Niniejszy materiał stanowi wprowadzenie do rejestracji metodą patch clamp z oocytów Xenopus laevis. Obejmuje on usuwanie błony witelinowej, tworzenie uszczelnienia gigaomowego (gigaseal) oraz opcjonalną konwersję patcha do topologii outside-out.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Od czasu opracowania metody przez Sakmanna i Nehera 1, 2, technika patch clamp stała się uznanym i niezwykle użytecznym narzędziem do elektrofizycznych pomiarów pojedynczych lub wielu kanałów jonowych w komórkach. Technikę tę można stosować do badania kanałów jonowych zarówno w ich naturalnym środowisku, jak i w komórkach heterologicznych, takich jak oocyty pobrane z żaby pazurskiej, Xenopus laevis. W niniejszej pracy opisujemy utrwaloną metodę rejestracji patch clamp z oocytów Xenopus. Technika ta jest wykorzystywana do pomiaru właściwości ekspresyjnych kanałów jonowych, zarówno w obrębie populacji (macropatch), jak i pojedynczo (rejestracja pojedynczego kanału). Skupiamy się na metodach maksymalizacji jakości preparowania oocytów oraz tworzenia uszczelnienia (seal). Przy optymalizacji wszystkich czynników technika ta zapewnia prawdopodobieństwo pomyślnego utworzenia uszczelnienia powyżej 90%. Proces ten może być różnie optymalizowany przez poszczególnych badaczy w zależności od czynników, które uznają za najważniejsze; prezentujemy podejście, które w naszej praktyce przyniosło największe sukcesy.
Protokół
Część 1: Usuwanie błony witelinowej
- Przygotuj dwa zestawy pęset. Zalecamy pęsety nr 5, z czego jeden zestaw powinien być lekko zaostrzony pilnikiem. Przygotuj również szklaną pipetę transferową, przycinając i wypalając końcówkę pipety Pasteura o długości 7".
- Zalecenie: Aby zapobiec wyślizgiwaniu się oocytów, wytnij krążek z siatki (oczka 1 mm) i przyklej go do dna szalki Petriego o średnicy 60 mm. Szalkę tę można wielokrotnie wykorzystywać, pod warunkiem zachowania czystości pomiędzy użyciami.
- Napełnij szalkę Petriego do połowy roztworem hiperosmotycznym (patrz receptura) i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym.
- Za pomocą wypalanej pipety Pasteura przenieś 1-3 oocyty Xenopus z roztworu inkubacyjnego do szalki.
- Odczekaj od 15 s do 2 min, aż komórki zaczną się kurczyć. Dłuższy czas ułatwia usuwanie błony; krótszy czas pozwala uzyskać zdrowsze komórki do patch-clampingu.
- W miarę kurczenia się komórki, błona witelinowa stanie się słabo widoczna jako przezroczysta warstwa nad komórką. Wybierz zdrową komórkę (bez zawirowań lub defektów) do usunięcia błony.
- Jedną pęsetą delikatnie chwyć błonę witelinową, nie uszkadzając błony plazmatycznej. Drugą pęsetą chwyć błonę w pobliżu tego samego miejsca, a następnie delikatnie rozdar ją i oddziel od komórki.
- Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie przenieś komórkę do komory rejestracyjnej. Należy pamiętać, że po usunięciu błony witelinowej komórka staje się krucha.
Część 2: Tworzenie gigaseala
- Napełnij pipetę rejestrującą roztworem soli fizjologicznej. Użyj minimalnej objętości roztworu zapewniającej dobry kontakt elektryczny z drutem elektrody, aby zminimalizować pojemność pipety.
- Kilkukrotnie strzepnij pipetę, aby pęcherzyki powietrza wypłynęły i osiadły na drucie elektrody.
Wywrzyj ciśnienie na napełnioną pipetę. Można to zrobić ustami lub za pomocą pompy akwariowej. Ciśnienie to jest kluczowe dla utrzymania czystości pipety podczas przechodzenia przez powierzchnię cieczy i przesuwania się w stronę komórki. - Zlokalizuj oocyt w komorze i ostro ustaw ostrość na krawędzi komórki.
- Trzymając pipetę poza kąpielą, wycentruj (nieostrą) końcówkę nad komórką. Minimalizuje to czas przebywania w kąpieli przed utworzeniem uszczelnienia.
- Obniż pipetę, aż uzyska ostry obraz obok komórki. Przysuń ją w bliską odległość (~50 mikronów). Powinno być widoczne niewielkie zniekształcenie roztworu wypychanego z pipety przez ciśnienie wsteczne.
- Używając oprogramowania do patch clampu, sprawdź rezystancję pipety (celem jest około 3-4 MΩ) i wyzeruj prąd za pomocą offsetu napięcia.
- Utrzymując dodatnie ciśnienie w pipecie, powoli przesuwaj końcówkę w stronę komórki, monitorując rezystancję wizualnie lub za pomocą monitora audio generującego ton o częstotliwości proporcjonalnej do rezystancji. W momencie, gdy końcówka zacznie dotykać komórki, rezystancja wzrośnie.
- Nagle, ale delikatnie, zmień ciśnienie z dodatniego na ujemne o podobnej wartości bezwzględnej. Rezystancja powinna wzrastać aż do momentu utworzenia uszczelnienia.
- W większości przypadków utworzenie uszczelnienia następuje w ciągu kilku sekund; sporadycznie wymagane jest 30-60 sekund.
- Gdy rezystancja osiągnie 1GΩ, ciśnienie można zredukować do neutralnego. Otrzymano konfigurację on-cell. Aby uzyskać konfigurację inside-out, gwałtownie odciągnij pipetę od komórki. W przypadku konfiguracji outside-out, patrz poniżej.
Część 5: Topologia outside-out (opcjonalnie)
- Natychmiast po uzyskaniu gigauszczelnienia (gigaseal), należy przerwać błonę. Można to zrobić za pomocą silnego ssania, jednak zalecamy użycie impulsu 1 V przez 1 ms. Rezystancja powinna spaść do poziomu nieco wyższego niż początkowa rezystancja pipety.
- Należy powoli i płynnie odsunąć pipetę od komórki. Powinien być widoczny fragment komórki wyciągany wraz z pipetą. Nagle, w ciągu kilku sekund, komórka gwałtownie powróci do pierwotnego kształtu, a rezystancja powinna natychmiast i jednocześnie powrócić do poziomu GΩ.
- W ten sposób uzyskano płat w konfiguracji outside-out. Ektodomeny wszystkich włączonych kanałów jonowych są teraz wyeksponowane na roztwór w kąpieli.
Część 6: Przewidywane wyniki
Zasadniczo preferowane są uszczelnienia o wyższej rezystancji, które charakteryzują się dłuższą trwałością. Wartość 10 GΩ stanowi dobrą wytyczną dla wysokiej jakości uszczelnień. W naszym doświadczeniu szanse na uzyskanie uszczelnień tej jakości zależą od wielu czynników, w szczególności od jakości komórek i pipet. Skuteczność tworzenia patchy może przekraczać 95% przy zastosowaniu zdrowych komórek, czystych pipet oraz doświadczonego badacza. Takie patche mogą być stabilne przez wiele minut i nadają się do dowolnych badań elektrofizjologicznych kanałów jonowych eksprymowanych w oocytach Xenopus, w tym do rejestracji pojedynczych kanałów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Istnieje wiele parametrów rejestracji elektrofizjologicznej, których tutaj nie omówiono. Konfiguracja statywu, zarządzanie szumem systemowym, ekspresja kanałów oraz protokoły rejestracji są również krytyczne dla uzyskania dobrych wyników eksperymentalnych.
W naszym doświadczeniu najistotniejszymi parametrami dla utworzenia niezawodnych uszczelnień są: wysokiej jakości oocyty, szybkie usunięcie błony witelinowej (tzw. „obieranie”), stosowanie nowo wyciągniętych pipet chronionych przed kurzem, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Przepis na roztwór kurczący pochodzi z laboratorium R.W. Aldricha. Dziękujemy następującym agencjom finansującym i fundacjom za wsparcie: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, Donald B. and Delia E. Baxter Foundation, Klingenstein Fund oraz McKnight Endowment for Neuroscience.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Wzmacniacz do techniki patch-clamp &oprogramowanie | Instrument | HEKA Instruments | EPC-10 | Lub inne podobne urządzenie (np. HEKA EPC-9 lub Axopatch 200B) |
| Pincety nr 5 (dwie pary) | Narzędzie | Fine Science Tools | ||
| Roztwór do obkurczania oocytów | Odczynnik | Składnik Ilość N-metylo-D-glukamina 220 mM HEPES 10 mM MgCl2 1 mM EGTA 10 mM Kwas asparginowy 220 mM KCl 2 mM pH do 7,4 za pomocą N-metylo-D-glukaminy | ||
| siatka tkana | 800 µm | Spectrum Labs | 146481 |
Bibliografia
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
