W niniejszym opracowaniu opisujemy technikę przygotowywania i utrzymywania komór przedzielonych do hodowli neuronów sensorycznych z zwojów korzeni grzbietowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie i utrzymanie neuronów z zwojów korzeni grzbietowych w hodowlach przedzielonych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurony wysyłają wypustki aksonalne, które znajdują się daleko od ciała komórki, aby unerwić tkanki docelowe, w których czynniki wzrostu pochodzące z tkanki docelowej są niezbędne dla przeżycia i funkcjonowania neuronów. Neurotrofiny są szczególnie wymagane do podtrzymania przeżycia i różnicowania unerwiających neuronów sensorycznych, jednak kwestia tego, w jaki sposób neurotrofiny pochodzące z tkanki docelowej przekazują sygnały do ciała komórki unerwiających neuronów, jest przedmiotem intensywnych badań od ponad 30 lat. Najbardziej powszechnie akceptowany model transportu sygnałów neurotrofin do ciała komórki zakłada, że endosomy sygnałowe przenoszą ten sygnał drogą retrogradną wzdłuż aksonu. W celu zbadania transportu retrogradnego Robert Campenot opracował pierwotnie system hodowli, w którym ciała komórek są odizolowane od ich aksonów. Technika przygotowywania tych komór przedzielonych do hodowli neuronów sensorycznych odtwarza selektywną stymulację zakończeń neuronów, która zachodzi in vivo po uwolnieniu neurotrofin pochodzących z tkanki docelowej. Zdarzenia sygnalizacji retrogradnej, które wymagają zależnego od mikrotubul transportu retrogradnego na duże odległości, mają istotne znaczenie dla leczenia schorzeń neurodegeneracyjnych.
Protokół
Przygotowanie odczynników
- Powlekanie kolagenem: pokryć kolagenem płytki do hodowli tkanek p35 i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37°C na 2 dni przed nasmarowaniem przegród. Końcowe stężenie kolagenu powinno wynosić .71 mg/ml w rozcieńczeniu w .001N HCl. Następnie dodać 1 ml mieszaniny na płytkę.
- Smarowanie aplikatorów: w celu napełnienia aplikatora smaru należy najpierw napełnić strzykawkę 60mL smarem próżniowym Corning. Użyć strzykawki do napełnienia aplikatora smaru, zawinąć go w folię, a następnie autoklawować przez 45 minut.
- Przegrody teflonowe: przegrody mogą być ponownie wykorzystane po każdym eksperymencie, ale muszą zostać najpierw odpowiednio oczyszczone. Zdjąć przegrodę z płytki, wytrzeć cały pozostały smar i umieścić w kwasie siarkowym na 2 dni. Po wyjęciu z kwasu płukać wodą 3X, gotować przez 20 minut, pozostawić do wyschnięcia, umieścić w szklanej płytce Petri p100 i autoklawować przez 20 minut.
- N2-metyloceluloza: odważyć 1,5g metylocelulozy i umieścić w butelce 500mL. Dodać mieszadło magnetyczne i autoklawować przez 20 minut w cyklu suchym (od tego momentu wszystkie prace muszą być wykonywane w warunkach sterylnych). Następnie dodać 500 mL pożywki bezsurowiczej (N2) i mieszać w chłodni do czasu rozpuszczenia. Rozdzielić na alykwoaty w probówkach stożkowych 50 mL i zamrozić w temperaturze -20°C. W celu przygotowania roztworu roboczego, rozdzielić jeden z alykwoatów 50 mL do probówek 1mL i zamrozić w temperaturze -20°C.
- Pożywka DRG: DMEM, 5% inaktywowanej termicznie surowicy koni oraz 1% penicyliny i streptomycyny.
- Pożywka DRGN 100ng/mL: Stężenie zapasowe zarówno czynnika wzrostu nerwów (NGF), jak i czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF) wynosi 1mg/mL. Rozcieńczyć każdą z neurotrofin w stosunku 1:10 000 w pożywce DRG. Hodowle można prowadzić w samym NGF; zmienia to zestaw neuronów, które przeżywają w hodowlach.
Uwaga: W razie potrzeby stosuje się (cytydynę arabinozydową) AraC o stężeniu 1uM, w końcowym stężeniu 0,3uM. Zahamuje to wzrost komórek Schwanna i innych komórek glejowych. - Pożywka DRGN 10ng/mL: rozcieńczyć pożywkę DRGN 100ng/mL (1:10) pożywką DRG.
Rysunek 1. Narzędzia potrzebne do przygotowania układu
Przygotowanie komór z przegrodami (rozpocznij ten proces 1-2 dni przed sekcją)
- Wykonaj nacięcie w środku pokrytej kolagenem szalki p35, wykonując ruch na zewnątrz.
- Nanieś 30ul N2-metylocelulozy na środek nacięcia. Odstaw szalki do czasu nasmarowania dzielnika.
- Przymocuj adapter Luer-lock o rozmiarze 23G do aplikatora smaru. Chwyć teflonowy dzielnik kleszczykami hemostatycznymi pod kątem 90° i połóż go płasko, stroną dzielnika do góry, pod mikroskopem. Nanieś smar wzdłuż dzielnika, upewniając się, że przy każdym ustawieniu adaptera w nowym punkcie początkowym, jest on wprowadzany w smar z poprzedniego kroku, tak aby powstała ciągła linia smaru (patrz schemat). Po naniesieniu smaru na cały dzielnik, odwróć jedną z przygotowanych szalek p35 do góry dnem i ustaw ją tak, aby N2-metyloceluloza znajdowała się nad środkową komorą. Dociśnij dno szalki za pomocą pęsety. Pamiętaj, aby docisnąć wnętrze dzielnika w czterech narożnikach (lewy górny, prawy dolny, prawy górny, lewy dolny, zaznaczone na schemacie jako „X”).
Rysunek 2: Kroki smarowania dzielnika
Uwaga: Ważne jest, aby docisnąć dzielnik wystarczająco mocno, by smar stworzył całkową szczelność z szalką, jednak przy zbyt dużym nacisku aksony nie przedostaną się do komór bocznych.
Zdejmij kleszczyki hemostatyczne, odwróć je i zwolnij zacisk dzielnika. Na koniec umieść szalkę z mocno przymocowanym dzielnikiem pod mikroskopem, ustawiając ostrość na dnie środkowej komory. Za pomocą aplikatora smaru wykonaj małą barierę (.25cm), aby komórki po umieszczeniu w środkowej komorze nie mogły z niej wypłynąć. - Po przygotowaniu kilku kultur, wlej medium DRG do każdej z komór bocznych i umieść je w inkubatorze, w którym będą utrzymywane komórki. Pozostaw kultury na kilka godzin, a następnie sprawdź, czy nie występują wycieki. Jeśli medium przedostało się do środkowej komory, kultura jest niezdatna do użytku.
Uwaga: Podczas nauki tej techniki ważne jest przygotowanie większej liczby kultur niż wymagana do eksperymentu, ponieważ kilka z nich może okazać się nieszczelnych.
Rysunek 3: Kultura „dobra vs nieszczelna”
Utrzymywanie neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) w kulturach przedziałowych
- Dzień 1: Wymień pożywkę DRG w bocznych komorach na pożywkę DRGN 100ng/mL + AraC. Przeprowadź sekcję i dodaj komórki do komory środkowej (100 000 komórek).
- Dzień 2: Dodaj pożywkę 10ng/mL + AraC na zewnątrz przegrody teflonowej, aż pożywka przeleje się przez barierę smarową i wymieni płyn z komorą środkową.
- Dzień 3: Wymień pożywkę w bocznych komorach na DRGN 100ng/mL bez AraC, a w otoczeniu na DRGN 10ng/mL bez AraC.
- Dzień 6: Wymień pożywkę w bocznych komorach na 1ng/mL + AraC, a w otoczeniu na pożywkę DRG + AraC.
- Dzień 9: Wykorzystaj do eksperymentów.
Rycina 4: Obrazy IHC ciał komórkowych i aksonów dystalnych
Uwaga: Podczas wymiany pożywki ważne jest odessanie cieczy z góry każdej bocznej komory. Ponadto nigdy nie wymieniaj pożywki bezpośrednio z komory środkowej, lecz jedynie z otoczenia, pozwalając jej przepłynąć przez barierę smarową do środka.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym filmie zaprezentowano sposób przygotowania i utrzymania komór przedzielonych do hodowli neuronów DRG. Prawidłowo wykonany system ten umożliwia oddzielenie ciała komórki od aksonu, co pozwala na badanie mechanizmów, dzięki którym neurotrofiny przekazują sygnały wzdłuż długich aksonów. Dzięki izolacji płynowej między przedziałami możliwe jest selektywne stymulowanie lub traktowanie jednego przedziału bez wpływania na pozostałe. Hodowle w komorach przedzielonych mogą wspierać inne typy komórek, w tym neurony współczul...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Katharinie Cosker i Stephanie Courchesne za pomocne dyskusje.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| kolagen | Odczynnik | BD Biosciences | 354249 | |
| metyloceluloza N2 400CPS | Odczynnik | Sel-Win Chemicals | ||
| przegroda teflonowa | Inne | Tyler Research | CAMP10 | dostępne są wiele innych rodzajów przegród |
| grabiak igłowy | Narzędzie | Tyler Research | Camp-PR | |
| aplikator do smaru | Narzędzie | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Odczynnik | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Odczynnik | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Odczynnik | PeproTech Inc | 450-02 | |
| Smar wysokopróżniowy | Odczynnik | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Odczynnik | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| adapter Luer stub 23G | Narzędzie | Fisher Scientific | 427565 | |
| kleszczyki hemostatyczne pod kątem 90° | Narzędzie | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
Bibliografia
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
