Wytwarzanie pipet do patch-clamp oraz mikroelektrod za pomocą programowalnej wyciągarki

Podsumowanie

W tym filmie pokazano, jak używać programowalnej wyciągarki do wykonywania pipet do patch-clampu oraz ostrych elektrod do elektrofizjologii. Tę samą procedurę można zastosować do wykonania różnych narzędzi szklanych, w tym igieł do iniekcji.

Streszczenie

Szklane mikroelektrody (nazywane również pipetami) od dziesięcioleci stanowią podstawowe narzędzie w elektrofizjologii. Obecnie takie pipety wykonuje się z kapilar szklanych przy użyciu programowalnego wyciągacza. Instrumenty te ogrzewają kapilarę za pomocą włókna metalowego lub lasera i wyciągają szkło, wykorzystując grawitację, silnik lub obie te metody jednocześnie. Pipety do rejestracji metodą patch-clamp formuje się wyłącznie za pomocą ciepła i grawitacji, natomiast ostre elektrody do rejestracji wewnątrzkomórkowej wymagają kombinacji ciepła, grawitacji i silnika. Procedura wytwarzania pipet do rejestracji wewnątrzkomórkowej jest zbliżona do tej stosowanej przy produkcji igieł iniekcyjnych do różnych zastosowań, w tym do wstrzykiwania cRNA do oocytów Xenopus. Zazwyczaj do produkcji pipet do rejestracji patch-clamp stosuje się szkło kapilarne o średnicy <1.2 mm, natomiast do rejestracji wewnątrzkomórkowej używa się węższego szkła (średnica zewnętrzna = 1.0 mm). Dla każdego narzędzia wyciągacz jest programowany nieco inaczej. W niniejszym materiale wideo pokazano, jak wykonać oba rodzaje pipet rejestracyjnych, korzystając z wcześniej ustalonych programów wyciągacza.

Protokół

Wytwarzanie pipet kapilarnych

Za pomocą wyciągarki do mikroelektrod, takiej jak Sutter P-97 Flaming/Brown, wyciągnij zestaw około 10-20 pipet.

1. Wybierz szklaną kapilarę. Stosujemy kapilary borokrzemianowe (Sutter BF150-110-10, średnica zewnętrzna 1,5mm, średnica wewnętrzna 1,1mm, długość 10cm). Przechowuj szkło ostrożnie, aby pozostało czyste i wolne od kurzu.
2. Opracuj program wyciągania. Stosujemy program 5-stopniowy, z malejącą temperaturą i prędkością na każdym etapie oraz niewielkim wyciągnięciem w ostatnim kroku. Podręcznik do pipet firmy Sutter stanowi doskonały punkt odniesienia przy tworzeniu odpowiednich programów.
3. Zbadaj końcówki pipet pod mikroskopem, aby określić średnicę otworu oraz gładkość powierzchni. Odrzuć końcówki szorstkie, nierówne lub nieregularne. Prawidłowy protokół wyciągania powinien ograniczyć występowanie takich wad. Dla standardowych pomiarów patch-clamp otwory końcówek powinny mieć średnicę 1-3 mikronów. Stromy stożek (tępa końcówka) prowadzi do niższej rezystancji przy tej samej średnicy otworu. Kształt i rozmiar można zmodyfikować poprzez polerowanie ciśnieniowe.

Wypalanie pipet

1. Przygotować zestaw do polerowania (mikrokuźnię) z platynowym włóknem grzejnym sterowanym pedałem nożnym. Odpowiedni zestaw jest dostępny w firmie ALA Scientific (CPM-2), lub podobne urządzenie można złożyć z pojedynczych elementów.
2. Opcjonalnie: Pokryć pipetę izolatorem, aby zmniejszyć pojemność i poprawić charakterystykę szumów. Stosujemy wosk dentystyczny. Inną opcją jest Sylgard 184™ (elastomer poli-dimetylosiloksanowy, znany również jako PDMS).
3. W przypadku użycia wosku, należy trzymać w pobliżu niewielki zapas w stanie stopionym. Przy zastosowaniu ciśnienia powietrza z tyłu pipety, aby zapobiec dostaniu się wosku do jej wnętrza, należy krótko zanurzyć końcówkę w płynnym wosku, a następnie ją wyjąć. W przypadku Sylgardu należy przechowywać przygotowany elastomer w zamrożonych aliquotach i nanosić go na końcówkę pipety pod mikroskopem. Następnie należy podgrzać próbkę, aby utwardzić elastomer.
4. Umieścić pipetę (pokrytą izolatorem lub nie) w urządzeniu do polerowania i zbliżyć końcówkę do włókna na odległość ~50 mikronów. Należy pamiętać, że włókno rozszerza się podczas nagrzewania.
5. Zalecane: Postępować zgodnie z osobnym protokołem „polerowania ciśnieniowego”, aby zmienić kształt pipety w celu uzyskania optymalnej rezystancji i średnicy końcówki.
6. Krótki impuls cieplny (1-2 sekundy) jest wystarczający, aby usunąć wosk z końcówki pipety i wygładzić szkło.
7. Gotową pipetę umieścić w zamkniętym pudełku, aby chronić ją przed kurzem; powtórzyć czynność, aż do uzyskania 10 prawidłowych pipet.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół jest codziennie stosowany w laboratoriach elektrofizjologii, a także służy do wykonywania igieł iniekcyjnych dla komórek i zwierząt. Dzięki programowalnemu wyciągaczowi (pullerowi) łatwo jest przygotować pipety do różnych zastosowań.  Przy zachowaniu uwagi i staranności włókno w wyciągaczu wytrzyma rok lub dłużej.  Powodzenia w eksperymentach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wytwornica micropipet	Instrument	Sutter Instrument Co.	P-97	Lub podobny instrument (np. Sutter P-87 lub P-2000)
Kapilary szklane	Odczynnik	Sutter Instrument Co.	BF150-86-10	Lub podobne szkło kapilarne. Aby ułatwić napełnianie pipety, należy użyć kapilary z włóknem szklanym.