Testy na żywność modyfikowaną genetycznie

1. Ekstrakcja DNA z próbek żywności

1. Dodaj 500 μl zakupionej matrycy mieszającej do PCR do każdej z 2 probówek z nakrętką za pomocą pipety transferowej lub mikropipety o regulowanej objętości 200-1 000 μl. Pipetować w górę i w dół pipetą między każdą podwielokrotnością, aby równomiernie wymieszać matrycę PCR.
2. Oznacz jedną tubkę z nakrętką "bez GMO", a drugą "test".
3. Odważ 0,5 g certyfikowanej żywności bez GMO i włóż ją do moździerza.
4. Dodaj 2,5 ml wody destylowanej i miel tłuczkiem przez 2 minuty, aby uzyskać zawiesinę.
5. Dodaj kolejne 2,5 ml wody destylowanej i kontynuuj mielenie tłuczkiem, aż zawiesina stanie się wystarczająco gładka, aby można było ją pipetować.
6. Odmierzyć pipetą 50 μl zmielonej zawiesiny do zakrętki zawierającej 500 μl premiksu PCR oznaczonego jako "niemodyfikowany genetycznie", używając oznaczenia 50 μl na pipecie z podziałką. Rurka podsumowująca.
7. Powtórz kroki 1.3–1.6, aby przygotować próbkę badanej żywności.
8. Odpipetować 50 μl mielonej zawiesiny spożywczej do zakrętki z nakrętką oznaczoną "test". Rurka podsumowująca.
9. Wirować probówki PCR do żywności niemodyfikowanej genetycznie i testować żywność przez 1 minutę i umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C na 5 minut. Jeśli wir nie jest dostępny, przesuń rurkę kilka razy, aby wymieszać przed umieszczeniem w łaźni wodnej.
10. Umieść probówki w wirówce na 5 minut. Na dnie rurki powinien uformować się stały granul. Jeśli osad nie uformuje się po 5 minutach, należy ponownie odwirować przez 2 minuty, aż utworzy się osad.
11. Probówki można zużyć natychmiast do PCR lub przechowywać w lodówce do 1 tygodnia.

2. Ustawianie reakcji PCR

1. Ponumeruj probówki PCR 1–6 i parafuj je. Numery powinny odpowiadać następującej zawartości probówki wymienionej w Tabeli 1.
2. Umieść każdą oznakowaną probówkę do PCR w uchwycie na mikroprobówki z otwartymi nakrętkami.
3. Używając świeżej końcówki do każdego dodawania, dodaj 20 μl startera wskazanego w Tabeli 1 do każdej probówki PCR. Rurki z nakrętką.
4. Używając świeżej końcówki do każdej probówki, dodaj 20 μl próbki DNA wskazanej w Tabeli 1 do każdej probówki PCR, upewniając się, że pipetujesz tylko z supernatantu i unikając stałego osadu na dnie probówek.
5. Po odpipetowaniu każdej próbki DNA do odpowiedniej probówki do PCR, za pomocą pipety wymieszać DNA i starter, delikatnie pipetując w górę iw dół; probówki z nakrętkami.
6. Umieść probówki PCR w termocyklerze i zaprogramuj cykler na:
   Wstępna denaturacja: 1 cykl w temperaturze 94 °C przez 2 min.
   Amplifikacja: 40 cykli w temperaturze 94 °C przez 1 minutę (denaturacja), 59 °C przez 1 minutę (wyżarzanie) i 72 °C przez 2 minuty (przedłużenie).
   Końcowe przedłużenie: 1 cykl w temperaturze 72 °C przez 10 min.
   Utrzymywać: 4 °C w nieskończoność.

3. Preparat 3% żelu agarozowego

1. Za pomocą taśmy laboratoryjnej lub maskującej bezpiecznie zaklej taśmą otwarte końce tacki na żel. Upewnij się, że taśma jest uszczelniona do krawędzi tacy, aby zapobiec wyciekaniu stopionej agarozy.
2. Odważyć 3 g agarozy do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml lub większej.
3. Dodać 100 ml 1x buforu TAE (zakupionego lub przygotowanego z koncentratu).
4. Za pomocą magnetycznej płyty grzejnej z mieszadłem podgrzewaj zlewkę, aż agaroza całkowicie rozpuści się w buforze, a roztwór zacznie się gotować i stanie się klarowny. Alternatywnie można użyć kuchenki mikrofalowej, umieszczając zlewkę w piekarniku i podgrzewając przez 30 sekund, używając mieszadła do mieszania co 10 sekund, powtarzając, aż mieszanina się zagotuje i stanie się klarowna.
5. Odwrócić 50-mililitrową kolbę Erlenmeyera do otworu kolby o pojemności 250 ml, aby działała jak refluks, zapobiegając parowaniu roztworu agarozy.
6. Pozostaw roztwór agarozy do ostygnięcia do 60 °C i wlej 30-50 ml do każdej zaklejonej taśmą tacki na żel.
7. Umieść grzebień żelowy w pierwszej parze nacięć, aby utworzyć dołki żelowe.
8. Poczekaj, aż żel całkowicie ostygnie przed usunięciem taśmy i grzebienia. Żel zestala się i zmieni kolor z klarownego na mętny, gdy będzie gotowy, około 10-20 minut.

4. Elektroforeza produktów PCR

1. Umieść gotowy żel 3% agarozowy na tacce na żel lub użyj tacki na żel, która została użyta do odlewania wylanego 3% żelu agarozowego.
2. Wsuń tackę z żelem do komory elektroforezy tak, aby dołki znajdowały się najbliżej końca katody (czarnej).
3. Wlej 1x bufor TAE do komory, tyle, aby mieć 2 mm buforu nad górną częścią tacki na żel.
4. Zaopatrzyć się w probówki PCR z termocyklera i umieścić w uchwycie na mikroprobówki.
5. Za każdym razem, używając świeżej końcówki do pipety, dodaj 10 μl zakupionego barwnika Orange G (LD) do każdej próbki i dobrze wymieszaj.
6. Załadować 20 μl liniału o masie cząsteczkowej i 20 μl każdej próbki do żelu we wskazanej kolejności (Tabela 2).
7. Uruchom elektroforezę żelową przez 30 minut przy napięciu 100 V.
8. Wyjmij tackę na żel z komory i wsuń żel, aby wyjąć z tacy. Umieść żel na tacy do barwienia.
9. Zanurz żel w zakupionej plamie z żelu DNA na 5 minut, ostrożnie potrząsając tacą, aby pomóc rozprowadzić plamę po całym żelu.
10. Przenieś żel do pojemnika do mycia i płucz wodą z kranu (40-55 °C) przez około 10 sekund.
11. Odplamić, myjąc 3x w ciepłej wodzie z kranu przez 6 minut z delikatnym potrząsaniem, aby uzyskać najlepsze rezultaty. W razie potrzeby kontynuuj odbarwienie w ciepłej wodzie, aż do osiągnięcia pożądanego kontrastu.

Numer tuby	Elementarz	Próbka DNA
1	20 μL Podkład do roślin (zielony)	20 μL DNA do kontroli żywności niemodyfikowanej genetycznie
2	20 μL podkładu GMO (czerwonego)	20 μL DNA do kontroli żywności niemodyfikowanej genetycznie
3	20 μL Podkład do roślin (zielony)	20 μL Test DNA żywności
4	20 μL podkładu GMO (czerwonego)	20 μL Test DNA żywności
5	20 μL Podkład do roślin (zielony)	20 μL DNA kontroli pozytywnej GMO
6	20 μL podkładu GMO (czerwonego)	20 μL DNA kontroli pozytywnej GMO

Tabela 1. Lista odpowiednich numerów probówek, starterów i próbek DNA.

Cóż, 1	Próbka 1 Kontrola żywności niemodyfikowanej genetycznie za pomocą starterów roślinnych 20 μL.
Studnia 2	Próbka 2 Kontrola żywności niemodyfikowanej genetycznie za pomocą starterów GMO 20 μL.
Cóż, 3	Próbka 3 Testuj pokarm z podkładami roślinnymi 20 μL.
Cóż, 4	Próbka 4 Żywność testowa ze starterami GMO 20 μL.
Cóż, 5	Próbka 5 DNA GMO dodatniego ze starterami roślinnymi 20 μL.
Cóż, 6	Próbka 6 DNA GMO dodatniego ze starterami GMO 20 μL.
Cóż, 7	Linijka masy cząsteczkowej PCR 20 μL.
Cóż, 8	Pozostaw puste.

Tabela 2. Właściwa kolejność, aby załadować do żelu 20 μl liniału masy cząsteczkowej i 20 μl każdej próbki.