Pobieranie krwi z amerykańskiego kraba podkowiastego, Limulus polyphemus

Podsumowanie

Amerykański krab podkowy, Limulus polyphemus, jest prawdopodobnie najdogodniejszym źródłem dużych ilości krwi wśród wszystkich bezkręgowców. Krew ma prosty skład, z tylko jednym typem komórek w krążeniu ogólnym – amebocytem ziarnistym – oraz tylko trzema dominującymi białkami w osoczu: hemocyjaniną, białkami reaktywnymi C oraz α2-makroglobuliną. Krew pobierana jest z serca, a komórki krwi i osocze rozdziela się poprzez wirowanie.

Streszczenie

Krab podkowy posiada najlepiej scharakteryzowany układ odpornościowy spośród wszystkich długowiecznych bezkręgowców. Badania nad odpornością krabów podkówek zostały ułatwione dzięki możliwości łatwego pobierania dużych objętości krwi oraz jej prostemu składowi. W krążeniu ogólnym krabów podkówek występuje tylko jeden typ komórek – amebocyty ziarniste. Plazma ma zasolenie odpowiadające wodzie morskiej i zawiera tylko trzy obfite białka: hemocyjaninę, która jest białkiem oddechowym; białka C-reaktywne, pełniące funkcję w cytolitycznej destrukcji obcych komórek, w tym komórek bakteryjnych; oraz α2-makroglobulinę, która hamuje proteazy inwazyjnych patogenów. Krew pobiera się poprzez bezpośrednią punkcję serca w warunkach minimalizujących kontaminację lipopolisacharydem (znanym również jako endotoksyna, LPS), który jest produktem bakterii Gram-ujemnych. Od dużego zwierzęcia można uzyskać od 200 do 400 mL krwi. W celu badania plazmy, komórki krwi są natychmiast usuwane z plazmy poprzez wirowanie, a następnie plazma może zostać frakcjonowana na białka składowe. Komórki krwi wygodnie bada się mikroskopowo, pobierając niewielkie objętości krwi do izotonicznej soli fizjologicznej wolnej od LPS (0.5 M NaCl) w warunkach umożliwiających bezpośrednią obserwację mikroskopową poprzez umieszczenie jednego lub więcej szkiełek nakrywkowych wolnych od LPS na powierzchni szalki hodowlanej, a następnie zamocowanie tych szkiełek w prostych komorach obserwacyjnych po przyleganiu komórek. Drugą metodą przygotowania do bezpośredniej obserwacji jest pobranie 3 - 5 mL krwi do wolnej od LPSy szalki embrionalnej, a następnie wycięcie fragmentów agregatów amebocytów i przeniesienie ich do komory, w której tkanka znajduje się między preparatem a szkiełkiem nakrywkowym. W takim preparacie ruchome amebocyty migrują na powierzchnię szkiełka nakrywkowego, gdzie można je łatwo obserwować. System krzepnięcia krwi obejmuje agregację amebocytów oraz tworzenie pozakomórkowego skrzepu z białka – koaguliny, która jest uwalniana z ziarnistości wydzielniczych komórek krwi. Analiza biochemiczna przemytych komórek krwi wymaga, aby nie doszło do agregacji i degranulacji, co można osiągnąć poprzez pobieranie krwi do 0,1 objętości 2% Tween-20 w 0.5 M NaCl wolnym od LPS, a następnie wirowanie komórek i przemywanie ich 0.5 M NaCl.

Protokół

Cechy anatomiczne kraba podkowiastego istotne dla procesu upustu krwi (Rys. 1)

Rysunek 1

1. Trzy główne części ciała, od przodu do tyłu, to prosome (P), opistosome (O) oraz telson (T) ¹.
2. Przednim i bocznym wolnym brzegiem prosome jest kołnierz.
3. Najbardziej tylne wcięcie opistosome, w któr....

Dyskusja

Istnieją cztery gatunki skrzypłocza: Limulus polyphemus ze wschodniego wybrzeża Ameryki Północnej oraz trzy gatunki występujące od Japonii po Zatokę Bengalską. Zwierzę to jest identyfikowane jako „żywa skamielina”, ponieważ anatomicznie podobne formy odnaleziono w zapisie kopalnym sprzed 445 milionów lat ²⁷. Skrzypłocz jest zwierzęciem długowiecznym; osiąga dojrzałość w wieku od 10 do 13 lat i żyje co najmniej 20 lat ²⁸. Mimo że był on intensywnie odławiany jako przynęta w rybołówstwie węgo.......