Niniejszy przewodnik opisuje metodę modyfikacji kształtu szklanych mikropipet. W szczególności, poprzez zastosowanie ciepła i ciśnienia powietrza, poszerza się zwężenie pipety bez zwiększania otworu końcówki, co prowadzi do obniżenia oporu pipety. Jest to kluczowe dla uzyskania pomiarów o niskim poziomie szumów w małych komórkach, lecz znajduje zastosowanie w wielu innych obszarach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Polerowanie pipet pod ciśnieniem w celu poprawy jakości rejestracji metodą patch-clamp
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Polerowanie ciśnieniowe jest metodą kształtowania pipet szklanych do rejestracji patch-clamp. Opracowaliśmy tę metodę początkowo w celu wytwarzania pipet odpowiednich do rejestracji z niewielkich (<3 m) ciał neuronów. Podstawowa zasada jest podobna do dmuchania szkła i łączy ciśnienie powietrza oraz ciepło w celu modyfikacji kształtu pipet patch przygotowanych za pomocą konwencjonalnej wyciągarki mikrokapilar. Metoda ta może być stosowana do tzw. szkła miękkiego (sodowo-wapiennego) oraz twardego (borokrzemianowego). Ogólnie rzecz ujmując, polerowanie ciśnieniowe może zredukować oporność pipety o 25% bez zmniejszania średnicy otworu końcówki (Goodman and Lockery, 2000). Można ją zastosować praktycznie do każdego rodzaju szkła, a wymaga jedynie dodania zaworu wysokociśnieniowego i złączki do mikrokuźni. Technika ta jest niezbędna do rejestracji z ultra-małych komórek (<5 m) i może również poprawić rejestrację pojedynczego kanału poprzez zminimalizowanie oporności pipety. Tępy kształt końcówki jest ponadto przydatny w rejestracji metodą perforated-patch clamp, ponieważ taki kształt końcówki pozwala na uzyskanie większego pęcherzyka błony dostępnego do perforacji.
Protokół
Wytwarzanie pipet
Używając wyciągacza kapilar, takiego jak Sutter P-97 Flaming/Brown Microelectrode Puller, przygotuj zestaw około 10-20 pipet.
- Wybierz odpowiednie szkło. My stosujemy szkło borokrzemowe (BF150-86-10, OD = 1.5 mm, ID = 0.86 mm). Przechowuj szkło ostrożnie, aby pozostało czyste i wolne od kurzu.
- Opracuj program wyciągania. Głównym celem jest uzyskanie otworu końcówki o rozmiarze zbliżonym do pożądanego, co zależy od zastosowania. Doskonałym źródłem referencyjnym jest P-97 Pipette Cookbook 2 firmy Sutter.
- Obejrzyj pipety pod mikroskopem, aby określić średnicę otworu oraz gładkość końcówki. Odrzuć końcówki chropowate, nierówne lub nieregularne. Dla standardowych pomiarów patch-clamp najlepszy jest otwór końcówki o średnicy 2-4 μm. Preferowana jest tępa końcówka, która zapewnia niższą rezystancję przy tej samej średnicy otworu. Kształt i rozmiar można zmodyfikować podczas polerowania, opisanego poniżej.
Polerowanie pipet pod ciśnieniem
- Podłącz uchwyt pipety do czystej linii sprężonego powietrza. Za pomocą regulatora ustaw ciśnienie w linii sprężonego powietrza na ~40 PSI. Podłącz linię sprężonego powietrza do 4-drogowego zaworu sterującego, który umożliwi włączanie i wyłączanie ciśnienia w uchwycie pipety. Połącz uchwyt pipety z zaworem sterującym za pomocą odcinka ⅛ in rurki Tygon®.
- Użyj zestawu do polerowania (mikroforge) z wysokociśnieniowym uchwytem pipety, cewki polerującej sterowanej pedałem oraz mikroskopu wyposażonego w obiektywy powietrzne o niskim i wysokim powiększeniu z dużą odległością roboczą (idealnie 10x i 100x). Kluczowe jest umożliwienie obserwacji otworu pipety podczas wykonywania procedury.
- Opcjonalnie: Pokryj pipetę hydrofobowym izolatorem, aby zmniejszyć pojemność i poprawić charakterystykę szumów (technikę tę opisano w sekcji „Wyciąganie pipet”).
- Upewnij się, że zawór ciśnienia znajduje się w pozycji zamkniętej. Umieść pipetę w uchwycie i dokręć złącze palcami.
Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Jeśli pipeta zostanie zbyt mocno wciśnięta w uchwyt, ciśnienie powietrza może spowodować jej wyrzucenie z uchwytu. - Umieść pipetę wraz z uchwytem w mikroforge. Ustaw uchwyt pipety na stoliku mikroskopu tak, aby zarówno końcówka, jak i cewka polerująca były widoczne przy małym powiększeniu (10x) w mikroforge. Przysuń końcówkę na odległość ~75 mikronów od włókna. Pamiętaj, że włókno rozszerza się podczas nagrzewania.
- Przełącz na obiektyw o dużym powiększeniu (100x). Zarówno końcówka pipety, jak i cewka polerująca powinny być w ostrości i w polu widzenia. Jeśli tak nie jest, dostosuj wysokość cewki polerującej (pozycji pipety nie można zmienić). Końcówka pipety i cewka polerująca powinny znajdować się blisko przeciwległych krawędzi pola widzenia. Unikaj ustawiania cewki zbyt blisko końcówki pipety, ponieważ podczas nagrzewania ulegnie ona rozszerzeniu i uderzy w pipetę.
- Otwórz zawór, aby skierować sprężone powietrze do pipety, i nagrzewaj końcówkę pipety, aż zwężenie za końcówką zacznie wybrzuszać się na zewnątrz.
- Przerwij nagrzewanie, zanim końcówka nadmiernie się wybrzuszy. Wymagane są próby w celu ustalenia odpowiedniej odległości, temperatury i czasu potrzebnego do uzyskania pożądanego kształtu.
- Opcjonalnie: Zmniejsz średnicę otworu końcówki, polerując ją bez przyłożonego ciśnienia. Kroki 7 i 8 można powtórzyć, aby precyzyjnie dostosować kształt i wymiary końcówki pipety.
- Wyłącz ciśnienie i, kierując końcówkę pipety w bezpiecznym kierunku, wyjmij pipetę i umieść ją w czystym pudełku do przechowywania, w którym będzie chroniona przed kurzem.
Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Jeśli ciśnienie powietrza nie zostanie wyłączone, pipeta może zostać wyrzucona z uchwytu podczas wyjmowania.
Uwagi dotyczące mikrokuźni
Używamy mikrokuźni złożonej z ogólnodostępnych, komercyjnych części. (Można również kupić zestaw do polerowania ciśnieniowego od kilku firm, np. ALA Science, GlassWorx). Niezależnie od rodzaju mikrokuźni, niezbędne jest posiadanie optyki pozwalającej na dostrzeżenie otworu w końcówce, który często ma średnicę zaledwie kilku µm. W tym celu stosujemy obiektyw 100x o długiej odległości roboczej. Ponadto należy pokryć cewkę polerującą szkłem o wysokiej temperaturze topnienia, aby zminimalizować osadzanie się odparowanego metalu na pipetach.
Część 3: Przewidywane wyniki
Polerowanie pod umiarkowanym naciskiem może zmniejszyć oporność pipety bez znaczącej zmiany średnicy otworu. Jeśli jest to wymagane, niniejszy protokół można wykorzystać do wykonania pipet z otworami o rozmiarach submikronowych i opornością w zakresie 5-10MΩ.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowaliśmy tę metodę pierwotnie w celu dostosowania pipet do rejestracji metodą patch-clamp z neuronów o rozmiarach 2-3 µm u C. elegans 1. Jest ona rutynowo stosowana w laboratorium Goodmana. Wykorzystujemy polerowanie pipet pod ciśnieniem nie tylko do rejestracji z niewielkich neuronów C. elegans, ale również do uzyskiwania zapisów macropatch i pojedynczych kanałów z kanałami jonowymi ekspresowanymi w oocytach Xenopus. Dla danej średnicy otworu końcówki, tępy kształt pozwala uzyskać pipet...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Technika polerowania pod ciśnieniem została opracowana we współpracy z S. R. Lockery.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Kapilary szklane | Materiały eksploatacyjne | Sutter Instrument Co. | BF150-85-10 (lub podobne) | Metoda działa z każdym typem kapilar z wyjątkiem tych wykonanych z kwarcu. Zalecamy jednak stosowanie kapilar z włóknem. |
| Mikroskop odwrócony | Mikroskop | Leica Microsystems | DM IL (lub podobny) | Wystarczy dowolny prosty mikroskop odwrócony. Niezbędne jest jednak zapewnienie odpowiedniego powiększenia, aby widzieć pipety podczas polerowania. W tym celu stosujemy obiektyw metalurgiczny 100x z dużą odległością roboczą. |
| Zestaw do mikroforge’owania | Narzędzie | ALA Science | CPM-2 | Zawiera cewkę polerującą, sterownik i pedał. |
| Źródło ciśnienia powietrza | Narzędzie | ALA Science | PR-60 | Akcesorium do zapewnienia wysokiego ciśnienia, zawiera odpowiedni zawór. Alternatywnie można użyć sprężonego powietrza z sieci budynkowej wraz z filtrem/regulatorem (ustawionym na 40 PSI) i zaworem 4-drożnym (patrz poniżej) |
| Zawór 4-drożny | Narzędzie | Cole-Parmer | A-98150-01 | Do połączenia zaworu z przewodami będą potrzebne odpowiednie złączki |
| Uchwyt do pipet z łącznikiem Luer | Narzędzie | World Precision Instruments, Inc. | MPH-6S20 | Użyj złączki typu luer-do-kolca, aby połączyć uchwyt do pipet z przewodami wysokociśnieniowymi |
| Przewody Tygon® | Narzędzie | Cole-Parmer | 06408-62 | Użyj tych przewodów do połączenia uchwytu do pipet z zaworem 4-drożnym |
Bibliografia
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. . J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).
- Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
