Pipety z polerowaniem ciśnieniowym dla lepszego zapisu z zaciskiem krosowym

Podsumowanie

To jest przewodnik po modyfikacji kształtu szklanych mikropipet. W szczególności, dzięki zastosowaniu ciepła i ciśnienia powietrza, stożek jest poszerzany bez zwiększania otworu końcówki, co prowadzi do mniejszego oporu pipety. Ma to kluczowe znaczenie dla uzyskania nagrań o niskim poziomie szumów małych komórek, ale jest przydatne w wielu zastosowaniach.

Streszczenie

Polerowanie ciśnieniowe to metoda kształtowania szklanych pipet do nagrywania metodą patch-clamp. Po raz pierwszy opracowaliśmy tę metodę wytwarzania pipet nadających się do rejestracji z małych (<3 m) ciał komórek neuronalnych. Podstawowa zasada jest podobna do szkła i łączy ciśnienie powietrza i ciepło w celu modyfikacji kształtu pipet krosowych przygotowanych za pomocą konwencjonalnego ściągacza do mikropipet. Można go nakładać na tzw. szkła miękkie (soda wapniowa) i twarde (borokrzemianowe). Ogólnie rzecz biorąc, polerowanie ciśnieniowe może zmniejszyć opór pipety o 25% bez zmniejszania średnicy otworu końcówki (Goodman i Lockery, 2000). Może być stosowany do praktycznie każdego rodzaju szkła i wymaga jedynie dodania zaworu wysokociśnieniowego i złączki do mikrokuźni. Technika ta jest niezbędna do nagrywania z ultramałych komórek (<5 m), a także może poprawić nagrywanie jednokanałowe poprzez zminimalizowanie oporu pipet. kształt jest również przydatny do nagrywania z perforowanym zaciskiem punktowym, ponieważ ten kształt końcówki powoduje większą membranę dostępną do perforacji.

Protokół

Ciągnięcie pipet

Używając ściągacza do filamentu, takiego jak Sutter P-97 Flaming/Brown Microelectrode Puller, wyciągnij zestaw około 10-20 pipet.

1. Wybierz swoją szklankę. Używamy borokrzemianu (BF150-86-10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Przechowuj szkło ostrożnie, aby pozostało czyste i wolne od kurzu.
2. Zaprojektuj program ściągania. Podstawowym celem jest otwór końcówki o mniej więcej pożądanym rozmiarze, który będzie zależał od zastosowania. Książka kucharska pipet P-97 Sutter 2 jest doskonałym odniesieniem.
3. Obserwuj pipety pod mikroskopem, aby określić średnicę otworu i gładkość. Wyrzuć szorstkie, nierówne lub nieregularne końcówki. W przypadku standardowego nagrywania z zaciskiem krosowym najlepszy jest otwór końcówki o średnicy 2-4 μm. końcówka prowadzi do mniejszego oporu przy tej samej średnicy otworu, co jest preferowane. Kształt i rozmiar można modyfikować podczas polerowania, poniżej.

Pipety do polerowania ciśnieniowego

1. Podłącz uchwyt na pipety do czystego przewodu sprężonego powietrza. Za pomocą regulatora ustaw ciśnienie w przewodzie sprężonego powietrza na ~40 PSI. Podłącz przewód sprężonego powietrza do 4-drogowego zaworu sterującego, który umożliwi włączanie i wyłączanie ciśnienia w uchwycie pipety. Podłącz uchwyt na pipety do zaworu sterującego o długości 1/8 cala rurki Tygon®.
2. Używaj zestawu polerskiego (microforge) z wysokociśnieniowym uchwytem na pipety, cewki polerskiej sterowanej pedałem nożnym, mikroskopu wyposażonego w małe i duże powiększenie, obiektywów pneumatycznych o dużej odległości roboczej (najlepiej 10x i 100x). Bardzo ważne jest, aby móc obserwować otwarcie pipety podczas protokołu.
3. Opcjonalnie: Pokryj pipetę izolatorem hydrofobowym, aby zmniejszyć pojemność i poprawić charakterystykę hałasu (patrz "Wyciąganie pipet", aby zapoznać się z tą techniką).
4. Sprawdź, czy zawór ciśnieniowy jest w pozycji wyłączonej. Umieść pipetę w uchwycie na pipety i dokręć złączkę palcami.
   
   Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Jeśli pipeta jest mocno trzymana w uchwycie pipety, ciśnienie powietrza spowoduje wysunięcie pipety z uchwytu na pipety.
   
   
5. Umieść pipetę i uchwyt w mikrokuźni. Umieść uchwyt pipety na stoliku mikroskopu tak, aby zarówno końcówka, jak i cewka polerska były widoczne przy niskiej (10x) mocy na mikrokuźni. Wyciągnij końcówkę na ~75 mikronów z filamentu. Należy pamiętać, że żarnik rozszerzy się po podgrzaniu.
6. Przełącz się na obiektyw o dużej mocy (100x). Zarówno końcówka pipety, jak i cewka polerska powinny być ostre i znajdować się w polu widzenia. Jeśli nie, wyreguluj wysokość cewki polerskiej. (Nie można regulować pozycji pipety). Końcówka pipety i cewka polerska powinny znajdować się blisko przeciwległych stron pola widzenia. Unikaj umieszczania cewki zbyt blisko końcówki pipety, ponieważ podczas nagrzewania będzie się rozszerzać i uderzać w pipetę.
7. Przekręć zawór, aby skierować sprężone powietrze do pipety, a następnie podgrzej końcówkę pipety, aż stożek za końcówką zacznie wybrzuszać się na zewnątrz.
8. Przestań się nagrzewać, zanim końcówka zbyt mocno się napompuje. Wymagane są eksperymenty, aby określić odpowiednią odległość, ciepło i czas dla pożądanego kształtu.
9. Opcjonalnie: Zmniejsz średnicę otworu końcówki, polerując końcówkę przy braku nacisku. Kroki 7 i 8 można powtórzyć, aby precyzyjnie dostroić zarówno kształt, jak i wymiary końcówki pipety.
10. Wyłącz ciśnienie i kierując końcówkę pipety w bezpiecznym kierunku, wyjmij pipetę i umieść ją w czystym pudełku do przechowywania, w którym będzie chroniona przed kurzem.
    
    Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Jeśli ciśnienie powietrza nie zostanie wyłączone, pipetę można wysunąć z uchwytu pipety podczas wyjmowania.

Uwagi o mikrokuźni

Używamy mikrokuźni złożonej z dostępnych na rynku części. (Możesz również kupić zestaw do polerowania ciśnieniowego w kilku firmach, np. ALA Science, GlassWorx). Niezależnie od mikrokuźni, ważne jest, aby optyka była wystarczająco dobra, aby zobaczyć otwór końcówki, który często ma tylko kilka μm średnicy. Używamy do tego celu obiektywu o dużej odległości roboczej 100x. Cewkę polerską należy również pokryć szkłem o wysokiej temperaturze topnienia, aby zminimalizować osadzanie się odparowanego metalu na pipetach.

Część 3: Przewidywane wyniki

Polerowanie pod umiarkowanym ciśnieniem może zmniejszyć opór pipety bez znaczącej zmiany średnicy otworu. W razie potrzeby protokół ten może być wykorzystany do produkcji pipet z otworami submikronowymi i rezystancją w zakresie 5-10MΩ.

Dyskusja

Pierwotnie opracowaliśmy tę metodę, aby pipety były przydatne do rejestracji patch-clamp z neuronów 2-3 μm w C. elegans ¹. Jest rutynowo stosowany w laboratorium Goodmana. Pipety polerujemy ciśnieniowo nie tylko do rejestracji z maleńkich neuronów C. elegans , ale także do uzyskiwania makropatchowych i jednokanałowych zapisów kanałów jonowych ulegających ekspresji w oocytach Xenopus. Dla danej średnicy otworu końcówki, kształt tworzy pipetę o niższym oporze. Niższa rezystancja pipety prowadzi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szklane kapilary	Materiały eksploatacyjne	Sutter Instrument Co.	BF150-85-10 (lub podobny)	Metoda działa z każdym rodzajem kapilar z wyjątkiem tych wykonanych z kwarcu. Zalecamy jednak stosowanie naczyń włosowatych z filamentem.
Mikroskop odwrócony	Mikroskop	Leica Microsystems	DM IL (lub podobny)	Każdy prosty mikroskop odwrócony wystarczy. Jednak ważne jest, aby mieć wystarczające powiększenie, aby zobaczyć pipety podczas polerowania. Używamy do tego celu soczewki metalurgicznej 100x o dużej odległości roboczej.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Dostarcza cewkę polerską, kontroler i pedał nożny.
Źródło ciśnienia powietrza	Narzędzie	ALA Science	PR-60	Akcesorium do zapewnienia wysokiego ciśnienia, zawiera odpowiedni zawór. Alternatywnie, sprężone powietrze z budynku może być używane razem z filtrem/regulatorem (ustawionym na 40 PSI) i zaworem 4-drogowym (patrz poniżej)
Zawór 4-drogowy	Narzędzie	Cole-Parmer	A-98150-01	Złączki będą potrzebne do połączenia zaworu z rurką
Uchwyt na pipety ze złączem Luer	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH-6S20	Użyj męskiej złączki typu luer-zadzior, aby podłączyć uchwyt pipety do rurki wysokociśnieniowej
Tygon®	narzędzie	Cole-Parmer	06408-62	Użyj tej rurki do podłączenia uchwytu pipety do zaworu 4-drogowego