Izolacja i hodowla postnatalnych progenitorów neuronów ziarnistych oraz neuronów z móżdżku myszy

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli progenitorowych komórek ziarnistych neuronów móżdżku oraz neuronów ziarnistych móżdżku z myszy w okresie postnatalnym.

Streszczenie

Kora móżdżku jest dobrze opisaną strukturą, która stwarza wyjątkowe możliwości badania właściwości i rozwoju neuronów^1,2. Spośród typów neuronów móżdżkowych (komórek ziarnistych, komórek Purkinjego i interneuronów hamujących), neurony ziarniste są zdecydowanie najliczniejsze i stanowią najliczniejszy typ neuronów w mózgu ssaków. U gryzoni neurony ziarniste móżdżku powstają w ciągu pierwszych dwóch tygodni po urodzeniu z komórek progenitorowych w zewnętrznej warstwie kory móżdżku, czyli zewnętrznej warstwie ziarnistej (EGL). Przedstawiony tutaj protokół opisuje techniki wzbogacania i hodowania neuronów ziarnistych oraz ich komórek progenitorowych z pozarodowego móżdżku myszy. Opiszemy procedury uzyskiwania kultur o coraz wyższej czystości^3,4, które mogą być wykorzystane do badania różnicowania się proliferujących komórek progenitorowych w neurony ziarniste^5,6. Po zróżnicowaniu się komórek progenitorowych, kultury te zapewniają również homogeniczną populację neuronów ziarnistych do manipulacji eksperymentalnych i charakterystyki zjawisk takich jak synaptogeneza, funkcja receptorów glutaminianu⁷, interakcja z innymi oczyszczonymi komórkami móżdżku^8,9 lub śmierć komórkowa⁷.

Protokół

Część 1: Przygotowanie (1–2 dni przed sekcją) (Nie pokazano w filmie)

1. PRZYGOTOWANIE ROZTWORÓW I PODŁOŻY DO KULTURY:
   • 4X CMF-PBS-EDTA (fosforanowy bufor solny bez wapnia i magnezu z dodatkiem EDTA do rozcieńczeń Percoll): na litr dodać 32 g NaCl, 1,2 g KCl, 8 g glukozy, 2 g NaH₂PO₄, 1 g KH₂PO₄, 8 ml 2% roztworu zapasowego NaHCO₃, 10 ml 1M EDTA (pH 8,0) do wody destylowanej/dejonizowanej. Doprowadzić objętość do 1 litra i dostosować pH do 7,4. Sterylizować przez filtrowanie.
   • HBSS-GLUKOZA: Dodać glukozę (6 g/litr) do zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) bez wapnia i magnezu i przefiltrować przez filtr sterylny. 500 ml można przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie miesiąc.
   • PODŁOŻA DO KULTURY: podłoże bezsurowicze (SFM) oraz podłoże z 10% FBS. Do 48 ml podłoża Neurobasal A dodać 500 μl 100X GlutaMAX I, 500 μl 100X penicyliny-streptomycyny (stężenie końcowe: 100 jednostek penicyliny i 100 μg streptomycyny), 6,25 μl 2 M KCl (stężenie końcowe 250 μM). Podzielić na dwie alikwoty o objętości 9 ml i 40 ml. Aby przygotować podłoże z 10% FBS, dodać 1 ml inaktywowanej ciepłem FBS do alikwoty 9 ml. Aby przygotować SFM, dodać 800 μl bezsurowiczego suplementu B-27 do alikwoty 40 ml. Sterylizować przez filtrowanie i przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie 2 tygodnie. Dla uzyskania najlepszych wyników należy przygotowywać świeże podłoża do każdego eksperymentu.
2. PRZYGOTOWANIE ROZCIEŃ PERCOLL:
   • Percoll jest dostarczany w formie ciekłej i przed użyciem musi zostać zakwaszony. Aby przygotować roztwór zapasowy, dodawać 1N HCl małymi porcjami do roztworu Percoll w ciągu 1-2 godzin, aż do osiągnięcia pH 7,4. Zbyt szybkie dodawanie HCl spowoduje agregację Percoll. Na każdy litr Percoll potrzeba około 6,5 ml 1N HCl. Sterylizować przez filtrowanie i przechowywać w temperaturze 4°C.
   • W kroku tworzenia gradientu Percoll zostaną użyte rozcieńczenia 35% i 60% (vol:vol). Przygotować 100 ml rozcieńczeń Percoll zawierających odpowiednio 35 lub 60 ml roztworu zapasowego Percoll, 25 ml 4X CMF-PBS-EDTA i wodę destylowaną/dejonizowaną H2O do uzyskania końcowej objętości. Do roztworu 60% dodać kilka kropli błękitu toluidyny; ułatwi to wizualizację granicy faz oraz komórek. Sterylizować przez filtrowanie i przechowywać w temperaturze 4°C.
   • 4X CMF-PBS-EDTA nie może być starszy niż 3 miesiące, ponieważ niewłaściwe buforowanie spowoduje zwiększoną śmiertelność komórek podczas procedury.
3. PRZYGOTOWANIE PRZYKRYWEK: Szklane przykrywki (najlepiej z Carolina Biological Supply Company) myje się w 10% HCl przez noc w temperaturze pokojowej przy łagodnym wytrząsaniu, płucze dokładnie wodą destylowaną/dejonizowaną i przechowuje w 70% etanolu. Przed użyciem pojedyncze przykrywki sterylizuje się płomieniem, trzymając je przez chwilę pęsetą nad otwartym ogniem (palnik Bunsena), aż etanol wyparuje. Przykrywki szklane o średnicy 12 mm można umieścić w 4-dołkowych płytkach hodowlanych, a przykrywki 25 mm w 6-dołkowych płytkach hodowlanych.
4. POKRYWANIE NACZYNI HODOWLANYCH SUBSTRATEM: W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego lub traktowania lekami bardziej odpowiednie są szklane przykrywki, ponieważ można je łatwo zamocować na szkiełkach przedmiotowych w celu wizualizacji pod mikroskopem. Gdy do pobrania próbek białek lub RNA potrzebna jest duża liczba komórek, komórki można hodować na plastikowych szalkach hodowlanych. W noc poprzedzającą sekcję, szklane przykrywki lub plastikowe szalki hodowlane muszą zostać pokryte poli-D-lizyną (500 μg/ml; 800 μl/dołek dla płytek 6-dołkowych lub 350 μl/dołek dla płytek 4-dołkowych). Roztwór zapasowy poli-D-lizyny o stężeniu 5 mg/ml przechowuje się w temperaturze -20°C, a następnie rozcieńcza w sterylnej wodzie destylowanej/dejonizowanej i filtruje sterylnie bezpośrednio przed użyciem. Naczynia hodowlane inkubuje się w temperaturze 37°C przez noc (lub co najmniej przez 2 godziny przed wysiewaniem) i płucze dwukrotnie sterylną wodą destylowaną/dejonizowaną bezpośrednio przed wysiewaniem.
5. PRZYGOTOWANIE SZALEK DO WYSIEWANIA WSTĘPNEGO: Szalki te będą służyć do wstępnego wysiewania wyizolowanych komórek móżdżku przed właściwą kulturą w celu usunięcia zanieczyszczeń glejowych, które łatwiej przylegają do niższego stężenia substratu. Pokryć dwie plastikowe szalki hodowlane o średnicy 60 mm poli-D-lizyną (4 ml na szalkę, 100 μg/ml; uwaga: jest to 1/5 stężenia używanego do hodowli). Inkubować w temperaturze 37°C przez noc (lub co najmniej przez 2 godziny przed sekcją). Bezpośrednio przed sekcją usunąć roztwór poli-D-lizyny, dwukrotnie opłukać szalki sterylną wodą i pozostawić do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
6. Sterylizować narzędzia do sekcji w autoklawie lub w dniu sekcji zanurzyć narzędzia w 70% etanolu na 20 minut. Wymagane narzędzia: nożyczki Permaset, nożyczki do mikrosekcji, cztery pęsety sekcyjne Dumont #5.

Część 2: Przygotowanie do sekcji (dzień sekcji) – (Zaprezentowane w filmie)

Wszystkie poniższe procedury są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Przetrzyj obszar sekcji 70% etanolem. Podgrzej podłoża do 37°C w łaźni wodnej lub w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37°C.
2. Przy rozpoczęciu pracy z nowym zestawem Papain Dissociation System Kit (Worthington) przygotuj roztwór inhibitora albuminowo-owomukoidowego. Do mieszaniny inhibitora albuminowo-owomukoidowego dodaj 32 ml EBSS (Earle’s Balanced Salt Solution; dostarczony w zestawie) i pozostaw do rozpuszczenia podczas przygotowywania pozostałych komponentów. Rekonstytuuj roztwór przy pierwszym użyciu, a następnie przechowuj pozostałą część w temperaturze 2-8°C i stosuj do momentu przeprowadzenia pięciu izolacji przewidzianych w każdym zestawie.
3. Do jednej fiolki z papainą z zestawu do dysocjacji dodaj 5 ml EBSS (jedna fiolka wystarcza do dysocjacji od 4 do 15 móżdżków myszy w 5. dobie po urodzeniu). Umieść fiolkę z papainą w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37°C lub w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 5 do 10 minut, aż papaina całkowicie się rozpuści, a roztwór stanie się klarowny. Podczas sekcji przechowuj roztwór w temperaturze pokojowej.
4. Do jednej fiolki z DNazą z zestawu do dysocjacji dodaj 500 μl EBSS. Wymieszaj delikatnie, stukając w fiolkę, ponieważ DNaza jest wrażliwa na denaturację spowodowaną siłami ścinającymi. Dodaj 250 μl tego roztworu do fiolki zawierającej papainę (stężenie końcowe to 20 jednostek/ml papainy i 0,005% DNazy). Pozostałą część DNazy zachowaj do etapu 5.1 lub 6.1.

Część 3: Disekcja i usuwanie opon mózgowych

1. Optymalny wiek do hodowli komórek ziarnistych z myszy C57BL/6J to 4-6 dzień po urodzeniu, kiedy liczba progenitorów komórek ziarnistych w EGL osiąga szczyt1,10. Przeprowadzaj sekcję szczeniąt pojedynczo; w miarę nabywania wprawy w sekcji móżdżku staraj się skrócić czas zabiegu do nie więcej niż 6 minut na szczenię. Szybkość działania jest kluczowa.
   Jeśli pominięto etap gradientu Percoll, osiem 5-dniowych myszy może dostarczyć wystarczającą liczbę komórek dla jednej płytki hodowlanej z 6 dołkami (lub sześciu szkiełek podstawkowych o średnicy 25 mm) lub dla sześciu płytek hodowlanych z 4 dołkami (lub dwudziestu czterech szkiełek podstawkowych o średnicy 12 mm). Przybliżona wydajność wynosi 4 do 5x106 komórek na szczenię, a gęstość wysiewu może wynosić od 1 do 5X105 komórek/cm2. Ponieważ podczas etapu z Percollem tracone jest 15-20% komórek4, do uzyskania tej samej pożądanej gęstości komórek potrzeba więcej zwierząt.
2. Pipetuj 15 ml HBSS-glukozy do plastikowej płytki hodowli tkanek o średnicy 60 mm oraz 10 ml do sterylnej stożkowej plastikowej probówki Falcon 15 ml. Umieść na lodzie.
3. Poza dygestorium przemyj głowę szczenięcia 70% etanolem. Użyj nożyczek Permaset do dekapitacji szczenięcia. (Dekapitacja nie zostanie pokazana w filmie).
4. W dygestorium przytrzymaj głowę pęsetą Dumont tak, abyś mógł wyraźnie widzieć tył czaszki. Uzyskaj dostęp do mózgu, wkładając nożyczki mikrochirurgiczne do otworu wielkiego (foramen magnum) i tnąc prosto w kierunku oczu. Za pomocą pęsety zdejmij skórę i unieś czaszkę, aby odsłonić mózg. Używając pęsety Dumont, odetnij móżdżek wraz z otaczającym go śródmózgiem i przenieś go do płytki z HBSS-glukozą. (Łatwiej jest manipulować móżdżkiem i usuwać opony, jeśli móżdżek jest nadal przytwierdzony do otaczającej tkanki).
5. Pod mikroskopem sekcyjnym delikatnie oddziel opony od móżdżku, a także pomiędzy jego półkulami, używając jednej precyzyjnej pęsety Dumont #5, podczas gdy drugą pęsetą unieruchom móżdżek na płytce. Na powierzchni móżdżku zauważysz naczynia krwionośne; stanowią one dobry sposób na zidentyfikowanie opon. Usuwaj opony, aż móżdżek przyjmie matową, białą barwę. Oddziel móżdżek od reszty śródmózgowia. Odwróć go stroną brzuszzną i usuń splot naczyniowy, który wygląda jak czerwona wstążka między brzuszną częścią móżdżku a przyległym śródmózgowiem. Każdy wypreparowany móżdżek umieszczaj natychmiast w zimnym HBSS-glukozie w probówce stożkowej 15 ml na lodzie. Wymień roztwór sekcyjny na świeży HBSS-glukozę po wypreparowaniu 3 mózgów.

Część 4: Zawiesina komórkowa

1. Po zakończeniu wszystkich sekcji usunąć HBSS-glucose z probówki i zastąpić go roztworem papainy przygotowanym w kroku 2.4. Choć zestaw zaleca cięcie tkanki na małe kawałki, stwierdziliśmy, że w tym wieku cięcie lub rozdrabnianie móżdżków nie jest konieczne. Umieścić tkankę z roztworem papainy (w stożkowej probówce 15 ml) w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C lub w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37°C na 15 do 20 minut. W przypadku 4 do 8 móżdżków wystarczy 15 minut w 37°C; dla większej liczby móżdżków lepsze będzie 20 do 30 minut. Delikatnie mieszać zawartość probówki co 3 do 4 minut.
2. Zhomogenizować mieszaninę za pomocą sterylnego końcówki do pipety p1000 z filtrem, pokrytej FBS. Ten krok należy wykonywać delikatnie, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Można użyć wypalanych pipet szklanych, jednak stwierdziliśmy, że sterylne końcówki p1000 z filtrem pokryte surowicą działają równie dobrze. Aby pokryć końcówkę pipety FBS, należy dwa razy pobrać i wypuścić FBS tuż przed użyciem. Około 10 ruchów pipety w górę i w dół jest wystarczających do dysocjacji tkanki. Roztwór stanie się mętny. Pozostawić zawiesinę na 30-60 sekund, aby większe fragmenty niedysocjowanej tkanki opadły na dno probówki.
3. Przenieść zawieszone komórki (uważając, aby nie pobrać niedysocjowanych fragmentów tkanki z dna) do nowej stożkowej probówki 15 ml za pomocą końcówki pipety pokrytej surowicą. Odwiruj przy około 200xg przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować medium do resuspensji. W tym celu zmieszać 2,7 ml EBSS z 300 μl zrekonstytuowanego roztworu inhibitora albuminy-owomukoidy w sterylnej probówce. Dodać 150 μl roztworu DNase z kroku 2.4.
4. Po wirowaniu odlać nadsącz i natychmiast resuspendować osad komórkowy w rozcieńczonym roztworze DNase/inhibitora albuminy przygotowanym w kroku 4.3, używając sterylnej końcówki p1000 z filtrem pokrytej surowicą.
5. Przygotować nieciągły gradient gęstości w następujący sposób. Dodać 5 ml roztworu inhibitora albuminy-owomukoidy do stożkowej probówki 15 ml. Ostrożnie nałożyć zawiesinę komórkową na górę. Wirować przy około 70xg przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Dysocjowane komórki tworzą osad na dnie probówki, a fragmenty błon pozostają na granicy faz.
6. Jeśli chcą Państwo uzyskać hodowle wzbogacone w komórki ziarniste, należy pominąć etap separacji gradientem Percoll (który pozwala na uzyskanie czystszych hodowli ziarnistych komórek móżdżku) i przejść do części 6. Jeśli chcą Państwo dalej izolować komórki ziarniste od gleju i dużych interneuronów za pomocą separacji gradientem Percoll, należy przejść do części 5. Zastosowanie gradientu Percoll zmniejszy wydajność komórek. W naszych badaniach spadek wydajności wynosi około 20-35%. Następuje jednak wzrost stopnia wzbogacenia neuronów ziarnistych i komórek progenitorowych z około 90% do 95-99%.

Część 5: Rozdział w gradiencie Percollu

1. Odlej supernatant i natychmiast resuspenduj osad w 2 ml HBSS-glucose z dodatkiem 50 μl DNase z kroku 2.4. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez nylonowy filtr (rozmiar porów 70 μm) metodą grawitacyjną. Ten krok usunie duże komórki nieneuronalne i pozwoli na uzyskanie lepszej zawiesiny pojedynczych komórek.
2. Przygotuj dwie wypalane szklane pipety Pasteura. W tym celu delikatnie ogrzewaj końcówkę szklanej pipety w płomieniu, aż krawędź zostanie wygładzona, a prześwit pipety zmniejszy się do 40-50% pierwotnego rozmiaru. Należy uważać, aby otwór nie był zbyt mały.
3. Przygotuj gradient Percoll. Wlej 10 ml 35% roztworu Percoll do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. 60% Percoll (10 ml) naciągnij do sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml z przymocowaną sterylną igłą spinalną. Delikatnie nanieś 60% roztwór Percoll pod warstwę 35% roztworu, wprowadzając go na dno probówki za pomocą igły spinalnej. Należy zadbać o zachowanie wyraźnej granicy między dwiema warstwami. Dodaj komórki na górę gradientu za pomocą wypalanej pipety, delikatnie wprowadzając je wzdłuż ścianki probówki, aby nie zaburzyć granicy faz.
4. Ostrożnie umieść probówkę w wirówce i wiruj przy 1800xg. Zwiększaj prędkość stopniowo co 20 sekund (przyrosty prędkości są następujące: około 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg), tak aby osiągnięcie pożądanej prędkości zajęło około 2 minut. Po osiągnięciu 1800xg uruchom czasomierz na 10 min. Po zakończeniu stopniowo zmniejszaj prędkość co 20 sekund.
5. Usuń górną granicę gradientu (zawierającą duże komórki glejowe, komórki Purkinjego i interneurony) i odrzuć ją.
6. Ostrożnie pobierz komórki z granicy między 35% a 60% Percoll za pomocą wypalanej pipety i przenieś je do stożkowej probówki 50 ml. Resuspenduj w 3 objętościach HBSS-glucose i wymieszaj, kilkukrotnie odwracając probówkę. Wiruj przez 5 minut przy 1100xg.
7. Usuń supernatant i dodaj 4 ml pożywki z 10% FBS z dodatkiem 50 μl DNase. Delikatnie resuspenduj osad za pomocą wypalanej pipety, aby utworzyć zawiesinę pojedynczych komórek. Przejdź do kroku 6.2.

Część 6: Przygotowanie płytek i wysiewanie

1. Odlej nadsącz i natychmiast resuspenduj osad w 4 ml pożywki z 10% FBS oraz 50 μl DNazy z kroku 2.4. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez siatkę nylonową (rozmiar porów 70 μm) grawitacyjnie. Krok ten usunie duże komórki nieneuronalne i pozwoli na uzyskanie lepszej zawiesiny pojedynczych komórek.
2. Wysiej zebrane komórki na płytkę do wstępnego wysiewu pokrytą poli-D-lizyną na 20 minut w inkubatorze 5% CO₂ w temperaturze 37°C. Powtórz procedurę z użyciem nowej płytki. Astroglia i cięższe komórki osiądą i przylgną do płytek, pozostawiając małe neurony ziarniste oraz komórki progenitorowe neuronów w zawiesinie. Po inkubacji słabo przylegające neurony ziarniste i komórki progenitorowe neuronów można łatwo oderwać i poluzować poprzez delikatne opukiwanie płytki.
3. Zbierz neurony ziarniste i komórki progenitorowe neuronów do probówki stożkowej 15 ml i odwiruj przy 200xg przez 5 minut. Resuspenduj osad w 1 ml pożywki bezsurowiczej i policz alikwot 10 μl za pomocą hemocytometru.
4. Dodaj pożywkę bezsurowiczą, aby osiągnąć pożądaną gęstość komórek. Orientacyjne wytyczne dotyczące liczby komórek do wysiania dla średniej gęstości: dla płytek 6-dołkowych 3,5 do 4 milionów komórek; dla płytek 4-dołkowych 650 000 komórek. W przypadku płytek hodowlanych 6-dołkowych wysiewam 1,5 ml/dołek, a dla płytek 4-dołkowych 0,5 ml/dołek. Komórki utrzymuje się w inkubatorze 5% CO₂ w temperaturze 37°C. Wymień całkowicie pożywkę po 24 godzinach, a następnie co dwa do trzech dni.

Dyskusja

Niniejszy protokół opiera się na modyfikacjach procedur opisanych w poprzednich publikacjach^3,7,11. Poniżej omówiono kilka istotnych kwestii, na które należy zwrócić uwagę.

Neurony ziarniste i komórki progenitorowe przywierają w ciągu 2 godzin od wysiewania. Zdrowe komórki mają okrągłą morfologię w badaniu pod mikroskopem fazokontrastowym⁴. W ciągu 24 godzin od wysiewania zdrowe komórki rozprzestrzenią się równomiernie na szkiełkach podstawkowych lub plastikowej ściance ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sito do komórek z oczkami o średnicy 70μm	BD Biosciences	352350
Igła spinalna	BD Biosciences	405182	20G x 3-1/2 inches
Poly-D-Lysine masa cząsteczkowa >300,000	Sigma-Aldrich	P1024	Każda nowa partia Poly-D-Lysine musi zostać przetestowana.
Percoll	Sigma-Aldrich	P-1644
Penicylina-streptomycyna (100X)	Sigma-Aldrich	P4333
HBSS	Invitrogen	14175-103	Musi być wolny od wapnia i magnezu.
Pożywka Neurobasal A	Invitrogen	10888-022
Suplement Glutamax I	Invitrogen	35050-061
Suplement B-27 bezsurowiczy (50x)	Invitrogen	17504-044
Okrągłe szkiełka nakrywkowe 12 mm	Carolina Biological	63-3029	Produkowane w Niemczech przez firmę Deckgluder.
Okrągłe szkiełka nakrywkowe 25 mm	Carolina Biological	63-3037	Produkowane w Niemczech przez firmę Deckgluder.
System dysocjacji papainą	Worthington Biochemical	LK 003150	Zestaw wystarcza na pięć izolacji.
Nożyczki Permaset	Roboz Surgical Instruments Co.	RS6782
Pęseta Dumont #5 (Dumostar)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS4978
Płytka hodowlana 4-dołkowa	Nalge Nunc international	176740
Płytka hodowlana 6-dołkowa	Nalge Nunc international	140685