Analiza fizjologicznych leukocytów za pośrednictwem selektyny E toczących się po śródbłonku mikronaczyniowym
February 11th, 2009
Ten raport dostarcza wizualnego obrazu analizy komory przepływu równoległego do badania interakcji śródbłonka leukocytów pod wpływem fizjologicznego naprężenia ścinającego. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania roli ligandów selektyny śródbłonka (E) i selektyny E leukocytów, które wywołują toczenie leukocytów na powierzchni komórek śródbłonka.
Ten film przedstawia analizę w komorze z przepływem równoległym w celu zbadania czynników, które wywołują toczenie leukocytów na powierzchni komórek śródbłonka. Monowarstwy komórek śródbłonka są stymulowane przez prozapalną cytokinę IL one beta w celu zwiększenia ekspresji selektyny S. Równoległa komora przepływu płytek jest następnie umieszczana nad komórkami śródbłonka, a leukocyty selektynowo-dodatnie S są podawane na monowarstwie.
Interakcje komórkowe w komorze są zatem przekazywane z czystym stresem, który jest podobny do tego w adhezji leukocytów po naczyniach włosowatych. Zdarzenia kroczące są przechwytywane i wyliczane przy użyciu elementów NIS i testu niezależności wyboru E. Cześć, nazywam się George Weis i pracuję w laboratorium dr Charlesa de Nitro na Wydziale Dermatologii w Brigman Women's Hospital, Harvard Medical School.
Dzisiaj pokażemy Ci procedurę analizy roli selektyny e, ligandów selektyny E w adhezji ludzkich leukocytów do komórek śródbłonka ludzkiego szpiku kostnego w fizjologicznych warunkach przepływu krwi. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania roli cząsteczek na powierzchni komórek, które inicjują adhezję białych krwinek lub przerzutowych komórek rakowych do komórek śródbłonka, które wyściełają wewnętrzną powierzchnię naczyń krwionośnych. To zdarzenie adhezyjne charakteryzuje się toczeniem się jak kula do kręgli tocząca się po torze.
Więc zacznijmy. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest przygotowanie komórek śródbłonka, które będą wyściełać komorę przepływową. W protokole tym wykorzystuje się 60 komórek H-B-M-E-C pochodzących z ludzkiego szpiku kostnego.
Naczynia do hodowli mikrokrążenia powinny być wstępnie pokryte fibronektyną, aby przygotować te inkubowane 35-mililitrowe naczynia do hodowli tkankowych z PBS zawierającym 20 mikrogramów fibronektyny na promil. Można je inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zawiesić 60 komórek H-B-M-E-C w pożywce 1 99 i wysiewać od 10 do 5 komórek na szalkę, wyhodować kultury do ponad 90% konfluencji.
Zajmie to około dwóch dni, aby zwiększyć e selekcję i ekspresję, zaaspirować pożywkę wzrostową i dodać świeżą pożywkę z 50 nanogramami na promil IL jedna beta inkubacja przez cztery do sześciu godzin. Monowarstwy komórek są teraz gotowe do testu w komorze przepływowej. Dodatkowe płytki z 60 komórkami H-B-M-E-C można stymulować IL one beta i traktować neutralizującym przeciwciałem anty-ludzkim selektyną e w dawce 20 mikrogramów na promil przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Będzie to kontrolować funkcjonalną ekspresję selektyny e. Następnie przygotuj leukocyty e selektyno-dodatnie. Są to KG one, ludzkie hematopoetyczne komórki progenitorowe.
Są one hodowane w zawiesinie do zbiegu lub mają tendencję do sześciu komórek na promil w RPMI 1640. Komórki KG one A mogą być pipetowane bezpośrednio z hodowli i liczone na hemocytometrze. Resus zawiesić komórki na poziomie od 10 do sześciu komórek na promil w HBSS z 10-milimolowym buforem hep lub HH, który zawiera dwa milimolowe chlorki wapnia.
Przechowuj komórki na lodzie do czasu ich oznaczenia. Kolejnym krokiem jest przygotowanie mikroskopu, komory przepływu z równoległą płytką oraz pompy strzykawkowej. Do testu włącz mikroskop i pompę strzykawkową.
Wybierz obiektyw 10x w mikroskopie. Umieść 50-mililitrową stożkową rurkę w uchwycie i napełnij ją buforem HH z dwoma milimolowymi chlorkami wapnia. Następnie umieść pięć mililitrowych plastikowych probówek w uchwycie poniżej.
Następnie umieść 60-mililitrową strzykawkę w pompie strzykawkowej. Upewnić się, że zarówno tłok, jak i korpus strzykawki są zabezpieczone. Podłącz trójdrożny kurek zatrzymujący do końca strzykawki o grubości 60 mil, a następnie strzykawkę o grubości pięciu mil do trójdrożnego kurka zatrzymującego.
Umieść aparat z komorą z przepływem równoległym na stoliku mikroskopu z rurką wejściową po prawej stronie, rurką wyjściową po lewej stronie i rurą próżniową z tyłu. Po podłączeniu rurki do podciśnienia otwórz zawór powietrza, aby umożliwić przyleganie równoległego aparatu płytowego do stage. Pozwoli to sprawdzić, czy osłona próżniowa w komorze przepływowej jest szczelna.
Po potwierdzeniu uszczelnienia zakręć zawór powietrza. Teraz podłącz przewód wyjściowy do trójdrożnego kurka odcinającego, który jest już podłączony do strzykawki. Aparatura jest teraz gotowa do umieszczenia na 60 ogniwach H-B-M-E-C.
Włącz podciśnienie, delikatnie opuść aparat z komorą przepływową na płytę i pozwól urządzeniu zassać w dół. Nie powinno być żadnych odgłosów ulatniającego się powietrza i w tym momencie może być konieczne wywarcie nacisku na komorę, aby ścisnąć gumową uszczelkę. Po ustaleniu próżni umieść rurkę wejściową w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów.
Otwórz trójdrożny kurek odcinający do strzykawki o średnicy 60 mil i przełącz pompę w tryb pompy, aby usunąć powietrze z przewodów bez podnoszenia komórek na płytce. Użyj pompy strzykawkowej ustawionej na dwa milskawki na minutę, aby napełnić rurkę wlotową. Następnie szybko ustaw na 0,5 milsa na minutę.
Tuż przed tym, jak płyn dotrze do aparatu, bardzo ważne jest, aby dokładnie zalać zestaw i unikać pęcherzyków powietrza, które podniosą monowarstwę z płyty. Gdy płyn dostanie się do strzykawki o średnicy 60 mil, komora przepływowa i pompa strzykawkowa są zalewane. Teraz zabezpiecz przepływ w komorze do stolika za pomocą kawałka taśmy nad każdym z przewodów wejściowych, wyjściowych i próżniowych.
Gwarantuje to, że pole widzenia pozostaje stałe podczas wizualizacji i zbierania danych. Komora przepływowa jest teraz gotowa do użycia. Kroki te należy powtarzać dla każdego przebiegu wejściowego komórki i dla każdej nowej płytki.
Aby przechwycić zdarzenia kroczące witryny Lucas, otwórz elementy NIS na pulpicie, naciśnij ikonę odtwarzania, aby wyświetlić obraz na żywo. Automatyczna ekspozycja pozwoli Ci zobaczyć płytę i ustawić ostrość obrazu. Upewnij się, że mikroskop jest prawidłowo ustawiony na monowarstwie komórki, ręcznie regulując ostrość na mikroskopie.
Gdy obraz jest ostry, zresetuj ekspozycję do jednej klatki na sekundę i wyreguluj światło w mikroskopie. Obraz powinien pojawić się na komputerze i nie powinien być już widoczny w mikroskopie. Histogram światła można następnie dostosować Aby usunąć ekspozycję tła lub poprawić przejrzystość komórek, kliknij kosz dwa na dwa lub kosz na żywo, aby uzyskać obraz idealny do nagrywania filmu.
Kliknij makro na pasku menu i wybierz w prawo do portu, wybierz port com trzy i otwórz. Spowoduje to otwarcie portu w celu koordynacji z pompą strzykawkową. Komora przepływowa jest teraz gotowa do infuzji z komórkami KG jeden A, pipeta o grubości jednego milila zawiesiny KG one A S do probówki o grubości pięciu mil w pobliżu przewodu wejściowego.
Następnie umieść linię wejściową na dnie probówki. Przejdź do paska menu i kliknij przechwytywanie i akwizycja poklatkowa. Wybierz protokół trwający 210 sekund.
Jest to długość programu do zwijania na ogniwach H-B-M-E-C 60. Każda faza jest zaprogramowana tak, aby wykonywała zdjęcie co sekundę przez cały czas trwania protokołu pompy. Jest również skonfigurowany do wysyłania polecenia przez port komunikacyjny trzy, aby uruchomić pompę.
Ustaw pompę strzykawkową w tryb programowania, który pozwala na ręczne programowanie określonych natężeń przepływu. Określi to czysty poziom naprężeń w komorze i podyktuje interakcje komórek KG jeden A z komórkami H-B-M-E-C 60. Ustawienia dla tych interakcji to 4,2 dines na centymetr kwadratowy przez 45 sekund.
Przecinek trzeci na centymetr kwadratowy do kwadratu przez 60 sekund i kroki od niego zwiększają się co 15 sekund do maksymalnie 4,2 dines na centymetr kwadratowy. Mikroskop i komputer są teraz gotowe do wykonywania zdjęć poklatkowych. Naciśnij start uruchom na komputerze, aby rozpocząć pobieranie danych podczas uruchamiania programu.
Należy pamiętać, aby dodać pożywkę do rurki zawierającej ogniwa KG one A, aby rurka wejściowa wyjściowa była pełna medium i zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do systemu. Jeśli upływ czasu zostanie przerwany, pompa nie zatrzyma się samoczynnie i musi zostać zresetowana. Naciśnij przycisk Anuluj, aby powrócić do obrazu na żywo.
Niestymulowana monowarstwa komórek śródbłonka służy jako kontrola negatywna w tym eksperymencie. Aby to zrobić, wlej leukocyty KG jeden A do komory przepływowej na nieleczonych komórkach H-B-M-E-C 60 w celu kontrolowania niezależności e, stymuluj monowarstwę komórek śródbłonka IL one beta i wstrzykuj leukocyty na te komórki, aby dalej kontrolować niezależność efektu. Potraktuj komórki H-B-M-E-C 60 IL jedną beta, a następnie przeciwciałem anty-ludzkim selektyną S.
Następnie przeanalizuj zdarzenia toczenia leukocytów na tych komórkach. Zwijanie komórek jest determinowane nie tylko przez selektynę S, ale także przez reszty kwasu licowego na powierzchni komórek leukocytów. Aby to pokazać, trawić komórki KG one A z 0,1 jednostki neuraminidazy promilowej przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie przeanalizuj zdarzenia toczenia się na stymulowanych komórkach H-B-M-E-C 60. Glikoproteiny na powierzchni leukocytów są również ważne dla zwijania komórek. Można to wykazać, traktując komórki KG one A 0,2 jednostki na linię bromy przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie wprowadzając je do komory przepływowej.
Po uzyskaniu sekwencji czasowej dane są gotowe do analizy. Zapisz dane i przejdź do zakładki miara na pasku menu i wybierz zdefiniowany próg. Przesuń paski tak, aby żądane komórki były pokolorowane na czerwono, zaznacz wszystkie obrazy, a następnie w porządku, cała sekwencja poklatkowa powinna być teraz zmodyfikowana z widocznymi czerwonymi toczącymi się komórkami.
Przejdź do sekcji Miara i wybierz ograniczenia. Dzięki temu użytkownik może wykluczyć obiekty progowe, które nie reprezentują komórek tocznych. Są to przede wszystkim tło utworzone przez jednowarstwowy obszar wyboru H-B-M-E-C 60 oraz wejściowe wartości minimalne i maksymalne, które są idealne dla toczących się leukocytów.
Powtórz ten krok dla wydłużenia i kołowości Wybierz miarę, a następnie wybierz opcję Utwórz binarny przy użyciu ograniczeń. Te same wartości restrykcyjne, które zostały ustawione w poprzednim kroku, zostaną teraz wykorzystane do optymalizacji oprogramowania NIS Elements do rozpoznawania toczących się leukocytów na monowarstwie komórek śródbłonka. Wróć do mierzenia, wybierz dane pola, a następnie wybierz pozycję resetuj dane.
Zamknij menu, wróć do miary i wybierz pole skanowania, otwórz dane pola miary i wybierz liczbę lub obiekty. Następnie zaznacz wszystkie pola i wyeksportuj dane do programu Microsoft Excel. Na koniec wybierz wyczyść dane.
NIS jest teraz gotowy do zbierania większej ilości danych. Te reprezentatywne dane pokazują, w jaki sposób interakcje komórek śródbłonka leukocytów reagują na fizjologiczny stres, w szczególności testując rolę liganda adhezyjnego. E wybór.
Silne zwijanie leukocytów występuje, gdy komórki śródbłonka są wstępnie stymulowane IL one beta. Porównując ten wynik z niestymulowaną kontrolą, jasne jest, że rolowanie komórek jest zależne od stymulacji cytokin. Traktując komórki H-B-M-E-C 60 IL one beta, a następnie przeciwciałem anty-ludzkiej selektyny E, staje się jasne, że toczenie komórek zależy konkretnie od selektyny e.
Ten test może być również używany do testowania innych parametrów. Na przykład, gdy stymulowane komórki są wstępnie traktowane sazą lub broliną, wyniki są mniej solidne. Dane te podkreślają znaczenie końcowych reszt kwasu kłoskowego, a także glikoprotein na powierzchni komórki.
W przypadku aktywności liganda selektyny S właśnie pokazaliśmy, jak analizować interakcje adhezyjne oparte na selektynie e między leukocytami a komórkami śródbłonka w warunkach, które naśladują siły obecne w żynce załogowej naczynia włosowatego, regionie układu krążenia, w którym leukocyty opuszczają krew i dostają się do tkanek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o użyciu odpowiedniego przeciwciała blokującego lub kontroli leczenia enzymatycznego, aby potwierdzić konieczność stosowania odpowiedniej selektyny i jej liganda w tym systemie testowym. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
To raport przedstawia wizualne przedstawienie analizy komory przepływowej z płaszczyznami równoległymi do badania interakcji leukocytów z endotelialnymi pod warunkami fizjologicznego naprężenia ścinającego. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania roli endotelialnego (E)-selektyny oraz ligandów E-selektyny leukocytarnej, które wywołują toczenie się leukocytów na powierzchni komórek śródbłonka.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Immunologia
Tło
- Toczenie się leukocytów jest krytycznym etapem odpowiedzi immunologicznej.
- Komórki śródbłonka odgrywają kluczową rolę w mediacji adhezji leukocytów.
- Rozumienie tych interakcji może dostarczyć wglądu w choroby zapalne.
- Komory przepływowe z płaszczyznami równoległymi symulują fizjologiczne warunki do badania tych procesów.
Cel badania
- Analiza roli E-selektyny w adhezji leukocytów.
- Badanie interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka pod warunkami naprężenia ścinającego.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu przeprowadzania badań w komorach przepływowych z płaszczyznami równoległymi.
Stosowane metody
- Przygotowanie monowarstw komórek śródbłonka za pomocą komórek H-B-M-E-C 60.
- Stymulacja komórek interleukiną-1 beta w celu zwiększenia ekspresji E-selektyny.
- Wprowadzanie leukocytów dodatnich na E-selektynę do komory przepływowej.
- Rejestrowanie i liczenie zdarzeń toczenia się za pomocą oprogramowania do obrazowania.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja toczenia się leukocytów na komórkach śródbłonka.
- Demonstracja wpływu E-selektyny na adhezję leukocytów.
- Ustanowienie niezawodnej metody badania interakcji leukocyt-endotelium.
- Wgląd w mechanizmy toczenia się leukocytów w warunkach fizjologicznych.
Wnioski
- Komora przepływowa z płaszczyznami równoległymi jest skutecznym narzędziem do badania dynamiki leukocytów.
- E-selektyna odgrywa istotną rolę w mediacji toczenia się leukocytów.
- Ta metoda może być zastosowana do dalszych badań nad zapaleniem i odpowiedzią immunologiczną.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding E-selectin-mediated leukocyte rolling provides mechanistic insight into early inflammatory processes, supporting target validation for anti-inflammatory therapeutic development. This physiologic flow-based assay enables quantitative assessment of endothelial-leukocyte interactions under controlled shear stress, improving predictive confidence in target engagement and pathway modulation. The method supports preclinical de-risking by isolating the contribution of specific adhesion molecules in a disease-relevant microvascular context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the functional role of E-selectin in leukocyte recruitment, enabling hypothesis testing of inflammatory pathway involvement.
- Operational Value: Provides a reproducible system to validate target specificity using blocking antibodies or enzymatic treatments.
- Predictive Value: Supports go/no-go decisions by quantifying rolling frequency and shear resistance as functional readouts of target modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable outputs including rolling events per field and tethering efficiency under defined shear stress conditions.
- Reproducibility: Uses NIS-Elements software to define thresholds and restrict analysis to rolling leukocytes, minimizing subjectivity in data capture.
- Scalability: Enables repeated runs across cell lines and treatment conditions with consistent priming and vacuum sealing protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models leukocyte trafficking in cutaneous, bone, and inflamed tissues where E-selectin is constitutively or inducibly expressed.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes E-selectin-dependent from independent rolling using IL-1β stimulation and anti-E-selectin antibody controls.
- Translational Continuity: Links in vitro rolling behavior to in vivo extravasation, supporting biomarker alignment for leukocyte-endothelial adhesion pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, providing mechanistic insight into leukocyte-endothelial interactions that inform lead optimization and safety profiling.
- Discovery Biology: Tests the necessity of E-selectin and its ligands in leukocyte adhesion under physiologic shear, clarifying target function in inflammatory cascades.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts (rolling frequency, binding efficiency) that enable comparison across genetic or pharmacological perturbations.
- Analytics: Exports data to Excel for statistical analysis of shear-resistant adhesion, supporting dose-response and inhibitor profiling.
- Translational Research: Uses human bone marrow endothelial cells and hematopoietic progenitor cells to model clinically relevant leukocyte-endothelial interactions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying selectin-mediated adhesion across inflammation, immuno-oncology, and vascular biology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating E-selectin’s contribution to leukocyte rolling through controlled stimulation and inhibition.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized chamber preparation, shear stress profiling, and automated image analysis with NIS-Elements.
- Strategic Value: Improves target confidence by providing direct functional evidence of target-leukocyte interaction under near-physiologic conditions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-adhesion therapeutics based on quantitative inhibition of rolling under defined hemodynamic forces.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, cytokine stimulation, and microfluidic flow dynamics to maintain monolayer integrity and consistent shear stress.
- Depends on specialized instrumentation including parallel-plate flow chamber, syringe pump, and inverted microscope with video capture capability.
- Necessitates cross-team standardization of image analysis parameters (threshold, elongation, circularity) to ensure consistent rolling event quantification.
- Requires adaptation of leukocyte and endothelial cell models to reflect tissue-specific inflammation contexts (e.g., dermal vs. bone microvasculature).
- Limited to analyzing initial adhesion events; does not capture downstream processes like firm adhesion or transmigration without complementary assays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:48
Introduction
1:36
Preparation of hBMEC Monolayer on Petri Dishes
3:03
Preparation of Human Hematopoietic Progenitor KG1a Cells
3:44
Preparation of Microscope, Parallel-Plate Flow Chamber and Syringe Pump
6:26
Capturing Leukocyte Rolling Events using NIS Elements
9:21
Dependence of Terminal Sialylation and Surface Glycoprotein for E-selectin-Mediated KG1a Cell Rolling
10:43
Analysis of NIS-Elements-Captured KG1a Cells and Graphing of KG1a Cell Rolling Data
12:27
Representative Results
13:35
Conclusion
