$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
I. Przegląd schematyczny:
Niniejszy film przedstawia poszczególne etapy immunohistochemii całego preparatu (whole mount) u zarodka kurczaka. W pierwszej kolejności zarodek zostaje utrwalony w PFA [IHC1]. Następnie wygasza się endogenną aktywność peroksydazy [IHC2]. Zarodek jest następnie inkubowany z przeciwciałem pierwszorzędowym [IHC3]. Po kilku etapach przemywania zarodek jest inkubowany z przeciwciałem drugorzędowym [IHC4]; reakcję barwną ujawnia się przy użyciu DAB [IHC5], a barwienie przeciwciałami przybiera kolor pomarańczowy [IHC6].
Część 1: Fixacja embrionów
- Aby przeprowadzić immunohistochemię całego preparatu zarodków kurczęt, najpierw należy otworzyć jajo, opukując skorupkę pęsetą i usuwając jej fragmenty.
- Za pomocą pęsety należy usunąć gęste białko jaja, a następnie za pomocą pęsety grubą przechylić worek żółtkowy tak, aby zarodek był skierowany ku górze.
- Używając precyzyjnych nożyczek, wyciąć kwadratowy fragment worka żółtkowego wokół zarodka. Wyjąć zarodek z żółtka za pomocą łyżeczki i umieścić w naczyniu zawierającym PBS.
- Pod mikroskopem sekcyjnym ostrożnie usunąć błony oraz żółtko, a następnie przenieść zarodek do nowego naczynia z PBS.
- Przymocować zarodka do podłoża za pomocą pęsety i szpilek entomologicznych, a następnie odessać PBS. Zastąpić go 4% PFA w PBS i pozostawić zarodek do utrwalenia na 1h w RT.
Część 2: Przygotowanie embrionów do etapu inkubacji z przeciwciałami
- Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego, we wszystkich poniższych krokach należy używać ddH2O.
- Po utrwaleniu zarodka odessać roztwór utrwalający i zutylizować go zgodnie z procedurą usuwania odpadów chemicznych. Napełnić naczynie roztworem PBS.
- Następnie, używając noża do mikrodyssekcji, wyciąć kwadrat wokół zarodka, aby usunąć błony pozazarodkowe. Usunąć szpilki entomologiczne za pomocą pincety.
- Po usunięciu szpilek, za pomocą pipety Pasteura z tępym końcem przenieść zarodek do fiolki scyntylacyjnej zawierającej PBT (PBS pH 7.4, 0,5% Triton X).
- Przemyć zarodek roztworem PBT trzykrotnie, po 10 minut każde płukanie.
- Usunąć PBT z fiolki scyntylacyjnej i zastąpić go roztworem PBTx zawierającym 0,3% H2O2 w celu inaktywacji potencjalnej endogennej peroksydazy.
- Inkubować przez 2 hr w RT na nutatorze.
- Przemyć zarodek roztworem PBT trzykrotnie po 10 minut, a następnie trzykrotnie po 30 minut każde płukanie.
Część 3: Inkubacja z przeciwciałem
- Aby przeprowadzić barwienie zarodka przeciwciałem, należy najpierw płukać zarodek przez jedną godzinę w buforze blokującym lub 1% BSA/1% NGS/PBT (stosujemy NGS, ponieważ przeciwciało wtórne zostało wytworzone u kozy). Inkubować na nutatorze przez jedną godzinę w RT.
- Rozcieńczyć przeciwciało pierwotne 1:1 w buforze blokującym i inkubować zarodek w tym roztworze przez 2 dni w 4°C na nutatorze. Współczynnik rozcieńczenia przeciwciała pierwotnego zależy od wybranego przeciwciała. W tym przypadku stosujemy przeciwciało z Developmental Studies Hybridoma Bank, dostarczone w formie supernatantu. Rozcieńczamy je 1:1 w buforze blokującym.
- Następnie przeprowadzić 3 10-minutowe płukania w PBT, a następnie 3 1-godzinne płukania w PBT.
- Po płukaniu rozcieńczyć przeciwciało wtórne 1:2500 w buforze blokującym (w tym przypadku jest to sprzężone z peroksydazą przeciwciało kozie anty-mysie IgG (H+L)) i inkubować zarodek w tym roztworze O/N w 4°C na nutatorze.
- Przeprowadzić 3 10-minutowe płukania w PBT, a następnie 3 1-godzinne płukania w PBT.
Część 3: Reakcja barwna
- Aby wywołać reakcję barwną w zbarwionym zarodku, należy najpierw przeprowadzić dwa 20-minutowe płukania w buforze Tris (100mM Tris HCl, pH 7.4).
- W tym czasie rozpuścić substrat DAB (tetrahydrochlorowodorek 3,3’-diaminobenzydyny) w buforze Tris w stężeniu 500μg/ml pod wyciągiem; roztwór przechowywać w ciemności, na lodzie.
- Usunąć ostatnią porcję buforu Tris z probówki zawierającej zarodek i zastąpić ją 5ml roztworu DAB z punktu 3.2. Przechowywać w ciemności na nutatorze przez 20 mn. Końcówkę do probówek Eppendorf wyrzucić do pojemnika z 10% roztworem wybielacza w celu dekontaminacji DAB.
- W tym czasie przygotować 0.3% roztwór zapasowy H2O2 w dH2O na lodzie.
- Dodać 50μl roztworu zapasowego H2O2 do probówki z zarodkami w DAB. Przechowywać w ciemności. Po 1-2 minutach monitorować reakcję pod mikroskopem.
Część 4: Obróbka embrionów do fotografii i histologii
- Po zakończeniu reakcji barwnej zutylizować DAB w pojemniku z wybielaczem. Zastąpić go 5 ml wody z kranu.
- Przeprowadzić dwa 10-minutowe przemycia w PBS.
- W celu przygotowania do fotografowania i cięcia w wosku, odwodnić w serii etanolu (25%, 50%, 75% i 100%) po 10 minut w każdym stężeniu.
- Zastąpić etanol 0,5 - 1 ml olejku cedrowego (spowoduje to przejrzystość zarodka). Wykonać fotografowanie w olejku cedrowym.
- Po fotografowaniu umieścić zarodek z powrotem w fiolce i zastąpić olejek cedrowy 100% etanolem. Powtórzyć etap odwadniania w etanolu.
- Zastąpić etanol 5% roztworem Fast green FCF w 100% etanolu i inkubować przez 3 minuty (ten etap sprawi, że zarodki będą widoczne w badaniu histologicznym). Zastąpić roztwór Fast green FCF 100% etanolem i przygotować do badania histologicznego.
Reprezentatywne wyniki:
Na poniższych przykładach zarodki zostały poddane sekcji w stadiach HH 10 (A), 12 (B) i 11 (C); zarodki wykazują ekspresję PAX 7 w powstających grzebieniach neuronalnych, a także w somytach i rurce nerwowej (A, B); na obrazie (C) notochorda została oznakowana przeciwciałem 15.3B9 (Not-1) (przeciwciała dostarczone przez Developmental Studies Hybridoma Bank).