Pobieranie krwi z amerykańskiego kraba podkowiastego, Limulus polyphemus

Podsumowanie

Amerykański krab podkowy, Limulus polyphemus, jest prawdopodobnie najdogodniejszym źródłem dużych ilości krwi wśród wszystkich bezkręgowców. Krew ma prosty skład, z tylko jednym typem komórek w krążeniu ogólnym – amebocytem ziarnistym – oraz tylko trzema dominującymi białkami w osoczu: hemocyjaniną, białkami reaktywnymi C oraz α2-makroglobuliną. Krew pobierana jest z serca, a komórki krwi i osocze rozdziela się poprzez wirowanie.

Streszczenie

Krab podkowy posiada najlepiej scharakteryzowany układ odpornościowy spośród wszystkich długowiecznych bezkręgowców. Badania nad odpornością krabów podkówek zostały ułatwione dzięki możliwości łatwego pobierania dużych objętości krwi oraz jej prostemu składowi. W krążeniu ogólnym krabów podkówek występuje tylko jeden typ komórek – amebocyty ziarniste. Plazma ma zasolenie odpowiadające wodzie morskiej i zawiera tylko trzy obfite białka: hemocyjaninę, która jest białkiem oddechowym; białka C-reaktywne, pełniące funkcję w cytolitycznej destrukcji obcych komórek, w tym komórek bakteryjnych; oraz α2-makroglobulinę, która hamuje proteazy inwazyjnych patogenów. Krew pobiera się poprzez bezpośrednią punkcję serca w warunkach minimalizujących kontaminację lipopolisacharydem (znanym również jako endotoksyna, LPS), który jest produktem bakterii Gram-ujemnych. Od dużego zwierzęcia można uzyskać od 200 do 400 mL krwi. W celu badania plazmy, komórki krwi są natychmiast usuwane z plazmy poprzez wirowanie, a następnie plazma może zostać frakcjonowana na białka składowe. Komórki krwi wygodnie bada się mikroskopowo, pobierając niewielkie objętości krwi do izotonicznej soli fizjologicznej wolnej od LPS (0.5 M NaCl) w warunkach umożliwiających bezpośrednią obserwację mikroskopową poprzez umieszczenie jednego lub więcej szkiełek nakrywkowych wolnych od LPS na powierzchni szalki hodowlanej, a następnie zamocowanie tych szkiełek w prostych komorach obserwacyjnych po przyleganiu komórek. Drugą metodą przygotowania do bezpośredniej obserwacji jest pobranie 3 - 5 mL krwi do wolnej od LPSy szalki embrionalnej, a następnie wycięcie fragmentów agregatów amebocytów i przeniesienie ich do komory, w której tkanka znajduje się między preparatem a szkiełkiem nakrywkowym. W takim preparacie ruchome amebocyty migrują na powierzchnię szkiełka nakrywkowego, gdzie można je łatwo obserwować. System krzepnięcia krwi obejmuje agregację amebocytów oraz tworzenie pozakomórkowego skrzepu z białka – koaguliny, która jest uwalniana z ziarnistości wydzielniczych komórek krwi. Analiza biochemiczna przemytych komórek krwi wymaga, aby nie doszło do agregacji i degranulacji, co można osiągnąć poprzez pobieranie krwi do 0,1 objętości 2% Tween-20 w 0.5 M NaCl wolnym od LPS, a następnie wirowanie komórek i przemywanie ich 0.5 M NaCl.

Protokół

Cechy anatomiczne kraba podkowiastego istotne dla procesu upustu krwi (Rys. 1)

Rysunek 1

1. Trzy główne części ciała, od przodu do tyłu, to prosome (P), opistosome (O) oraz telson (T) ¹.
2. Przednim i bocznym wolnym brzegiem prosome jest kołnierz.
3. Najbardziej tylne wcięcie opistosome, w którym znajduje się staw telsonu, to zatoka końcowa.
4. Staw, w którym łączą się prosome i opistosome, to zawias (H).
5. Serce znajduje się wzdłuż grzbietowej linii środkowej, bezpośrednio pod karapaksem prosome i opistosome² (Rys. 2).
   
   
   
   
   Rysunek 2
   
   

Ogólne uwagi, sterylność i ochrona przed ekspozycją na lipopolisacharyd (endotoksynę)

1. Głównymi przeszkodami w skutecznym pobraniu krwi są zlepianie się komórek, egzocytoza oraz tworzenie skrzepu koaguliny. Agregacja komórek i egzocytoza są stymulowane przez lipopolisacharyd (znany również jako endotoksyna, LPS), produkt bakterii Gram-ujemnych. Stężenie progowe LPS wywołujące egzocytozę w przypadku komórek przemytych wynosi 0,1 - 1 mg/mL, jednak komórki zawieszone w osoczu są aktywowane przez znacznie niższe stężenia ³. Endotoksyna nie zostaje dezaktywowana przez zwykłe autoklawowanie i można założyć, że jest obecna na powierzchniach oraz w roztworach i odczynnikach, które nie posiadają certyfikatu wolności od endotoksyn.
2. Aby zmniejszyć ryzyko krzepnięcia podczas pobierania krwi, do upustu należy wybierać wyłącznie zdrowe, nieuszkodzone zwierzęta. Zwierzęta należy schłodzić wstępnie przez 1-2 h w pomieszczeniu o temperaturze 4°C. Należy stosować technikę sterylną i unikać zanieczyszczenia endotoksynami.
3. W medycynie klinicznej stosuje się 3% sól fizjologiczną wolną od LPS, którą można nabyć od dostawców medycznych (patrz tabela specjalistycznych odczynników i materiałów). LPS można usunąć ze szkła i metalu poprzez inkubację w temperaturze 180°C przez 4 godziny. Sterylne, jednorazowe igły do strzykawek, szalki Petriego oraz probówki wirówkowe z zakrętką są wolne od LPS i mogą być używane bez modyfikacji, o ile zachowana zostanie prawidłowa technika sterylna.
4. Stabilność komórek krwi u różnych zwierząt jest zróżnicowana; u niektórych osobników dochodzi do spontanicznej degranulacji, co prowadzi do powstania skrzepu koaguliny, nawet jeśli krew pobierano z najwyższą starannością. Komórki krwi u innych osobników krabów podkowiastych są znacznie bardziej stabilne i przy zachowaniu odpowiednich procedur pozostają w pełni ziarniste podczas upustu oraz oddzielania komórek od osocza.
5. Zgłoszono zastosowanie kilku substancji stabilizujących komórki krwi po pobraniu, w tym kofeiny (pobieranie do 0,25 objętości 10 mM kofeiny w 3% NaCl wolnym od LPS) ⁴, propranololu (stężenie końcowe 1 mM) ⁵, dimetylosulfotlenku ⁶, chelatowania kationów dwuwartościowych (pobieranie do równej objętości 0,1 M dekstrozy, 0,03 M cytrynianu sodu, 0,026 M kwasu cytrynowego, 10 mM dwusodowego etylenodiaminotetraoctanu (Na₂EDTA), pH 4,6) ⁷, inhibitorów szlaków białka G i fosfolipazy C (toksyny cholery i krztuśca, U73122) ⁸, zastąpienia chlorków anionem izetionianowym ⁹, blokerów kanałów chlorkowych ⁹, antagonistów cyklicznego AMP ⁹, odczynników sulfhydrylowych (5 mM N-etylomaleimidu, NEM) ⁵ oraz detergentu aktywnego błonowo Tween-20 (pobieranie do 0,1 objętości 2% Tween-20 w 0,5 M NaCl wolnym od LPS).

Materiały i odczynniki do upuszczania krwi z kraba podkowiastego: pobieranie dużych objętości krwi

1. jeden lub więcej dużych, nieuszkodzonych krabów podkowiastych
2. butelka z rozpylaczem zawierająca 70% etanol
3. chusteczki Kimwipes
4. igła 14 G
5. wytrzymała pęseta
6. wiaderko z lodem
7. jednorazowe plastikowe probówki wirówkowe z nakrętką 50 mL
8. statyw do probówek 50 mL
9. wirówka stołowa
10. sterylne pipety serologiczne 50 mL
11. gruszka do pipet
12. jednorazowy sterylny aparat do filtracji
13. pompa próżniowa
14. roztwór 3% NaCl wolny od LPS (do pobierania komórek krwi)
15. Tween-20 (do pobierania komórek krwi)

Przygotowania do upustu krwi w dużej objętości

1. Do pobrania krwi należy wykorzystać duże, zdrowe zwierzęta. Przed zabiegiem schłodzić zwierzę przez 1 h w chłodni.
2. Przygotować wygodne stanowisko pracy z stabilną podstawą pod wiaderko z lodem o wysokości około 0,3 m (odpowiedni będzie jednorazowy styropianowy pojemnik transportowy do przesyłek z odczynnikami w niskich temperaturach) oraz niskim krzesłem dla operatora. Wiaderko z lodem ustawia się na podstawie, a krzesło dosuwa do zestawu. Pozycja powinna umożliwiać komfortowe siedzenie przez dłuższy czas z łokciami opartymi o uda, podczas gdy lewa ręka trzyma szamoczącego się paginate kraba podkowca nad probówkami do pobierania krwi, które są ustawione pionowo w lodzie w wiaderku.
3. W łaźni lodowej schłodzić wcześniej od 4 do 6 jednorazowych plastikowych probówek wirówkowych o pojemności 50 mL z zakrętkami. Probówki ustawia się pionowo w lodzie wokół obwodu pojemnika z łaźnią. Bezpośrednio przed rozpoczęciem pobierania krwi, zgodnie z zasadami aseptyki, zdjąć zakrętki z probówek i położyć je na sąsiednim stole.
4. Zdjąć nasadkę z igły 14 ga i za pomocą solidnej pęsety poluzować igłę w prowadnicy, nie wyjmując jej całkowicie. NALEŻY ZACHOWAĆ STERYLNOŚĆ. NIE WOLNO DOTYKAĆ ŻADNEJ CZĘŚCI IGŁY PALCAMI. Umieścić prowadnicę z igłą na sąsiednim blacie w taki sposób, aby wystający koniec igły nie stykał się z żadną powierzchnią, co pozwoli zachować jej sterylność.
5. Zwilżyć chusteczkę Kimwipe 70% etanolem.

Upuszczanie krwi zwierzęciu (instrukcja dla operatora praworęcznego)

1. Unieruchomienie zwierzęcia do upustu krwi: chwyć zwierzę lewą ręką tak, aby cztery palce przylegały do przedniej krawędzi prosomy, a kciuk obejmował tylną część opisthosomy u podstawy ogona (zatoka końcowa). Powierzchnia brzuszna zwierzęcia powinna być skierowana do wnętrza dłoni. Telson spoczywa wzdłuż podstawy kciuka i wystaje poza nadgarstek. Delikatnie zegnij zwierzę tak, aby prosoma i opisthosoma znajdowały się pod kątem prostym względem siebie (Rysunek 3a).
   
   
   
   Rysunek 3
   
   
2. Oczyść odsłonięty staw zawiasowy łączący prosomę i opisthosomę za pomocą 70% etanolu naniesionego zwilżoną chusteczką Kimwipe (Rysunek 3b).
3. Obróć lewą rękę tak, aby palce 2–4 znajdowały się na górze, a powierzchnia grzbietowa zwierzęcia była skierowana ku górze. Prawą ręką wprowadź igłę strzykawki 14 ga, wciąż w osłonie ochronnej, między drugi a trzeci palec lewej ręki. Chwyć pęsetą za nasadę igły i usuń osłonę ochronną (Rysunek 3c). Obróć lewą rękę tak, aby grzbiet dłoni był skierowany w lewo, kciuk i palec wskazujący były u góry, a zwierzę znajdowało się do góry nogami, z powierzchnią grzbietową skierowaną w stronę prawej ręki. Ustaw nasadę igły nad pierwszą z probówek do zbierania o pojemności 50 mL i zorientuj zwierzę tak, aby ostry koniec igły był skierowany w stronę stawu zawiasowego, a trzon igły był równoległy do linii pośrodkowej grzbietu (Rysunek 3d). Wprowadź ostry koniec igły przez staw zawiasowy do światła serca, utrzymując igłę równolegle do linii pośrodkowej grzbietu, wzdłuż tej linii, z nasadą igły wciąż umieszczoną nad otworem probówki. Igłę wprowadza się na głębokość około 1–2 cm do części serca znajdującej się w prosomie. Natychmiast po nakłuciu serca krew zacznie gwałtownie wypływać (Rysunek 4a, strzałka), dlatego ważne jest, aby wylot igły strzykawki znajdował się nad otworem probówki w celu zebrania tego początkowego wyrzutu krwi.
4. Krew będzie początkowo wypływać z serca ciągłym strumieniem, który po zebraniu około 30–50 mL zwolni do pojedynczych kropli (Rysunek 4b). Aby poprawić przepływ krwi, warto rozważyć lekką zmianę orientacji końcówki igły. Przechyl igłę w górę lub w dół, w lewo lub w prawo; przesuń jej końcówkę głębiej do serca lub wycofaj bliżej stawu zawiasowego, aby znaleźć pozycję optymalizującą przepływ krwi. Nie uciskaj zwierzęcia zbyt mocno, ponieważ grozi to uszkodzeniem organizmu i może spowodować inicjację krzepnięcia krwi poza naczyniami.
   
   
   
   Rysunek 4
   
   
5. W miarę napełniania się każdej probówki krwią, obracaj łaźnię lodową, aby pod wylot igły podstawić kolejną pustą probówkę.
6. Gdy tempo upustu krwi spadnie, istnieje ryzyko cofnięcia się powietrza przez igłę do serca. Może to nastąpić, gdy zwierzę wyprostuje ciało, co obniży ciśnienie krwi. Należy starać się zapobiegać temu zjawisku, utrzymując zwierzę w pozycji zgiętej lub pozwalając na bardzo powolne prostowanie.
7. Gdy zwierzę przestanie oddawać krew, wyjmij igłę z serca. Zamknij probówki i natychmiast wiruj w wirówce laboratoryjnej przy 1000 RPM przez 5 min. Komórki krwi utworzą zwarte pellety na dnie probówek. Ponieważ wszystkie składniki odpowiedzialne za krzepnięcie krwi znajdują się w pęcherzykach wydzielniczych komórek krwi, oddzielenie osocza od komórek eliminuje ryzyko krzepnięcia osocza.
8. Niezbędne jest uniknięcie krzepnięcia krwi poza naczyniami. Ryzyko krzepnięcia zmniejszają następujące środki: schłodzenie zwierzęcia przed zabiegiem i utrzymywanie probówek w łaźni lodowej; delikatne obchodzenie się ze zwierzęciem; zmniejszenie szybkości wypływu krwi z igły strzykawki; wirowanie krwi natychmiast po pobraniu; unikanie zanieczyszczenia igieł i probówek endotoksynami; zachowanie procedur sterylnych. Jak wspomniano powyżej, niektóre osobniki mają szczególnie reaktywne komórki krwi, które inicjują egzocytozę nawet przy zachowaniu tych środków ostrożności.
9. Po wirowaniu sprawdź probówki pod kątem oznak krzepnięcia krwi – obecności pasm komórek i galaretowatego materiału skrzepu przyklejonego do ścianek probówki, galaretowatego materiału na szczycie skrzepu lub, co gorsza, dużych ilości skrzepu z uwięzionymi komórkami krwi w kolumnie cieczy (Rysunek 4c, strzałka). Materiał z takich probówek jest surowicą, a nie osoczem, i zawiera produkty wydzielnicze komórek krwi.
10. Przenieś osocze do sterylnych probówek za pomocą sterylnej pipety serologicznej 50 mL. Zachowaj ostrożność podczas pipetowania, aby nie zaspirować komórek z pelletu na dnie probówki. Najlepiej pozostawić kilka mL osocza nad pelletem, aby go nie zaburzyć.
11. Opisana powyżej procedura służy do pobierania dużych objętości osocza niezanieczyszczonego produktami wydzielniczymi komórek krwi. Aby pobrać duże objętości przemytych komórek krwi, zbieraj krew do 0,1 objętości 2% Tween-20 rozpuszczonego w 3% roztworze NaCl wolnym od LPS. Wiruj komórki delikatnie przez 10 minut, aby uzyskać luźny pellet, a następnie przemyj komórki kilkukrotnie w 3% NaCl wolnym od LPS. Ekstrakt komórek zawierający produkty wydzielnicze można przygotować poprzez lizę przemytych komórek w destylowanej wodzie wolnej od LPS. Lizat ten zawiera różnorodne białka i peptydy biorące udział w przeciwmikrobowej obronie immunologicznej ^10,11, a także koagulogen – zymogen białka strukturalnego zewnątrzkomórkowego skrzepu krwi – oraz zestaw proteaz przekształcających koagulogen w koagulinę, formę białka polimeryzującą w fibryle skrzepu ¹². Ekstrakt ten jest podobny do produktu dostępnego komercyjnie, lizatu amebocytów Limulus (LAL), który jest stosowany do wykrywania lipopolisacharydu ¹³. Kaskada proteaz odpowiedzialna za proteolityczną modyfikację koagulogenu do koaguliny jest aktywowana przez LPS ¹⁴.
12. Postępowanie ze zwierzętami po upuście krwi. Upust krwi przeprowadzony powyższymi metodami jest dobrze tolerowany przez zwierzę. Pracując w Marine Biological Laboratory w Woods Hole, zwracam zwierzęta do oceanu po upuście krwi z przekonaniem, że przeżyją. Jeśli zwierzęta są utrzymywane w akwariach poza ich naturalnym zasięgiem, można przeprowadzać upust krwi wielokrotnie, raz lub dwa razy w miesiącu. Jak opisano poniżej, zwierzęta w niewoli wymagają wody wysokiej jakości i częstego karmienia w celu utrzymania zdrowia. Eutanazję można przeprowadzić poprzez zniszczenie zwoju grzbietowego, który znajduje się w linii pośrodkowej grzbietu między oczami.

Opracowanie i przechowywanie osocza

1. Ochrona przed proteazami. Jeśli plazma ma zostać wykorzystana do oczyszczania białek, należy ją poddać działaniu inhibitorów proteaz natychmiast po pobraniu. Należy dodać fenylometylosulfonylofluoryd (PMSF) do stężenia końcowego 1 mM. PMSF przechowuje się jako 0,1 M roztwór stokowy w DMSO lub etanolu. Jest on dość niestabilny w wodzie ¹⁵, więc nie można na nim polegać w celu zapewnienia trwałej ochrony, jednak dodanie go bezpośrednio po oddzieleniu plazmy od komórek krwi dezaktywuje niewielkie ilości proteaz, które mogły zostać uwolnione z komórek.
2. Filtracja sterylna: plazmę należy wysterylizować poprzez ultrafiltrację próżniową, używając jednorazowego urządzenia do filtracji średniej wyposażonego w filtr o rozmiarze porów 0,22 mm. Filtry te mają tendencję do zatykania się. Aby ograniczyć ten problem, zaleca się wirowanie plazmy przed filtrowaniem. W przypadku przetwarzania dużych objętości plazmy zaleca się najpierw wstępne przefiltrowanie plazmy za pomocą filtra Millipore o rozmiarze porów 1 mm, a następnie za pomocą filtra Millipore o rozmiarze porów 0,45 mm.
3. Plazmę można chronić przed zanieczyszczeniem bakteryjnym poprzez dodanie NaN₃ do stężenia końcowego 0,2 mg/mL lub poprzez filtrację sterylną. Niesterylnej plazmy nie powinno się przechowywać dłużej niż 2 dni bez zastosowania jednej z tych dwóch środków przeciwbakteryjnych.
4. Krzepnięcie krwi. W przeciwieństwie do ssaczego układu krzepnięcia, plazma Limulus nie zawiera żadnych elementów odpowiedzialnych za krzepnięcie krwi. Zamiast tego cały mechanizm tworzenia skrzepu, białko strukturalne skrzepu (koagulogen) oraz system proteaz, które przetwarzają koagulogen, czyniąc go zdolnym do polimeryzacji w nierozpuszczalny skrzep, znajdują się w ziarnistościach wydzielniczych komórek krwi ¹⁶. Zatem jeśli komórki krwi zostaną usunięte, zanim zdążą przejść egzocytozę, plazma będzie całkowicie wolna od białek odpowiedzialnych za krzepnięcie i pozostanie w stanie płynnym w nieskończoność.
5. Oczyszczanie białek. Hemocyjanina występuje w plazmie w stężeniu 40 mg/mL i jest 48-merem podjednostki o masie 70 kDa. Można ją wyizolować za pomocą ultrawirowania (40,000 X g, 8 h) lub filtracji żelowej z użyciem żywicy do wykluczania o dużym rozmiarze porów, takiej jak BioGel A5m ¹⁷. Białka reaktywne C występują w stężeniu 1 - 5 mg/mL i mogą być izolowane metodą powinowactwa na fosforyloetanoloaminie-Sefarozie, z elucją za pomocą chelatora wapnia ¹⁸. Inhibitor proteaz o szerokim spektrum, _α2-makroglobulinę, oczyszczono metodą filtracji żelowej na żywicy Sephacryl S-300 po usunięciu hemocyjaniny i białek reaktywnych C ¹⁹.

Badanie mikroskopowe ruchomych komórek krwi w hodowli

1. Tworzenie warstw amebocytów in vitro: do sterylnych plastikowych szalek Petriego dodaje się roztwór 3% NaCl wolny od LPS (1 mL dla szalki 35 mm, 2,5 mL dla szalki 60 mm, 6 mL dla szalki 90 mL). Krew pobiera się następnie poprzez punkcję serca metodą opisaną powyżej, z modyfikacją polegającą na użyciu sterylnej igły do strzykawki o rozmiarze 23 G i długości 1 cala zamiast igły 14 G. Krew spływa kropla po kropli z igły 23 G; 1 kroplę zbiera się do szalki 35 mm, 3 krople do szalki 60 mm i 9 kropli do szalki 100 mm. Następnie komórki krwi miesza się jednorodnie w roztworze 3% NaCl poprzez delikatne wirowanie, najpierw okrężnie, a następnie w przód i w tył. Preparat inkubuje się przez 5 min w temperaturze pokojowej, aby umożliwić przyleganie komórek krwi do powierzchni szalki, a następnie początkową sól fizjologiczną zastępuje się wybranym buforem³.
2. Jeśli celem jest utrzymanie przylegających do podłoża komórek krwi w stanie niedegranulowanym, początkową mieszaninę soli fizjologicznej i osocza krwi zastępuje się świeżym 3% NaCl wolnym od LPS. Osocze przyspiesza spontaniczną degranulację komórek krwi nawet wobec braku LPS, a jego usunięcie stabilizuje niedegranulowany stan komórek.
3. Jeśli początkowa sól fizjologiczna zostanie zastąpiona sterylnym osoczem, komórki krwi zmieniają swój owalny kształt charakterystyczny dla krążących komórek krwi (Rys. 5), spłaszczają się na podłożu, a następnie rozpoczynają degranulację i tworzenie warstwy zewnątrzkomórkowego skrzepu krwi z koaguliny nad warstwą spłaszczonych amebocytów ²⁰.
   
   
   
   Rysunek 5
   
   
4. Tworzenie kultur eksplantów zagregowanych amebocytów. Gdy krew jest pobierana w sterylnych warunkach wolnych od LPS, komórki krwi osiadają z zawiesiny i agregują, tworząc masę przypominającą tkankę. Odpowiednim naczyniem do tego celu jest szklana szalka do embrionów, którą oczyszczono z LPS poprzez inkubację przez 4 h w temperaturze 180⁰C. Krew pobraną do tego naczynia przez punkcję serca za pomocą igły 19 G inkubuje się przez 1–2 h w temperaturze pokojowej, a następnie wycina się fragmenty o boku 1 mm z agregatu amebocytów za pomocą sterylnej igły do strzykawki 18 G i umieszcza się je pomiędzy dwiema szkiełkami nakrywkowymi lub szkiełkiem nakrywkowym a podstawką, oddzielonymi fragmentami szkiełek nakrywkowych pełniącymi rolę dystansów. Po około pół godzinie amebocyty zaczynają migrować z peryferii eksplantu na szkiełko nakrywkowe (Rys. 6a), gdzie można je obserwować w kontraście fazowym lub optyce DIC ²¹. Początkowo migrujące komórki są zwarte, z hialinowymi pseudopodiami (Rys. 6b (m)), które są wyciągnięte nad podłożem migracyjnym, a następnie obniżane w kontakt z powierzchnią; ruch do przodu polega na przepływie ziarnistej cytoplazmy do pseudopodium ²². Później komórki spłaszczają się (Rys. 6b (f)), rozpoczynają degranulację (Rys. 6b (d)) i zaprzestają lokomocji ²³. Opisana tutaj komora hodowlana umożliwia perfuzję różnych czynników eksperymentalnych do komory w celu zbadania ich wpływu na ruchliwość komórek i egzocytozę ziarnistości ⁹. Rozszerzony przegląd metodologiczny hodowli amebocytów do badań mikroskopowych znajduje się w ²⁴.
   
   
   
   Rysunek 6
   
   

Utrzymanie dorosłych paginate krabów podkowiastych w akwariach

Opoka wymagają wysokiej jakości wody morskiej i mogą być utrzymywane w akwariach wyposażonych w system oczyszczania wody, który zapewnia filtrację cząsteczkową, napowietrzanie oraz denitryfikację wody²⁵. Zwierzęta należy karmić 2 lub 3 razy w tygodniu krewetkami, homarami, rybami lub kałamarnicami. Karmienie odbywa się poprzez wyjęcie zwierzęcia z akwarium, położenie go na grzbiecie i umieszczenie pokarmu w okolicy otworu gębowego. Jeśli zwierzę jest głodne, szybko zacznie połykać pokarm. W zależności od zaawansowania systemu wody morskiej, zwierzę powinno być utrzymywane przez około godzinę w osobnym pojemniku z wodą morską, aż do momentu defekacji, lub może zostać zwrócone do akwarium po rozpoczęciu żerowania. W celu długoterminowego utrzymania zwierzę należy trzymać z dala od światła, aby zapobiec wzrostowi glonów zielonych lub sinic na powierzchni karapaksu. Glony niszczą karapaks, a ponieważ osobniki dorosłe nie przechodzą linienia, prowadzi to do śmierci zwierzęcia ²⁶. W naturze zwierzęta spędzają większość czasu częściowo zakopane w piasku, jednak piasek lub żwir w akwarium utrudniają utrzymanie poziomu czystości niezbędnego do długotrwałej hodowli.

Dyskusja

Istnieją cztery gatunki skrzypłocza: Limulus polyphemus ze wschodniego wybrzeża Ameryki Północnej oraz trzy gatunki występujące od Japonii po Zatokę Bengalską. Zwierzę to jest identyfikowane jako „żywa skamielina”, ponieważ anatomicznie podobne formy odnaleziono w zapisie kopalnym sprzed 445 milionów lat ²⁷. Skrzypłocz jest zwierzęciem długowiecznym; osiąga dojrzałość w wieku od 10 do 13 lat i żyje co najmniej 20 lat ²⁸. Mimo że był on intensywnie odławiany jako przynęta w rybołówstwie węgo...