1.6: Testy na żywność modyfikowaną genetycznie

1. Ekstrakcja DNA z próbek żywności

1. Dodaj 500 μl zakupionej matrycy mieszającej do PCR do każdej z 2 probówek z nakrętką za pomocą pipety transferowej lub mikropipety o regulowanej objętości 200-1 000 μl. Pipetować w górę i w dół pipetą między każdą podwielokrotnością, aby równomiernie wymieszać matrycę PCR.
2. Oznacz jedną tubkę z nakrętką "bez GMO", a drugą "test".
3. Odważ 0,5 g certyfikowanej żywności bez GMO i włóż ją do moździerza.
4. Dodaj 2,5 ml wody destylowanej i miel tłuczkiem przez 2 minuty, aby uzyskać zawiesinę.
5. Dodaj kolejne 2,5 ml wody destylowanej i kontynuuj mielenie tłuczkiem, aż zawiesina stanie się wystarczająco gładka, aby można było ją pipetować.
6. Odmierzyć pipetą 50 μl zmielonej zawiesiny do zakrętki zawierającej 500 μl premiksu PCR oznaczonego jako "niemodyfikowany genetycznie", używając oznaczenia 50 μl na pipecie z podziałką. Rurka podsumowująca.
7. Powtórz kroki 1.3–1.6, aby przygotować próbkę badanej żywności.
8. Odpipetować 50 μl mielonej zawiesiny spożywczej do zakrętki z nakrętką oznaczoną "test". Rurka podsumowująca.
9. Wirować probówki PCR do żywności niemodyfikowanej genetycznie i testować żywność przez 1 minutę i umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C na 5 minut. Jeśli wir nie jest dostępny, przesuń rurkę kilka razy, aby wymieszać przed umieszczeniem w łaźni wodnej.
10. Umieść probówki w wirówce na 5 minut. Na dnie rurki powinien uformować się stały granul. Jeśli osad nie uformuje się po 5 minutach, należy ponownie odwirować przez 2 minuty, aż utworzy się osad.
11. Probówki można zużyć natychmiast do PCR lub przechowywać w lodówce do 1 tygodnia.

2. Ustawianie reakcji PCR

1. Ponumeruj probówki PCR 1–6 i parafuj je. Numery powinny odpowiadać następującej zawartości probówki wymienionej w Tabeli 1.
2. Umieść każdą oznakowaną probówkę do PCR w uchwycie na mikroprobówki z otwartymi nakrętkami.
3. Używając świeżej końcówki do każdego dodawania, dodaj 20 μl startera wskazanego w Tabeli 1 do każdej probówki PCR. Rurki z nakrętką.
4. Używając świeżej końcówki do każdej probówki, dodaj 20 μl próbki DNA wskazanej w Tabeli 1 do każdej probówki PCR, upewniając się, że pipetujesz tylko z supernatantu i unikając stałego osadu na dnie probówek.
5. Po odpipetowaniu każdej próbki DNA do odpowiedniej probówki do PCR, za pomocą pipety wymieszać DNA i starter, delikatnie pipetując w górę iw dół; probówki z nakrętkami.
6. Umieść probówki PCR w termocyklerze i zaprogramuj cykler na:
   Wstępna denaturacja: 1 cykl w temperaturze 94 °C przez 2 min.
   Amplifikacja: 40 cykli w temperaturze 94 °C przez 1 minutę (denaturacja), 59 °C przez 1 minutę (wyżarzanie) i 72 °C przez 2 minuty (przedłużenie).
   Końcowe przedłużenie: 1 cykl w temperaturze 72 °C przez 10 min.
   Utrzymywać: 4 °C w nieskończoność.

3. Preparat 3% żelu agarozowego

1. Za pomocą taśmy laboratoryjnej lub maskującej bezpiecznie zaklej taśmą otwarte końce tacki na żel. Upewnij się, że taśma jest uszczelniona do krawędzi tacy, aby zapobiec wyciekaniu stopionej agarozy.
2. Odważyć 3 g agarozy do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml lub większej.
3. Dodać 100 ml 1x buforu TAE (zakupionego lub przygotowanego z koncentratu).
4. Za pomocą magnetycznej płyty grzejnej z mieszadłem podgrzewaj zlewkę, aż agaroza całkowicie rozpuści się w buforze, a roztwór zacznie się gotować i stanie się klarowny. Alternatywnie można użyć kuchenki mikrofalowej, umieszczając zlewkę w piekarniku i podgrzewając przez 30 sekund, używając mieszadła do mieszania co 10 sekund, powtarzając, aż mieszanina się zagotuje i stanie się klarowna.
5. Odwrócić 50-mililitrową kolbę Erlenmeyera do otworu kolby o pojemności 250 ml, aby działała jak refluks, zapobiegając parowaniu roztworu agarozy.
6. Pozostaw roztwór agarozy do ostygnięcia do 60 °C i wlej 30-50 ml do każdej zaklejonej taśmą tacki na żel.
7. Umieść grzebień żelowy w pierwszej parze nacięć, aby utworzyć dołki żelowe.
8. Poczekaj, aż żel całkowicie ostygnie przed usunięciem taśmy i grzebienia. Żel zestala się i zmieni kolor z klarownego na mętny, gdy będzie gotowy, około 10-20 minut.

4. Elektroforeza produktów PCR

1. Umieść gotowy żel 3% agarozowy na tacce na żel lub użyj tacki na żel, która została użyta do odlewania wylanego 3% żelu agarozowego.
2. Wsuń tackę z żelem do komory elektroforezy tak, aby dołki znajdowały się najbliżej końca katody (czarnej).
3. Wlej 1x bufor TAE do komory, tyle, aby mieć 2 mm buforu nad górną częścią tacki na żel.
4. Zaopatrzyć się w probówki PCR z termocyklera i umieścić w uchwycie na mikroprobówki.
5. Za każdym razem, używając świeżej końcówki do pipety, dodaj 10 μl zakupionego barwnika Orange G (LD) do każdej próbki i dobrze wymieszaj.
6. Załadować 20 μl liniału o masie cząsteczkowej i 20 μl każdej próbki do żelu we wskazanej kolejności (Tabela 2).
7. Uruchom elektroforezę żelową przez 30 minut przy napięciu 100 V.
8. Wyjmij tackę na żel z komory i wsuń żel, aby wyjąć z tacy. Umieść żel na tacy do barwienia.
9. Zanurz żel w zakupionej plamie z żelu DNA na 5 minut, ostrożnie potrząsając tacą, aby pomóc rozprowadzić plamę po całym żelu.
10. Przenieś żel do pojemnika do mycia i płucz wodą z kranu (40-55 °C) przez około 10 sekund.
11. Odplamić, myjąc 3x w ciepłej wodzie z kranu przez 6 minut z delikatnym potrząsaniem, aby uzyskać najlepsze rezultaty. W razie potrzeby kontynuuj odbarwienie w ciepłej wodzie, aż do osiągnięcia pożądanego kontrastu.

Tabela 1. Lista odpowiednich numerów probówek, starterów i próbek DNA.

Tabela 2. Właściwa kolejność, aby załadować do żelu 20 μl liniału masy cząsteczkowej i 20 μl każdej próbki.

Żywność modyfikowana genetycznie to produkty, które zawierają składnik lub składniki, których DNA zostało specjalnie zmienione. Obecność tych modyfikacji można wykryć za pomocą techniki zwanej reakcją łańcuchową polimerazy.

Modyfikacja genetyczna żywności jest kontrowersyjną kwestią ze względu na dyskutowane obawy dotyczące zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego. Zdolność do wykrywania genetycznie zmienionego DNA w próbkach żywności będących przedmiotem zainteresowania pozwala na podejmowanie świadomych decyzji dotyczących bezpieczeństwa i potencjalnych zagrożeń związanych ze stosowaniem organizmów modyfikowanych genetycznie (GMO) w żywności.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) służy do amplifikacji DNA żywności w celu określenia obecności lub braku sekwencji modyfikowanych genetycznie. Elektroforeza żelowa następnie przeciąga amplifikowane DNA przez matrycę żelu agarozowego i oddziela pasma DNA o różnych rozmiarach, które odpowiadają zmodyfikowanym lub niezmodyfikowanym markerom. Są one następnie porównywane z pasmami kontrolnymi z żywności, o której wiadomo, że zawiera GMO lub jest wolna od modyfikacji.

Ten film zilustruje zasady wykrywania genetycznie zmodyfikowanego DNA z próbek żywności, jak ekstrahować DNA i amplifikować markery używane w procesie modyfikacji genetycznej oraz jak można ustalić obecność lub brak GMO w próbkach żywności.

Reakcja łańcuchowa polimerazy identyfikuje sekwencje DNA, które zostały wprowadzone do genetycznie modyfikowanej żywności. DNA jest stosunkowo stabilną cząsteczką, więc żywotne fragmenty DNA nadające się do amplifikacji można wyizolować nawet z wysoko przetworzonych produktów, takich jak chipsy kukurydziane czy burgery warzywne. Niewielka liczba regulatorowych sekwencji DNA jest wykorzystywana do kontrolowania ekspresji wstawionych genów, więc sekwencje te są obecne w większości upraw GMO. Ta procedura identyfikuje dwa z najczęściej stosowanych, gen promotora 35S i gen terminatora syntazy nopaliny. Sekwencja 35S jest silnym promotorem, a po przyłączeniu do wstawionego genu będzie napędzać stały, wysoki poziom ekspresji. Terminator syntazy nopaliny jest dołączany w celu zatrzymania transkrypcji wstawionego genu w pożądanym punkcie końcowym.

PCR polega na powtarzających się cyklach ogrzewania i chłodzenia w termocyklerze, maszynie, która ściśle kontroluje temperaturę probówek reakcyjnych PCR. Podgrzanie próbki do 94 ? C powoduje denaturację i separację nici DNA. Szybkie chłodzenie do 45 do 65 ? C umożliwia wyżarzanie starterów do oddzielonych nici DNA. Wreszcie podgrzanie do 72 ? C pozwala enzymowi polimerazy Taq na wydłużenie starterów i całkowitą duplikację regionu docelowego.

Zakupiony podkład roślinny jest dodawany do każdej próbki i będzie amplifikowany w próbkach zawierających DNA rośliny. Matryce dodatnie GMO dla 35S i NOS są stosowane w celu zapewnienia pozytywnej kontroli GMO. Certyfikowany non-GMO jest stosowany jako kontrola ujemna. Jeśli którakolwiek z tych reakcji kontrolnych wykaże nieoczekiwane pasma, nie można ufać wynikom próbek testowych.

Amplifikowane DNA przepuszcza się przez żel agarozowy za pomocą elektroforezy. Produkty PCR miesza się z barwnikiem i ładuje do studzienek. DNA jest naładowane ujemnie, a po załadowaniu do żelu na końcu katody komory przesunie się w kierunku końca anody po przyłożeniu prądu. Większe fragmenty DNA nie mogą tak łatwo przemieszczać się przez matrycę żelową, więc pozostaną bliżej katody, podczas gdy mniejsze sekwencje poruszają się w kierunku końca anody, co powoduje rozdzielenie DNA o różnej wielkości na odrębne pasma.

Po elektroforezie barwienie żelem pomaga uwidocznić oddzielone prążki DNA.

Teraz, gdy jesteśmy już zaznajomieni z zasadami wykrywania GMO i wykorzystaniem PCR i elektroforezy do identyfikacji GMO, przyjrzyjmy się, jak można to przeprowadzić w laboratorium.

Po zidentyfikowaniu interesujących nas produktów spożywczych można rozpocząć analizę. Aby wyekstrahować DNA, weź dwie czyste probówki z nakrętką i do każdej z nich przenieś 500 ? L zakupionego odczynnika do izolacji DNA, upewniając się, że pipetujesz mieszaninę w górę iw dół między podwielokrotnościami, aby równomiernie wymieszać odczynnik. Oznacz jedną z probówek jako "bez GMO", a drugą "Test".

Następnie odważ 0,5 g certyfikowanej żywności bez GMO i umieść w czystym moździerzu. Dodaj 2,5 ml wody destylowanej i miel tłuczkiem przez 2 minuty, aby uzyskać zawiesinę. Dodaj kolejne 2,5 ml wody destylowanej i kontynuuj mielenie zawiesiny, aż stanie się wystarczająco gładka, aby można było pipetować.

Pipeta 50 ? L znanej zawiesiny niemodyfikowanej genetycznie do probówki z nakrętką oznaczoną jako "niezmodyfikowana genetycznie" zawierającej odczynnik do izolacji DNA. Teraz dodaj 50 ? L zawiesiny próbki badanej żywności do rurki z nakrętką oznaczoną "Test". Wirować dwie probówki zawierające próbki żywności i odczynnik DNA przez 1 minutę. Następnie umieść rurki w łaźni wodnej o temperaturze 95 ° C przez 5 min. Na koniec umieść probówki w wirówce na 5 minut. Po zbadaniu na dnie probówki powinien powstać stały osad. Jeśli osad nie uformuje się po 5 minutach, należy ponownie odwirować przez 2 minuty, aż utworzy się osad. Próbki można teraz natychmiast wykorzystać do PCR lub przechowywać w lodówce przez okres do 1 tygodnia.

Po pierwsze, numer sześć probówek PCR. Liczby te będą odpowiadać zawartości probówki wymienionej w tabeli. Umieść każdą z oznakowanych probówek do PCR w uchwycie na mikroprobówki z otwartymi nakrętkami.

Używając świeżej końcówki do każdego dodatku, dodaj 20 ? L starter wskazany w tabeli do każdej probówki PCR. Następnie dodaj 20 ? L próbek DNA wskazanych w tabeli do każdej probówki PCR. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. W przypadku próbek granulowanych należy pamiętać, że pipetuje się tylko z supernatantu i unikać stałego osadu na dnie probówek. Na koniec umieść probówki PCR w termocyklerze i zaprogramuj je tak, aby przechodziły przez etapy ogrzewania i chłodzenia wskazane w tabeli.

Umieść 3% żel agarozowy w komorze elektroforezy tak, aby studzienki znajdowały się najbliżej końca katody. Dodaj bufor TAE do komory, aby przykryć 2 mm nad tacką na żel. Wyjmij probówki PCR z termocyklera i umieść je w uchwycie na mikroprobówki. Za każdym razem, używając świeżej końcówki do pipety, dodaj 10 ? L zakupionego DNA należy naładować barwnik do każdej próbki i dobrze wymieszać.

Za każdym razem, używając świeżej końcówki, załaduj dołki żelu agarozowego 20 ? L linijki o masie cząsteczkowej do jednego dołka i 20 ? L każdej próbki do kolejnych studzienek, jak wskazano w niniejszej tabeli. Ustaw komorę elektroforezy tak, aby działała pod napięciem 100 V przez 30 minut.

Gdy żel zakończy działanie, ostrożnie odłącz komorę żelu, wyjmij tackę i wsuń żel do tacki do barwienia. Zanurz żel w zakupionej 100x plamie żelowej na 5 minut, delikatnie potrząsając tacką, aby rozprowadzić plamę. Po zabarwieniu przelej żel do pojemnika do mycia i spłukuj wodą z kranu przez około 10 s. Odplamić, myjąc trzy razy w ciepłej wodzie z kranu przez 3 minuty każdy, za każdym razem delikatnie wstrząsając, aby uzyskać najlepsze rezultaty. W razie potrzeby kontynuuj odbarwienie w ciepłej wodzie, aż do osiągnięcia pożądanego kontrastu.

Obecność lub brak pasma 200 pz na torze 4 wskazuje, czy badana żywność zawiera GMO. Startery roślinne określają, czy DNA rośliny zostało pomyślnie wyekstrahowane z próbki. Kontrola żywności niemodyfikowanej genetycznie jest wskaźnikiem wyników fałszywie dodatnich, jeśli takie wystąpią. Jeśli kontrola żywności niemodyfikowanej genetycznie wyjdzie pozytywnie, oznacza to, że PCR był w pewnym momencie skażony. Kontrola matrycy GMO-dodatniej jest wskaźnikiem wyników fałszywie ujemnych. Jeśli kontrola matrycy GMO-dodatniej nie zostanie wzmocniona, oznacza to, że wystąpił problem z reakcją PCR i nie można ufać negatywnemu wynikowi GMO z testowanej żywności.

Żele można umieścić na białym lub żółtym papierze, aby zapewnić kontrastowe tło w celu podkreślenia pasm DNA, lub zwiększyć kontrast można uzyskać za pomocą lampy UV.

Możliwość testowania środków spożywczych lub produktów pod kątem składników modyfikowanych genetycznie jest istotna dla wielu zastosowań naukowych lub regulacyjnych.

Istnieją pewne dowody na to, że transgeniczne DNA z genetycznie modyfikowanych upraw może zostać wprowadzone do genomów dzikich populacji roślin uprawnych. Na przykład zapylacze mogą ułatwiać ten transfer, nawożąc rośliny typu dzikiego pyłkiem ze źródła modyfikowanego genetycznie. Jest to niepokojące, ponieważ wpływ rozprzestrzeniania się tych wstawionych genów na ekosystemy jako całość nie jest dobrze poznany. Testy PCR dzikich populacji mogą dostarczyć danych na temat potencjalnego rozprzestrzeniania się lub skutecznego powstrzymywania wstawek genetycznych.

Brak oznakowania lub nieprawidłowe oznakowanie składników modyfikowanych genetycznie może być problemem dla konsumentów. Może to wynikać z preferencji konsumenta co do konsumpcji lub potencjalnego wprowadzenia alergenów podczas procesu GMO, choć to ostatnie jest kontrowersyjne. W niektórych krajach składniki modyfikowane genetycznie muszą być wymienione na opakowaniach żywności. Organy regulacyjne w takich krajach mogą stosować testy PCR w celu sprawdzenia dokładności etykietowania żywności.

Tam, gdzie modyfikacja genetyczna wprowadzona do uprawy nadaje odporność na pestycydy, niektóre badania wzbudziły obawy dotyczące produkcji "superchwastów". Zasadniczo może to być dowolna roślina, która początkowo nie jest przeznaczona do modyfikacji, a która uzyskuje odporność na pestycydy poprzez mechanizmy takie jak introgresja lub hybrydyzacja. Rośliny te mogą być wtedy w stanie skuteczniej się rozprzestrzeniać i być trudniejsze do kontrolowania niż te bez wkładki. Testy PCR pod kątem modyfikacji genetycznej mogą pomóc w wyróżnieniu i śledzeniu takich potencjalnych populacji w celu ustalenia, czy to rozprzestrzenianie się może okazać się problematyczne.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do testowania żywności GMO. Powinieneś teraz zrozumieć zasady identyfikacji żywności modyfikowanej genetycznie za pomocą PCR, jak ekstrahować i amplifikować DNA z żywności oraz jak określić, czy próbka żywności została zmodyfikowana genetycznie. Dzięki za oglądanie!