkę medium DMEM bez surowicy i antybiotyków. Na przykład, jeśli 20 dołków ma zostać poddanych transfekcji ilością 50 µg DNA, należy dodać 200 µl DMEM do 1 µg DNA.
3. Do roztworu DMEM/DNA dodaje się 3 µl „odczynnika TransIT 293” (Mirus) na każdy 1 µg DNA. Należy wymieszać zawartość poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie pozostawić próbki w temperaturze pokojowej na co najmniej 10 min.
4. W tym czasie należy usunąć medium z płytki hodowlanej 96-dołkowej i zastąpić je 90 µl świeżego medium A.
5. Do każdego dołka dodaje się 10 µl mieszaniny DMEM/DNA/TransIT 293.
6. Płytkę należy umieścić w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37˚C w atmosferze zawierającej 8,8% CO2 i inkubować przez 24 h.

Fagocytoza

1. Przygotować zawiesiny zawierające medium B (mieszaninę DMEM i medium Ham’s F12 w stosunku 1:1, z dodatkiem antybiotyków i 10% FBS) oraz kuleczki lateksowe 0,75-µm w stężeniu od 0 do 1 mg/ml.
2. Usunąć podłoża z 96-dołkowej płytki hodowlanej i zastąpić je 0,1 ml zawiesin z kuleczkami w medium B.
3. Wirować płytkę przez 2 min przy 1000 ×g.
4. Następnie komórki hodować w temperaturze 37˚C przez 6 do 16 h. W zależności od warunków i promotora sterującego lucyferazą, zwiększoną ekspresję genu reporterowego można wykryć po 1 do 3 h.
5. W niektórych przypadkach może być konieczne inkubowanie komórek z kuleczkami przez 30 do 60 min, a następnie wykonanie 2 płukań PBS w celu usunięcia nieprzyłączonych kuleczek i dodanie świeżego podłoża przed inkubowaniem komórek przez kolejne okresy czasu.

Test Lucyferazy Dual-GloTM

1. Uwaga: nasz protokół korzystania z tego zestawu różni się w niektórych aspektach od zaleceń producenta. Został on zmodyfikowany w celu zmniejszenia ilości odczynników wymaganych na jedną próbkę.
2. Przygotować roztwór 1 M DTT, podzielić na kilka małych alikwotów i przechowywać w temperaturze -20˚C.
3. Przygotować bufor do lizy zawierający 20 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10% (v/v) glicerolu oraz 0,5% (v/v) Triton X-100. Przed użyciem odmierzyć ilość potrzebną do eksperymentu i dodać 1 µl na ml 1 M DTT oraz koktajl inhibitorów proteaz do stężenia końcowego od 0,5 do 1x. Nie używać ponownie pozostałego roztworu DTT.
4. Przy pierwszym użyciu zestawu Dual-GloTM należy przygotować odczynnik lucyferazowy (świetlika), przenosząc całą zawartość jednej butelki buforu Dual-GloTM Luciferase Buffer (załączonego do zestawu) do jednej butelki substratu Dual-GloTM Luciferase Substrate (załączonego do zestawu). Niewykorzystany odczynnik lucyferazowy podzielić na alikwoty po 10 ml i przechowywać w temperaturze -20˚C.
5. Wyjąć płytkę 96-dołkową z inkubatora do hodowli tkanek i umieścić ją na lodzie. Usunąć pożywkę poprzez aspirację, dodać 40 µl buforu do lizy na dołek, a następnie pozostawić płytkę na lodzie na 30 min.
6. W białej, nieprzezroczystej płytce 96-dołkowej (OptiplateTM-96, numer katalogowy Perkin Elmer 6005290) odmierzyć 15 µl odczynnika lucyferazowego na dołek, a następnie dodać 15 µl lizatu komórkowego.
7. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 min, a następnie odczytać luminescencję w czytniku mikro płytek.
8. Bezpośrednio przed użyciem przygotować odpowiednią ilość roztworu substratu lucyferazy Renilla, dodając 1 część odczynnika Dual-GloTM Stop & Glo® Reagent (załączonego do zestawu) do 100 części buforu Dual-GloTM Stop & Glo® Buffer (załączonego do zestawu).
9. Do każdego dołka dodać 15 µl roztworu substratu lucyferazy Renilla, inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min, a następnie ponownie zmierzyć luminescencję.