Optymalizacja reakcji Ugiego z wykorzystaniem syntezy równoległej i automatycznej obsługi cieczy

Podsumowanie

Reakcja Ugiego okazała się wygodnym sposobem na szybkie tworzenie zróżnicowanych bibliotek związków. Polega ona na reakcji aminy, aldehydu, kwasu karboksylowego i izonitrilego, zazwyczaj w metanolu w temperaturze pokojowej. W tym filmie wykorzystujemy 48-miejscowy blok Mettler-Toledo MiniBlock wyposażony w rurki filtracyjne oraz zautomatyzowany dozownik cieczy Mettler-Toledo MiniMapper do dostarczania odczynników i rozpuszczalnika. Parametrami poddanymi analizie były stężenie, skład rozpuszczalnika oraz nadmiar niektórych odczynników.

Streszczenie

Opisano optymalizację reakcji Ugiego obejmującą mieszanie furfurylaminy, benzaldehydu, boc-glicyny i t-butylizocyjanidku. Przedstawiono wyniki trzech powtórzeń 48 eksperymentów równoległych, w których zmieniano stężenie, rozpuszczalnik oraz nadmiar niektórych odczynników. Izolację produktu osiągnięto za pomocą prostej procedury filtrowania i przemywania. Najwyższa uzyskana wydajność wyniosła 66% dla 0,4 M metanolu z 1,2 eq. iminy. Jest to wynik znacznie wyższy niż wydajność 49% uzyskana w początkowej reakcji przy stężeniu ekvimolarnym 0,4 M w metanolu. Roztwory metanolowe ze stężeniami odczynników 0,4 M lub 0,2 M dawały lepsze wydajności, podczas gdy wszystkie układy rozpuszczalników przy 0,07 M wykazały słabe wyniki. Przy 0,2 M mieszaniny metanolu i etanolu/metanolu (60/40) były statystycznie równie skuteczne, podczas gdy THF/metanol (60/40) był mało wydajny, a acetonitryl/metanol (60/40) wykazywał wyniki pośrednie. W tych powtórzonych eksperymentach uzyskano dobrą powtarzalność wydajności osadu, co pozwoliło na pozytywną identyfikację subtelnych efektów interakcji.

Protokół

Wstęp

Reakcja Ugiego okazała się wygodnym sposobem na szybkie tworzenie zróżnicowanych bibliotek związków (1-3). Polega ona na reakcji aminy, aldehydu, kwasu karboksylowego i izonitrylu, zazwyczaj w metanolu w temperaturze pokojowej. Reakcja Ugiego często służy jako narzędzie w syntezie cząsteczek aktywnych farmakologicznie; wykorzystaliśmy ją do szybkiego otrzymania związków w poszukiwaniu nowych środków przeciwmalarycznych (4). Zaobserwowano, że produkty reakcji Ugiego czasami wytrącają się w czystej postaci z mieszaniny reakcyjnej (1,5). Jest to bardzo korzystny wynik, ponieważ reakcję można wówczas łatwo przeskalować bez konieczności stosowania kosztownych procedur oczyszczania, takich jak chromatografia. Najbardziej korzystne byłoby zoptymalizowanie wydajności produktu reakcji Ugiego otrzymywanego bezpośrednio poprzez filtrowanie mieszaniny reakcyjnej bez dalszej obróbki. W tym celu wykorzystaliśmy 48-miejscowy blok Mettler-Toledo MiniBlock (6) wyposażony w rurki filtracyjne. Do dozowania reagentów i rozpuszczalnika użyto zautomatyzowanego systemu dozowania cieczy Mettler-Toledo MiniMapper (7). Parametrami poddanymi analizie były stężenie, skład rozpuszczalnika oraz nadmiar niektórych z reagentów.

Część eksperymentalna

Automatyczny system do dozowania cieczy MiniMapper został zaprogramowany tak, aby dostarczać ciecze w następującej kolejności do pustych probówek z filtrem w 48-pozycyjnym MiniBlocku: dodatkowy rozpuszczalnik, furfurylamina (2M w metanolu), benzaldehyd (2M w metanolu), boc-glicyna (2M w metanolu) oraz t-butylizocyjanek (2M w metanolu). Domyślna objętość dodawanych odczynników wynosiła 100 µL. W przypadku odczynników dodawanych w nadmiarze dozowano 120 µL. Następnie MiniBlock umieszczono na wytrząsarce na 16 godzin, a po tym czasie zawartość przefiltrowano przy użyciu laboratoryjnej pompy próżniowej. Przeprowadzono dwa etapy przemywania poprzez dodanie metanolu (1 mL) do każdej probówki, a następnie wytrząsanie przez 15 min przed odfiltrowaniem. Probówki suszono w eksykanie pod wysoką próżnią przez co najmniej 30 min. Wydajność obliczono na podstawie przyrostu masy probówek z filtrem. Czystość oceniono za pomocą H NMR dla jednej próbki z każdego układu rozpuszczalników i stężenia. Reakcje przeprowadzono w trzech powtórzeniach (8-10), a średnie wydajności przedstawiono w Tabeli 1.

Charakterystyka produktu reakcji Ugi

karbaminian tert-butylu (2-{[2-(tert-butylamino)-2-okso-1-fenyloetylo](furan-2-ylo-metylu)amino}-2-oksoetylo) : biały stały produkt; t.top.(11) 202-204 °C; 1H NMR (12, widmo) (500MHz, δppm, CDCl3) 1.33 (s, 9H), 1.45 (s, 9H), 4.21 (m, 2H), 4.49 (d, J=18Hz, 1H), 4.50 (d, J=18Hz, 1H), 5.47 (s, 1H), 5.60 (s, 1H), 5.62 (s, 1H), 5.89 (s, 1H), 6.10 (s, 1H), 7.19 (s, 1H), fenyl 7.21-7.37 (m, 5H); 13C NMR (13, widmo) (500MHz, δppm, CDCl3) 28.3, 28.6, 42.3, 42.8, 51.7, 62.9, 79.5, 107.7, 110.4, 128.5, 128.7, 129.6, 134.7, 141.9, 149.8, 155.7, 168.4 170.2; IR (14, widmo) (Ʋmax cm-1 ATR): 1645, 1673, 1699, 3331; FAB-HRMS (15, widmo) (obliczone dla C24H33N3O5 m/z 444.2498 [M+H], otrzymano 444.2517.)

Analiza danych

Dane dotyczące wydajności osadu przeanalizowano za pomocą narzędzi do jednoczynnikowej lub dwuczynnikowej (z powtórzeniami) analizy wariancji (ANOVA) dostępnych w programie Microsoft Excel. (16) W przypadku zmiennych uznanych za istotne statystycznie w analizie ANOVA, zastosowano test najmniejszej istotnej różnicy (LSD) Fishera, aby określić konkretne warunki eksperymentalne wykazujące istotne różnice w wydajności osadu Ugi (17). Wszystkie testy istotności przeprowadzono na poziomie ufności 95%.

Wyniki i dyskusja

Rysunek 1 podsumowuje wpływ składu rozpuszczalnika na wydajność osadu Ugi. Jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) wskazuje na istotną różnicę w średniej wydajności dla czterech badanych rozpuszczalników przy stężeniu reagentów 0,2M. Test LSD Fishera wskazuje, że wydajności osadu uzyskane w metanolu i etanolu nie różnią się statystycznie na poziomie ufności 95% (oznaczono to belką nad nazwami rozpuszczalników na rysunku); wydajność osadu Ugi jest istotnie większa w etanolu i metanolu niż w acetonitrylu, która z kolei jest istotnie większa niż w THF.

Rysunek 1: Podsumowanie wpływu składu rozpuszczalnika na wydajność osadu Ugi przy stężeniu reagentów 0.2M. Wymienione rozpuszczalniki obejmują 40% metanolu przy tym stężeniu.

Biorąc pod uwagę wpływ stężenia odczynników, dane w Tabeli 1 wykazują gwałtowny spadek wydajności przy przejściu z 0,2M na 0,07M przy zastosowaniu metanolu, etanolu i acetonitrylu jako rozpuszczalnika; wydajności w metanolu przy stężeniach 0,2M i 0,4M były porównywalne. Należy zauważyć, że reakcje Ugiego są zazwyczaj prowadzone w zakresie 0,5-2M (2). Jednakże, przy użyciu zautomatyzowanego systemu do obsługi cieczy, może być trudno rozpocząć pracę z roztworami odczynników o stężeniu znacznie wyższym niż 2M, co nakłada praktyczną górną granicę stężenia końcowego na poziomie około 0,5M. Wyniki niniejszego badania optymalizacyjnego sugerują ostrożność w interpretowaniu sukcesu lub niepowodzenia reakcji Ugiego poniżej 0,2M, ponieważ najwyraźniej występują tu efekty nieliniowe.

Rysunek 2 podsumowuje wpływ składu rozpuszczalnika i nadmiaru odczynników na wydajność osadu Ugi przy stężeniu odczynników 0,2M. Wyniki dwuczynnikowej analizy ANOVA wskazują na statystycznie istotny wpływ rozpuszczalnika oraz nadmiaru odczynników. Ponadto występuje statystycznie istotna interakcja między tymi dwiema zmiennymi. Szczegóły tej interakcji ujawnia rysunek 2, z którego wynika, że wydajność osadu zależy od zastosowanego rozpuszczalnika. Należy ponownie zauważyć, że poziome linie nad czynnikami na rysunku oznaczają, iż wydajności nie różnią się statystycznie przy poziomie ufności 95%. Zarówno dla etanolu, jak i metanolu najlepsze wydajności uzyskano przy nadmiarze iminy lub izonitrylu, natomiast dla acetonitrylu znacząco lepsze wyniki osiągnięto przy nadmiarze aminy, aldehydu lub izonitrylu. Jak wspomniano powyżej w omówieniu wyników w Tabeli 1, całkowita wydajność osadu jest niska dla THF jako rozpuszczalnika, a jedynie nadmiar iminy prowadzi do statystycznie istotnej poprawy wydajności osadu. Te różne wzorce poprawy wydajności dla czterech rozpuszczalników prowadzą do statystycznie istotnego efektu interakcji i mogą wskazywać na odmienne oddziaływanie produktu Ugi z różnymi rozpuszczalnikami. Chociaż wyniki liczbowe w Tabeli 1 pokazują, że najlepszą wydajność uzyskano w 0,4M metanolu z 1,2 ekwiwalentu nadmiaru iminy, mieszaniny acetonitrylu/metanolu 0,2M oraz etanolu/metanolu 0,2M również zapewniły znaczące wydajności. Należy zwrócić szczególną uwagę na to, że wszystkie mieszaniny THF/metanol przy 0,2M dały bardzo słabe wyniki. Reakcja Ugi była z sukcesem przeprowadzana w różnych rozpuszczalnikach, w tym w THF (2). Należy zauważyć, że niskie wydajności w tym przypadku nie oznaczają, iż reakcja Ugi nie zaszła w mieszaninach z THF, a jedynie, że nie utworzył się osad.

Rysunek 2: Podsumowanie wpływu składu rozpuszczalnika i nadmiaru odczynników na wydajność osadu Ugi przy stężeniu odczynników 0.2M. Wymienione rozpuszczalniki obejmują 40% metanol przy tym stężeniu.

Rysunek 3 podsumowuje wpływ stężenia odczynników oraz ich nadmiaru na wydajność osadu Ugi z zastosowaniem metanolu jako rozpuszczalnika. Wyniki dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) wskazują na statystycznie istotny wpływ stężenia oraz nadmiaru odczynników. Jak opisano powyżej, wydajność osadu przy stężeniach odczynników 0.2M i 0.4M jest znacząco większa niż przy 0.07M (jednak nie różni się ona między tymi dwiema wartościami). Dodatkowo występuje statystycznie istotna interakcja między dwiema badanymi zmiennymi. Należy zauważyć, że wzorzec poprawy wydajności osadu w zależności od rodzaju nadmiarowego odczynnika jest ogólnie taki sam przy wyższych stężeniach odczynników.

Rycina 3: Podsumowanie wpływu stężenia i nadmiaru odczynnika na wydajność osadu Ugi w rozpuszczalniku metanolowym.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki przedstawione na rysunkach 2 i 3 wykazują występowanie interakcji pomiędzy wyborem rozpuszczalnika, stężeniem odczynnika a tożsamością odczynnika w nadmiarze, jednak w ogólnym rozrachunku były one subtelniejsze niż bezpośrednie efekty wpływu rozpuszczalnika i stężenia. Podobne wyniki uzyskali inni autorzy podczas optymalizacji reakcji Ugiego (18).

Podsumowanie

Eksperyment optymalizacyjny wykazał, że najwyższa wydajność spośród 48 prób wyniosła 66% dla 0,4 M metanolu z 1,2 eq. iminy. Jest to wynik znacznie wyższy niż wydajność 49% uzyskana w początkowej reakcji przy stężeniu ekvimolarnym 0,4 M w metanolu. W tych powtórzeniach uzyskano dobrą powtarzalność wydajności osadu, co pozwoliło na jednoznaczne zidentyfikowanie subtelnych efektów oddziaływań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Furfurylamina	Odczynnik	Sigma-Aldrich	F20009
Benzaldehyd	Odczynnik	Sigma-Aldrich	12010
Boc-glicyna	Odczynnik	TCI America	B1185
t-butylizocyjanek	Odczynnik	TCI America	B1274