Model niedotlenienia i niedokrwienia mózgu w perinatalnym niedokrwieniu

Podsumowanie

Postnatalny model niedotlenienia i niedokrwienia mózgu u szczura jest uznanym modelem ludzkiej noworodkowej encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej (HIE). W niniejszym artykule opisujemy model HIE u postnatalnych szczurząt.

Streszczenie

Encefalopatia niedotlenowo- Niedokrwienna (HIE) jest następstwem układowej asfiksji występującej podczas narodzin. Dwudziestu pięciu procent noworodków z HIE rozwija ciężkie i trwałe następstwa neuropsychologiczne, w tym opóźnienie w rozwoju intelektualnym, mózgowe porażenie dziecięce oraz epilepsję. Skutki HIE są wyniszczające i nieodwracalne, co sprawia, że krytyczne staje się zidentyfikowanie i opracowanie strategii terapeutycznych mających na celu zmniejszenie uszkodzeń mózgu u noworodków z HIE. W tym celu opracowano szczurzy model noworodkowy uszkodzenia mózgu wskutek niedotlenienia i niedokrwienia, aby modelować ten stan u ludzi. Model HIE został po raz pierwszy zwalidowany przez Vannucciego i wsp. ¹, a od tego czasu jest szeroko stosowany do identyfikacji mechanizmów uszkodzenia mózgu wynikających z okołoporodowego niedotlenienia i niedokrwienia ² oraz do testowania potencjalnych interwencji terapeutycznych ^3,4. Model HIE jest procesem dwuetapowym i polega na podwiązaniu lewej tętnicy szyjnej wspólnej, a następnie wystawieniu na środowisko hipoksyjne. Przepływ krwi mózgowej (CBF) w półkuli ipsilateralnej względem podwiązanej tętnicy szyjnej nie ulega zmniejszeniu ze względu na krążenie oboczne przez krąg Willisa; jednak przy niższym ciśnieniu tlenu CBF w półkuli ipsilateralnej znacznie spada, co prowadzi do jednostronnego uszkodzenia niedokrwiennego. Zastosowanie chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) do barwienia i identyfikacji niedokrwiennej tkanki mózgowej zostało pierwotnie opracowane dla dorosłych modeli niedokrwienia mózgu u gryzoni ⁵ i jest wykorzystywane do oceny zakresu zawału mózgu we wczesnych punktach czasowych do 72 godzin po wystąpieniu niedokrwienia ⁶. W tym filmie demonstrujemy model uszkodzenia niedotlenowo-niedokrwiennego w postnatalnym mózgu szczura oraz ocenę wielkości zawału przy użyciu barwienia TTC.

Protokół

Protokół ten został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt na Uniwersytecie Stanforda i jest zgodny z wytycznymi Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) dotyczącymi wykorzystywania zwierząt doświadczalnych.

Model HIE u noworodka szczura

1. Szczury Sprague-Dawley w 7. dobie po urodzeniu (PND 7; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) są w pełni znieczulane izofluranem (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL; 3-4% do indukcji i 1-2% do podtrzymania znieczulenia).
2. W okolicy szyi wykonuje się małe nacięcie (Extra Thin Iris Scissors #14088-10, Fine Science Tools Inc, Foster City, CA), aby odsłonić lewą wspólną tętnicę szyjną (CCA).
3. Tętnicę CCA podwiązuje się jedwabną nicią 5-0 (5-0 silk, Ethicon, Somer, NJ).
4. Nacięcie zamyka się klejem cyjanoakrylowym (Elmers Products Inc, Columbus, OH). Nacięcie zostaje zaklejone taśmą, a znieczulenie jest przerywane. Szczury są zwracane do matki i pozostawione do rekonwalescencji na 1-2 godziny.
5. Następnie szczury są umieszczane w komorze hipoksycznej zawierającej 8% tlenu zrównoważonego z 92% azotem na 100 minut w temperaturze 37°C. Gaz składający się z 8% tlenu i 92% azotu (Airgas, Sacramento, CA) przepływa przez rurkę do klatki z plastikową pokrywą. Pokrywa jest dopasowana do klatki i posiada dwa otwory o średnicy 2 cm, z których jeden służy do wprowadzenia rurki podłączonej do butli z 8% tlenem, a drugi umożliwia odpływ gazu. Komora jest umieszczana w łaźni wodnej i rozgrzewana przed użyciem; termometr wewnątrz komory musi wskazać 37°C przed rozpoczęciem hipoksji.
6. Po 100 minutach hipoksji szczury są ponownie zwracane do matki w celu regeneracji.
7. 24 godziny po zakończeniu hipoksji szczury są uśmiercane poprzez głębokie znieczulenie izofluranem. Tkanka mózgowa jest perfundowana zimną solą fizjologiczną, a następnie roztworem zimnego 1% TTC w soli fosforanowej (PBS), pH 7.4 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO). TTC musi być przechowywane w ciemności.
8. Mózgi są usuwane i chłodzone przez 1-2 minuty na lodzie, a następnie wycina się cztery przekroje wieńcowe w odstępach 3 mm (poziomy 1-4), zaczynając od strony rostralnej na poziomie skrzyżowania wzrokowego i lejka, co odpowiada poziomowi 1,8 ~ 2,0 mm od bregmy w mózgu dorosłej myszy.
9. Plastry mózgu są zanurzone w roztworze TTC i inkubowane w 37°C przez 8 minut, a następnie utrwalane w 4% paraformaldehydzie w PBS przez noc. Ze względu na światłoczułość TTC, plastry należy chronić przed światłem w tym czasie.
10. Przekroje zabarwione TTC są skanowane i digitalizowane. Za pomocą programu Image J (NIH, Bethesda, MD) dla każdego poziomu mierzy się: obszar zawału (obszar niezabarwiony), powierzchnię półkuli ipsilateralnej oraz powierzchnię półkuli kontralateralnej. Procent obszaru zawału na plaster oblicza się jako: (powierzchnia zawału/powierzchnia półkuli ipsilateralnej) lub A₁, A₂, A₃ i A₄. Procentowa objętość zawału jest obliczana jako suma (A₁ + A₂ + A₃ + A₄) * 3mm. Powierzchnie uszkodzeń kory lub prążkowia mogą być również osobno ilościowo określone w podobny sposób.

Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Reprezentatywne poziomy coronalne 1-4 w HIE barwione TTC.

Przekroje koronalne barwione TTC wykazują obszar zawału (na biało).

Dyskusja

Gryzoniowy model postnatalnego HIE (encefalopatii niedotlenieniowo-ischemicznej) jest uznanym modelem, który odzwierciedla niedotlenienie mózgu występujące w okresie okołoporodowym u noworodków. Obszerne badania charakterystyki histologicznej i immunocytochemicznej wykazały, że 7-dniowe gryzonie wykazują dojrzałość mózgu analogiczną do ludzkiego płodu w trzecim trymestrze ⁷. Model HIE u gryzoni dostarczył cennych informacji na temat mechanizmów uszkodzenia mózgu w wyniku niedotlenienia okołoporodowego ²

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
szczury Sprague-Dawley (młode）	Zwierzę	Charles River Laboratories
izofluran	Chirurgia	Baxter Internationl Inc.
mieszanka gazowa 8% tlenu / 92% azotu	Chirurgia	Airgas
chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolium	Odczynnik	Sigma-Aldrich	T8877
bufor fosforanowy (PBS) pH 7.4	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies
paraformaldehyd	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P6148