$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
I. Przegląd schematyczny:
W niniejszym filmie zaprezentowano poszczególne etapy immunohistochemii w preparatach całych zarodków kurzych. Najpierw zarodek zostaje utrwalony w PFA [IHC1]. Następnie wygasza się endogenną aktywność peroksydazy [IHC2]. Potem zarodek poddaje się inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym [IHC3]. Po kilku etapach przemywania zarodek inkubuje się z przeciwciałem drugorzędowym [IHC4]; reakcję barwną ujawnia się przy użyciu DAB [IHC5], a barwienie przeciwciałami przybiera kolor pomarańczowy [IHC6].
Część 1: Fixowanie embrionów
- Aby przeprowadzić immunohistochemię całych preparatów embrionów kurczęt, najpierw otwórz jajo, delikatnie stukając w skorupkę pęsetą i usuwając jej fragmenty.
- Za pomocą pęsety usuń gęste białko jaja, a następnie za pomocą pęsety anatomicznej przechyl worek żółtkowy tak, aby embrion był skierowany ku górze.
- Używając precyzyjnych nożyczek, wytnij kwadrat z worka żółtkowego wokół embrionu. Usuń embrion z żółtka za pomocą łyżeczki i umieść go w naczyniu zawierającym PBS.
- Pod mikroskopem sekcyjnym ostrożnie usuń błony oraz resztki żółtka, a następnie przenieś embrion do nowego naczynia z PBS.
- Unieruchom embrion pęsetą i szpilkami entomologicznymi, a następnie odessaj PBS. Zastąp go 4% PFA w PBS i pozostaw embrion do utrwalenia na 1h w RT.
Część 2: Przygotowanie embrionów do etapu inkubacji z przeciwciałami
- Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego, we wszystkich poniższych krokach należy używać ddH2O.
- Po utrwaleniu zarodka odessać roztwór utrwalający i zutylizować go zgodnie z procedurami dla odpadów chemicznych. Napełnić szalkę PBS.
- Następnie, używając nożyka do mikrodysekcji, wyciąć kwadrat wokół zarodka, aby usunąć błony pozazarodkowe. Usunąć szpilki entomologiczne za pomocą pęsety.
- Po usunięciu szpilek przenieść zarodek za pomocą pipety Pasteura z zaokrąglonym końcem do fiolki scyntylacyjnej zawierającej PBT (PBS pH 7.4, 0.5% Triton X).
- Przemyć zarodek w PBT trzykrotnie po 10 minut za każdym razem.
- Usunąć PBT z fiolki scyntylacyjnej i zastąpić go roztworem PBTx zawierającym 0.3% H2O2 w celu inaktywacji potencjalnej endogennej peroksydazy.
- Inkubować przez 2 hr w RT na nutatorze.
- Przemyć zarodek w PBT trzykrotnie po 10 minut, a następnie trzykrotnie po 30 minut za każdym razem.
Część 3: Inkubacja z przeciwciałami
- Aby przeprowadzić barwienie zarodka przeciwciałem, należy rozpocząć od płukania zarodka przez jedną godzinę w buforze blokującym lub 1% BSA/1% NGS/PBT (stosujemy NGS, ponieważ przeciwciało wtórne zostało wytworzone u kozy). Inkubować na nutatorze przez jedną godzinę w RT.
- Rozcieńczyć przeciwciało pierwotne w stosunku 1:1 w buforze blokującym i inkubować zarodek w tym roztworze przez 2 dni w 4°C na nutatorze. Współczynnik rozcieńczenia przeciwciała pierwotnego zależy od wybranego przeciwciała. W tym przypadku stosujemy przeciwciało z Developmental Studies Hybridoma Bank, które jest dostarczane w formie supernatantu. Rozcieńczamy je 1:1 w buforze blokującym.
- Następnie przeprowadzić 3 10-minutowe płukania w PBT, a następnie 3 1-godzinne płukania w PBT.
- Po płukaniu rozcieńczyć przeciwciało wtórne 1:2500 w buforze blokującym (w tym przypadku peroksydazą sprzężone przeciwciało kozie anty-mysie IgG (H+L)) i inkubować zarodek w tym roztworze O/N w 4°C na nutatorze.
- Przeprowadzić 3 10-minutowe płukania w PBT, a następnie 3 1-godzinne płukania w PBT.
Część 3: Reakcja barwna
- Aby wywołać reakcję barwną w zbarwionym embrionie, należy najpierw przeprowadzić dwa 20-minutowe przemycia w buforze Tris (100mM Tris HCl, pH 7.4).
- W międzyczasie rozpuścić substrat DAB (tetrahydrochlorek 3,3’-diaminobenzydyny) w buforze Tris w stężeniu 500μg/ml pod wyciągiem; roztwór przechowywać w ciemności, w lodzie.
- Usunąć ostatnią porcję buforu Tris z probówki zawierającej embrion i zastąpić ją 5ml roztworu DAB z kroku 3.2. Przechowywać w ciemności na nutatorze przez 20 mn. Zużyty końcówkę do pipety Eppendorf wyrzucić do pojemnika z 10% roztworem wybielacza w celu dekontaminacji DAB.
- W międzyczasie przygotować w lodzie roztwór stokowy 0.3% H2O2 w dH2O.
- Dodać 50μl roztworu stokowego H2O2 do probówki zawierającej embriony w DAB. Przechowywać w ciemności. Po 1-2 minutach monitorować reakcję pod mikroskopem.
Część 4: Przetwarzanie zarodków do fotografii i histologii
- Po zakończeniu reakcji barwnej zutylizować DAB w wiadrze z wybielaczem. Zastąpić go 5 ml wody z kranu.
- Przeprowadzić dwa 10-minutowe przemycia w PBS.
- W celu przygotowania do fotografii i cięcia w parafinie, odwodnić w serii etanolu (25%, 50%, 75% i 100%) po 10 minut w każdym stężeniu.
- Zastąpić etanol 0,5 - 1 ml olejkiem cedrowym (sprawi to, że embrion stanie się przezroczysty). Wykonać dokumentację fotograficzną w olejku cedrowym.
- Po fotografii umieścić embrion z powrotem w fiolce i zastąpić olejek cedrowy 100% etanolem. Powtórzyć etapy odwadniania w etanolu.
- Zastąpić etanol 5% Fast green FCF w 100% etanolu i inkubować przez 3 minuty (ten etap sprawi, że embriony będą widoczne podczas badania histologicznego). Zastąpić roztwór Fast green FCF 100% etanolem i przygotować preparaty do histologii.
Reprezentatywne wyniki:
Na poniższych przykładach zarodki zostały poddane sekcji na etapach HH 10 (A), 12 (B) oraz 11 (C); zarodki wykazują ekspresję PAX 7 w powstających grzebieniach neuronalnych, a także w somytach i rurce neuralnej (A,B); na zdjęciu (C) struna grzbietowa jest oznakowana przeciwciałem 15.3B9 (Not-1) (przeciwciała dostarczone przez Developmental Studies Hybridoma Bank).