$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wytwarzanie pipet
Używając wyciągacza kapilar, takiego jak Sutter P-97 Flaming/Brown Microelectrode Puller, przygotuj zestaw około 10-20 pipet.
- Wybierz odpowiednie szkło. My stosujemy szkło borokrzemowe (BF150-86-10, OD = 1.5 mm, ID = 0.86 mm). Przechowuj szkło ostrożnie, aby pozostało czyste i wolne od kurzu.
- Opracuj program wyciągania. Głównym celem jest uzyskanie otworu końcówki o rozmiarze zbliżonym do pożądanego, co zależy od zastosowania. Doskonałym źródłem referencyjnym jest P-97 Pipette Cookbook 2 firmy Sutter.
- Obejrzyj pipety pod mikroskopem, aby określić średnicę otworu oraz gładkość końcówki. Odrzuć końcówki chropowate, nierówne lub nieregularne. Dla standardowych pomiarów patch-clamp najlepszy jest otwór końcówki o średnicy 2-4 μm. Preferowana jest tępa końcówka, która zapewnia niższą rezystancję przy tej samej średnicy otworu. Kształt i rozmiar można zmodyfikować podczas polerowania, opisanego poniżej.
Polerowanie pipet pod ciśnieniem
- Podłącz uchwyt pipety do czystej linii sprężonego powietrza. Za pomocą regulatora ustaw ciśnienie w linii sprężonego powietrza na ~40 PSI. Podłącz linię sprężonego powietrza do 4-drogowego zaworu sterującego, który umożliwi włączanie i wyłączanie ciśnienia w uchwycie pipety. Połącz uchwyt pipety z zaworem sterującym za pomocą odcinka ⅛ in rurki Tygon®.
- Użyj zestawu do polerowania (mikroforge) z wysokociśnieniowym uchwytem pipety, cewki polerującej sterowanej pedałem oraz mikroskopu wyposażonego w obiektywy powietrzne o niskim i wysokim powiększeniu z dużą odległością roboczą (idealnie 10x i 100x). Kluczowe jest umożliwienie obserwacji otworu pipety podczas wykonywania procedury.
- Opcjonalnie: Pokryj pipetę hydrofobowym izolatorem, aby zmniejszyć pojemność i poprawić charakterystykę szumów (technikę tę opisano w sekcji „Wyciąganie pipet”).
- Upewnij się, że zawór ciśnienia znajduje się w pozycji zamkniętej. Umieść pipetę w uchwycie i dokręć złącze palcami.
Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Jeśli pipeta zostanie zbyt mocno wciśnięta w uchwyt, ciśnienie powietrza może spowodować jej wyrzucenie z uchwytu.
- Umieść pipetę wraz z uchwytem w mikroforge. Ustaw uchwyt pipety na stoliku mikroskopu tak, aby zarówno końcówka, jak i cewka polerująca były widoczne przy małym powiększeniu (10x) w mikroforge. Przysuń końcówkę na odległość ~75 mikronów od włókna. Pamiętaj, że włókno rozszerza się podczas nagrzewania.
- Przełącz na obiektyw o dużym powiększeniu (100x). Zarówno końcówka pipety, jak i cewka polerująca powinny być w ostrości i w polu widzenia. Jeśli tak nie jest, dostosuj wysokość cewki polerującej (pozycji pipety nie można zmienić). Końcówka pipety i cewka polerująca powinny znajdować się blisko przeciwległych krawędzi pola widzenia. Unikaj ustawiania cewki zbyt blisko końcówki pipety, ponieważ podczas nagrzewania ulegnie ona rozszerzeniu i uderzy w pipetę.
- Otwórz zawór, aby skierować sprężone powietrze do pipety, i nagrzewaj końcówkę pipety, aż zwężenie za końcówką zacznie wybrzuszać się na zewnątrz.
- Przerwij nagrzewanie, zanim końcówka nadmiernie się wybrzuszy. Wymagane są próby w celu ustalenia odpowiedniej odległości, temperatury i czasu potrzebnego do uzyskania pożądanego kształtu.
- Opcjonalnie: Zmniejsz średnicę otworu końcówki, polerując ją bez przyłożonego ciśnienia. Kroki 7 i 8 można powtórzyć, aby precyzyjnie dostosować kształt i wymiary końcówki pipety.
- Wyłącz ciśnienie i, kierując końcówkę pipety w bezpiecznym kierunku, wyjmij pipetę i umieść ją w czystym pudełku do przechowywania, w którym będzie chroniona przed kurzem.
Uwaga dotycząca bezpieczeństwa: Jeśli ciśnienie powietrza nie zostanie wyłączone, pipeta może zostać wyrzucona z uchwytu podczas wyjmowania.
Uwagi dotyczące mikrokuźni
Używamy mikrokuźni złożonej z ogólnodostępnych, komercyjnych części. (Można również kupić zestaw do polerowania ciśnieniowego od kilku firm, np. ALA Science, GlassWorx). Niezależnie od rodzaju mikrokuźni, niezbędne jest posiadanie optyki pozwalającej na dostrzeżenie otworu w końcówce, który często ma średnicę zaledwie kilku µm. W tym celu stosujemy obiektyw 100x o długiej odległości roboczej. Ponadto należy pokryć cewkę polerującą szkłem o wysokiej temperaturze topnienia, aby zminimalizować osadzanie się odparowanego metalu na pipetach.
Część 3: Przewidywane wyniki
Polerowanie pod umiarkowanym naciskiem może zmniejszyć oporność pipety bez znaczącej zmiany średnicy otworu. Jeśli jest to wymagane, niniejszy protokół można wykorzystać do wykonania pipet z otworami o rozmiarach submikronowych i opornością w zakresie 5-10MΩ.