Name: Analiza fizjologicznych leukocytów za pośrednictwem selektyny E toczących się po śródbłonku mikronaczyniowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: Poznaj analizę toczących się leukocytów przy użyciu komory przepływowej i selektyny E. Ta metoda pozwala badać interakcje leukocytów z komórkami śródbłonka w warunkach fizjologicznego stresu ścinającego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez American Cancer Society Research Scholar Award (06-024-01-CSM dla Charlesa J. Dimitroffa); grant National Institutes of Health/National Cancer Institute (RO1CA118124 dla Charlesa J. Dimitroffa) oraz grant National Institutes of Health/National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (P30 AR042689 dla dr. Thomasa S. Kuppera; Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA).

1. Przygotowanie monowarstwy hBMEC (linia komórkowa HBMEC-60) na szalkach Petriego do komory przepływowej <ol> <li>Szalki do hodowli tkankowej o wymiarach 35 x 10mm pokryć 2ml fibronektyny w stężeniu 20µg/ml (w PBS) przez noc w temperaturze 4°C lub przez 3 godziny w 37°C.</li> <li>Odssać roztwór fibronektyny z szalek i dodać do nich 1,5 x105 komórek HBMEC-60 [pożywka Medium 199 z HEPES i glutaminą, 10% FBS, 10% surowicy ludzkiej, 5 jednostek/ml heparyny, 1ng/ml rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów, 1% penicyliny i streptomycyny], a następnie pozostawić je do wzrostu do konfluencji &gt;90%. (Zajmuje to 2 dni)</li> <li>Odssać pożywkę wzrostową i, w celu upregulacji ekspresji E-selektyny, dodać świeżą pożywkę z 50ng/mL IL-1β na 4-6 godzin. Monowarstwy komórek są teraz gotowe do testu toczenia. Aby zablokować funkcję E-selektyny, można dodać neutralizujące przeciwciało monoklonalne przeciw ludzkiej E-selektynie (klon BBIG-E4(5D11)) w stężeniu 20µg/ml na ok. 1 godzinę w 37°C.</li> </ol> 2. Przygotowanie ludzkich komórek progenitorowych krwi KG1a do komory przepływowej <ol> <li>Ludzkie komórki progenitorowe układu krwiotwórczego KG1a hoduje się do uzyskania konfluencji (1x106 komórek/ml) w pożywce RPMI-1640 z glutaminą oraz 10% FBS/1% penicyliną-streptomycyną, a następnie pobiera się je pipetą bezpośrednio z kolby do użycia w badaniu w komorze przepływowej.</li> <li>Liczbę komórek wyznacza się za pomocą hemacytometru, a następnie komórki resuspenduje się w stężeniu 1 x 106 komórek/mL w buforze HBSS z 10mM HEPES (bufor H/H) i 2mM CaCl2.</li> <li>Komórki przechowuje się w lodzie do momentu użycia w badaniu.</li> </ol> 3. Przygotowanie mikroskopu, komory przepływowej z równoległymi płytkami oraz pompy strzykawkowej (Rycina 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_7/1009_figure1.png" alt="Schemat układu mikroskopowego do obrazowania komórek z pompą strzykawkową, kamerą CCD, komputerem i mikroskopem." width="600" height="409" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1.Ilustracja analizy w komorze przepływowej z równoległymi płytkami. Mikroskop odwrócony, pompa strzykawkowa Harvard, komputer/kamera oraz komora przepływowa z równoległymi płytkami są rozmieszczone w optymalny sposób, aby zapewnić wydajną i powtarzalną analizę komórek. <ol> <li>Włącz zasilanie oraz źródło światła mikroskopu odwróconego, zasilanie pompy strzykawkowej i wybierz obiektyw 10X w mikroskopie.</li> <li>Umieść probówkę stożkową 50 mL w uchwycie i napełnij ją roztworem H/H oraz 2 mM CaCl2.</li> <li>Umieść plastikowe probówki 5 ml w statywie pod probówką stożkową 50 mL.</li> <li>Umieść strzykawkę 60 mL w pompie strzykawkowej (upewnij się, że zarówno tłok, jak i korpus strzykawki są zabezpieczone).</li> <li>Przymocuj trójdrożny kranik do końca strzykawki 60 mL, a następnie przymocuj strzykawkę 5 mL do kranika.</li> <li>Umieść aparat do komory przepływu równoległego (Parallel Flow Chamber, GlycoTech, Inc.) na stoliku mikroskopu tak, aby rurka wlotowa znajdowała się po prawej stronie, rurka wylotowa po lewej, a rurka próżniowa z tyłu.</li> <li>Podłącz przewód próżniowy do pompy próżniowej i otwórz zawór powietrzny, aby aparat do płytek równoległych przylgnął do stolika. (Służy to do sprawdzenia szczelności uszczelki próżniowej komory przepływowej). Zamknij zawór powietrzny.</li> <li>Podłącz linię wylotową (po lewej stronie mikroskopu) do trójdrożnego kranika. Aparat jest teraz przygotowany do umieszczenia na płytce z monowarstwą HBMEC-60.</li> <li>Weź płytkę z monowarstwą HBMEC-60 i umieść ją w centrum mikroskopu.</li> <li>Włącz próżnię i ustaw aparat komory przepływowej nad płytką w taki sposób, aby płytka z monowarstwą znajdowała się w centrum.</li> <li>Ostrożnie opuść aparat komory przepływowej na płytkę z monowarstwą HBMEC-60 i pozwól, aby aparat został zassany. (Nie powinno być słychać uciekającego powietrza; w tym momencie może być konieczne dociśnięcie komory, aby skompresować gumową uszczelkę).</li> <li>Po wytworzeniu próżni umieść rurkę wlotową (po prawej stronie) w probówce stożkowej 50 mL zawierającej H/H z 2 mM CaCl2.</li> <li>Otwórz trójdrożny kranik, aby umożliwić przepływ do strzykawki 60 mL, i przełącz pompę w tryb „pump mode”.</li> <li>Aby usunąć powietrze z linii wlotowych/wylotowych bez odrywania komórek od płytki, użyj pompy strzykawkowej ustawionej na 2 mL/minutę, aby napełnić rurkę wlotową, a następnie szybko zmień ustawienie na 0,5 mL/minutę tuż przed dotarciem cieczy do aparatu. Niezbędne jest staranne odpowietrzenie układu, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, które mogłyby oderwać monowarstwę od płytki.</li> <li>Gdy ciecz zacznie przemieszczać się do strzykawki 60 ml, oznacza to, że komora przepływowa i pompa strzykawkowa zostały odpowietrzone, a komora przepływowa jest gotowa do użycia. Procedurę tę należy powtórzyć dla każdego cyklu wprowadzania komórek oraz dla każdej nowej potrzebnej płytki.</li> </ol> 4. Rejestracja zdarzeń toczenia się leukocytów przy użyciu oprogramowania NIS Elements <ol> <li>Otwórz program NIS Elements na komputerze.</li> <li>Naciśnij ikonę „odtwarzaj”, aby uzyskać obraz na żywo. Automatyczna ekspozycja ułatwi na tym etapie dostrzeżenie płytki i jest istotna dla ustawienia ostrości.</li> <li>Upewnij się, że mikroskop jest prawidłowo ustawiony na monowarstwę komórek.</li> <li>Po ustawieniu ostrości zresetuj ekspozycję na 1 klatka/sekundę i dostosuj oświetlenie mikroskopu. Ze względu na niski poziom światła obraz powinien pojawić się na komputerze i przestać być widoczny w okularze mikroskopu. Następnie można dostosować histogram światła, aby usunąć ekspozycję tła lub poprawić klarowność komórek.</li> <li>Kliknij 2X2 bin lub Live Bin, aby uzyskać obraz idealny do rejestracji filmu.</li> <li>Kliknij „Macro” na pasku menu i wybierz „write to port”; wybierz port „com3” i „open”. (Otwiera to port w celu koordynacji z pompą strzykawkową).</li> <li>Pipetuj 1mL zawiesiny komórek KG1a do probówki 5ml w pobliżu linii rurki doprowadzającej, a następnie umieść rurkę doprowadzającą na dnie probówki.</li> <li>Przejdź do paska menu, kliknij „Capture”, a następnie „time-lapse acquisition”.</li> <li>Pojawi się nowe menu. Wybierz protokół trwający 210 s, co odpowiada długości programu dla rolowania komórek HBMEC-60. (Każda faza jest zaprogramowana tak, aby robić zdjęcie co sekundę przez cały czas trwania protokołu pompy. Jest on również skonfigurowany tak, aby wysłać polecenie przez port com3 w celu uruchomienia pompy). Jeśli sekwencja time-lapse zostanie przerwana, pompa nie zatrzyma się automatycznie i musi zostać zresetowana. Naciśnij Cancel, aby powrócić do obrazu na żywo.</li> <li>Ustaw pompę strzykawkową w trybie „Program Mode” zgodnie z instrukcją obsługi. (Tryb Program Mode umożliwia ręczne programowanie konkretnych szybkości przepływu (tj. poziomów naprężenia ścinającego) wewnątrz komory i dyktuje interakcje komórek KG1a z monowarstwą komórek HBMEC-60). Ustawienia dla rolowania komórek KG1a na komórkach hBMEC były następujące: 4.2 dynes/cm2 przez 45 s, 0.3 dynes/cm2 przez 60 s oraz stopniowe zwiększanie co 15 s do maksimum 4.2 dynes/cm2.</li> <li>Przyścienne naprężenie ścinające (Wst) w komorze obliczono według następującego równania: Wst = 6µQ/a2b, gdzie μ to szacowana lepkość medium (0.0076 P), Q to objętościowa szybkość przepływu w ml/s, a to wysokość kanału (grubość uszczelki) w cm (0.03 cm), a b to szerokość kanału w cm (0.5 cm). Szybkości przepływu regulowano za pomocą trybu Program Mode pompy strzykawkowej.</li> <li>Mikroskop i komputer są teraz gotowe do rejestracji zdjęć w trybie time-lapse. Naciśnij „start run” na komputerze, aby rozpocząć zbieranie danych. Podczas uruchamiania programu pamiętaj o dodawaniu medium do probówki z komórkami KG1a, aby rurki doprowadzające i odprowadzające były pełne medium (Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza).</li> </ol> 5. Zależność toczenia komórek KG1a od terminalnej sialilacji i glikoprotein powierzchniowych w procesie zależnym od E-selektyny (Rycina 2; Klipy wideo 5.1-5.5) <ol> <li>Analiza toczenia komórek KG1a na niestymulowanych komórkach HBMEC-60. (Kontrola negatywna) Komórki KG1a przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej nad żywymi, niestymulowanymi IL-1β komórkami HBMEC-60 zgodnie z powyższym opisem.</li> <li>Analiza toczenia komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 wstępnie traktowanych IL-1β. (Kontrola zależności od E-selektyny) Komórki KG1a przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej nad żywymi, stymulowanymi IL-1β komórkami HBMEC-60 zgodnie z powyższym opisem.</li> <li>Analiza toczenia komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 wstępnie traktowanych IL-1β, a następnie neutralizującym przeciwciałem monoklonalnym anty-ludzką E-selektynę. (Kontrola zależności od E-selektyny) Komórki KG1a przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej nad żywymi, stymulowanymi IL-1β komórkami HBMEC-60, wstępnie traktowanymi neutralizującym przeciwciałem monoklonalnym anty-ludzką E-selektynę zgodnie z powyższym opisem.</li> <li>Analiza toczenia komórek KG1a trawionych sialidazą na stymulowanych IL-1β komórkach HBMEC-60. Komórki KG1a wstępnie traktowane neuraminidazą z Vibrio Cholerae w stężeniu 0.1U/ml przez 1h w 37°C przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej nad żywymi, stymulowanymi IL-1β komórkami HBMEC-60 zgodnie z powyższym opisem.</li> <li>Analiza toczenia komórek KG1a trawionych proteazą na stymulowanych IL-1β komórkach HBMEC-60. Komórki KG1a wstępnie traktowane proteazą, bromelainą w stężeniu 0.2U/ml przez 1h w 37°C, przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej nad żywymi, stymulowanymi IL-1β komórkami HBMEC-60 zgodnie z powyższym opisem.</li> </ol> 6. Analiza komórek KG1a wychwyconych przez NIS-Elements oraz wykreślanie danych dotyczących toczenia się komórek KG1a <ol> <li>Po pozyskaniu sekwencji czasowej zapisz dane.</li> <li>Przejdź do karty „measure” na pasku menu i wybierz „define threshold”. Przesuń suwaki tak, aby pożądane komórki zostały zaznaczone kolorem czerwonym. Wybierz „all images”, a następnie „Okay”. Cała sekwencja time-lapse powinna zostać zmodyfikowana, wykazując widoczne czerwone komórki toczące się.</li> <li>Przejdź do „Measure” i wybierz „restrictions”. (Ograniczenia pozwalają użytkownikowi wykluczyć obiekty spełniające próg, które nie reprezentują komórek toczących się. Jest to przede wszystkim tło utworzone przez monowarstwę HBMEC-60). Wybierz „area” i wprowadź minimalne oraz maksymalne wartości pola powierzchni dla komórek toczących się. Powtórz ten krok dla „elongation” oraz „circularity”.</li> <li>Wybierz „measure”, a następnie „create binary using restrictions” i ustaw wartości ograniczeń, aby zoptymalizować rozpoznawanie komórek toczących się na monowarstwie komórek HBMEC-60 przez oprogramowanie NIS-Elements.</li> <li>Wróć do „measure”, wybierz „Field data”, a następnie „reset data”. Zamknij to menu.</li> <li>Powróć do „Measure” i wybierz „scan field”.</li> <li>Otwórz „Measure”; „Field data”, wybierz „number or Objects”, a następnie „all fields” i wyeksportuj dane do programu Microsoft Excel.</li> <li>Wybierz „clear data”, aby przygotować moduł akwizycji komórek NIS-Elements do kolejnego zbierania danych.</li> </ol> Wyniki: <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_8/1009_figure3.png" alt="Toczenie komórek KG1a na komórkach HBME-60, wykres liniowy, stymulacja IL-1β, siła ścinania, odpowiedź komórkowa." width="600" height="382" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> Rycina 3. Analiza aktywności wiązania E-selektyny na komórkach KG1a w komorze przepływowej z równoległymi płytkami. Komórki KG1a traktowane sialidazą lub proteazą poddano analizie wydajności toczenia na monowarstwach komórek HBMEC-60 wstępnie traktowanych IL-1β. Przeprowadzono również eksperymenty kontrolne z toczeniem, analizując toczenie komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 niestymulowanych IL-1β lub na komórkach HBMEC-60 stymulowanych IL-1β i traktowanych neutralizującym przeciwciałem monoklonalnym anty-ludzką E-selektynę (5D11). Częstotliwości toczenia komórek wyznaczono w trzech powtórzeniach i przeanalizowano za pomocą oprogramowania NIS-Elements. (* Istotność statystyczna; p&lt;0.001)   W niniejszym raporcie w formie wideo przedstawiliśmy wizualizację sposobu analizy oddziaływań między leukocytami a komórkami śródbłonka w fizjologicznych warunkach naprężenia ścinającego. W szczególności przeanalizowano rolę E-selektyny i ligandów E-selektyny w pośredniczeniu w przytwieraniu (tethering) i toczeniu się (rolling) leukocytów, co jest zachowaniem adhezyjnym niezbędnym do zainicjowania wtórnych, bardziej stabilnych aktywności wiążących za pośrednictwem receptorów, takich jak integryny i receptory hialuronianu. Wykorzystując komorę przepływową z równoległymi płytkami przystosowaną do pracy z mikroskopem odwróconym, pompę strzykawkową Harvard, kamerę wideo oraz komputer z sprzętem do akwizycji obrazów komórkowych, przeprowadzono eksperymenty, w których jako model leukocytów wykorzystano komórki KG1a wykazujące obecność liganda E-selektyny, a jako model ludzkich komórek śródbłonka E-selektyna+ wykorzystano komórki hBMEC (HBMEC-60) stymulowane prozapalną cytokiną IL-1β (1-6). Jak raportowano wcześniej, zaobserwowano intensywne toczenie się komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 stymulowanych IL-1β w szerokim zakresie poziomów naprężenia ścinającego w sposób zależny od E-selektyny (Rycina 3) (różnica istotna statystycznie w porównaniu z toczeniem się komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 niestymulowanych IL-1β). W celu wykazania zależności aktywności toczenia się od stymulacji cytokiną i ekspresji E-selektyny, równolegle przeprowadzono kontrole negatywne, polegające na badaniu toczenia się komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 niestymulowanych IL-1β lub na komórkach HBMEC-60 stymulowanych IL-1β i uprzednio potraktowanych przeciwciałem monoklonalnym anty-ludzka E-selektyna (Rycina 3). Ponadto analiza toczenia się komórek KG1a uprzednio potraktowanych neuraminidazą z Vibrio cholerae (sialidazą) lub bromelainą – nieswoistą proteazą znaną z trawienia powierzchniowego glikoproteinowego liganda E-selektyny – podkreśliła znaczenie terminalnych reszt kwasu sialowego oraz glikoprotein powierzchniowych dla aktywności liganda E-selektyny (2,3).

<ol><li>Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+leukocytic+migration+to+inflamed+skin+with+a+novel+fluorosugar+modifier+of+cutaneous+lymphocyte-associated+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen.</a> J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 Forthcoming.</li>
<li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li>
<li>Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+leukocyte+E-selectin+ligands%2C+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+and+E-selectin+ligand-1%2C+on+human+metastatic+prostate+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells.</a> Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).</li>
<li>Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ameliorating+Skin-Homing+Receptors+on+Malignant+T+cells+with+a+Fluorosugar+Analog+of+N-acetylglucosamine%3A+P-selectin+Ligand+is+a+More+Sensitive+Target+than+E-selectin+Ligand%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand.</a> J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).</li>
<li>Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-homing+receptors+on+effector+leukocytes+are+differentially+sensitive+to+glyco-metabolic+antagonism+in+allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis.</a> J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).</li>
<li>Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+human+bone+marrow+endothelial+cells%3A+characterisation+of+new+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines.</a> Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów ani ujawnień.

Analiza w komorze przepływowej z równoległymi płytkami to wyspecjalizowany system testów in vitro stosowany do badania oddziaływań adhezyjnych między leukocytami a śródbłonkiem w warunkach naprężenia ścinającego, podobnych do tych występujących na powierzchni żyłki zakapiilarnej. Jak przedstawiono w naszej prezentacji wizualnej, demonstrujemy przydatność tego systemu do badania roli E-selektyny i ligandów E-selektyny w pośredniczeniu w przytwieraniu i toczeniu się leukocytów na powierzchni aktywowanego śródbłonka mikroznaczyniowego. Przedstawiamy również zastosowanie proteaz, glikozydaz oraz przeciwciał blokujących w celu wyjaśnienia roli E-selektyny i jej ligandów w tym systemie. Analizy te są wysoce powtarzalne i stanowią podstawę eksperymentalną do badania funkcji E-selektyny i ligandów E-selektyny in vivo.
Oprócz badania adhezji komórek z wykorzystaniem monowarstw aktywowanych cytokinami mikro naczyniowych komórek śródbłonka (hBMEC lub ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej lub dermalnych mikro naczyniowych komórek śródbłonka), testy można przeprowadzać, stosując oczyszczoną rekombinowaną ludzką E-selektynę lub chimeryczne cząsteczki E-selectin-Ig jako podłoże do adhezji komórek. Inne oddziaływania adhezyjne zapośredniczone przez selektynę leukocytarną (L-selektynę) i selektynę płytkową (P-selektynę) można również badać przy użyciu technologii komory przepływowej z równoległymi płytkami. Poprzez zmianę rodzaju monowarstwy komórek/podłoża białkowego lub modeli komórek leukocytów/transfektantów selektyny, badacze mogą analizować rolę tych oddziaływań w fizjologicznych warunkach naprężenia ścinającego.

<table><tbody><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do komory przepływowej z równoległymi płytkami</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Programowalna pompa strzykawkowa PHD2000</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>szalka do hodowli tkankowej 35x10 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Fibrynogenia z ludzkiej osocza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86088-83-7 F2006-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Interleukina-1, ludzka; rekombinowana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9401-5UG</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (roztwór soli buforowej Hanksa)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Medium 199 z HEPES &amp;amp; Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>12320-039</td><td></td></tr><tr><td>Surowica ludzka</td><td>Innovative Research, Inc.</td><td>IPLA-SER1</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Abraxis BioScience</td><td>504011</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>penicylina streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe probówki</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko ludzkiej E-selektynie, klon BBIG-E4(5D11)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BBA16</td><td></td></tr><tr><td>Bromelaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-4882</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza fizjologicznego toczkowania leukocytów zapśredniczonego przez e-selektynę na śródbłonku mikrokrążenia

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

E-selektyna jest białkiem błonowym typu 1 występującym na komórkach śródbłonka mikrokrążenia, które wspomaga inicjację rekrutacji krążących leukocytów do tkanek skóry, kości oraz tkanek zapalnych. Ekspresja E-selektyny jest konstytutywna w mikrokrążeniu skóry i kości, natomiast w mikrokrążeniu tkanek zapalnych jest indukowalna przez cytokiny prozapalne, takie jak IL-1α i TNF-α. Ten receptor lektynowy pośredniczy w słabych oddziaływaniach wiążących z węglowodanowymi ligandami przeciwreceptorowymi na krążących leukocytach, co skutkuje charakterystycznym zjawiskiem toczenia (rolling). Ponieważ oddziaływania te poprzedzają stabilniejsze zdarzenia adhezyjne oraz proces diapedez, charakterystyka aktywności toczenia leukocytów oraz identyfikacja ligandów E-selektyny na leukocytach stanowiły główne cele badań nad migracją leukocytów i stanami zapalnymi, a także prac nad rozwojem leków przeciwzapalnych (1-5). Celem niniejszego opracowania jest przedstawienie kompleksowego opisu wizualnego najszerzej stosowanej technologii do badania oddziaływań E-selektyna–ligand E-selektyny w fizjologicznych warunkach przepływu krwi. Nasze laboratorium, we współpracy z Harvard Skin Disease Research Center, wykorzystuje nowoczesny aparat z komorą przepływową z równoległymi płytkami (parallel-plate flow chamber), wspierany cyfrową wizualizacją oraz nowym oprogramowaniem rejestrującym NIS-Elements. Technologia ta pozwala nam na analizę zdarzeń adhezyjnych w czasie rzeczywistym za pomocą wizualizacji ekranowej, a także na rejestrację aktywności toczenia w formacie wideo. Parametry adhezji komórek, takie jak częstotliwość toczenia, odporność na siły ścinające oraz wydajność wiązania/tetheringu, są obliczane za pomocą oprogramowania NIS-Elements, eksportowane do arkusza Excel i poddawane analizie statystycznej. W zaprezentowanej tutaj demonstracji wykorzystaliśmy komorę przepływową z równoległymi płytkami do zbadania zależnej od E-selektyny aktywności toczenia leukocytów na żywych ludzkich komórkach śródbłonka szpiku kostnego (hBMEC). Jako model leukocytów wykorzystano ludzkie komórki progenitorowe krwiotwórcze KG1a, które wykazują wysoki poziom ekspresji ligandu E-selektyny, natomiast jako model komórek śródbłonka wykorzystano unieśmiertelnioną linię komórkową hBMEC, komórki HBMEC-60 (6). Aby wywołać i zasymulować natywną ekspresję E-selektyny w komorze przepływowej, komórki HBMEC-60 zostały uprzednio aktywowane za pomocą IL-1. Nasza prezentacja wideo wykazała, że analiza w komorze przepływowej z równoległymi płytkami jest odpowiednią metodą badania fizjologicznej aktywności toczenia leukocytów pośredniczonej przez E-selektynę oraz że funkcjonalna charakterystyka ligandu(ów) E-selektyny na leukocytach w komorze przepływowej może zostać ustalona poprzez zastosowanie trawienia proteazami lub glikozydazami.

Niniejszy raport przedstawia wizualizację analizy w komorze przepływowej z równoległymi płytkami, służącej do badania oddziaływań leukocytów z śródbłonkiem w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego. Metoda ta jest szczególnie użyteczna w badaniu roli selektyny E (E-selectin) oraz ligandów selektyny E na leukocytach, które inicjują toczenie się leukocytów po powierzchniach komórek śródbłonka.

Analiza fizjologicznego toczkowania leukocytów zapśredniczonego przez E-selektynę na śródbłonku mikrokrążenia

E-selektyna jest białkiem błonowym typu 1 występującym na komórkach śródbłonka mikrokrążenia, które wspomaga inicjację rekrutacji krążących leukocytów do skóry, kości...

W tym filmie przedstawiono analizę z wykorzystaniem komory przepływowej o równoległych płytkach w celu zbadania czynników wyzwalających toczenie się leukocytów na powierzchniach komórek śródbłonka. Monowarstwy komórek śródbłonka są stymulowane prozaplaną cytokiną IL one beta w celu zwiększenia ekspresji S-selektyny. Następnie komora przepływowa o równoległych płytkach jest umieszczana nad komórkami śródbłonka, a nad monowarstwę wprowadzane są leukocyty wykazujące obecność S-selektyny.Oddziaływania komórkowe w komorze są zatem poddawane naprężeniom ścinającym, podobnym do tych występujących podczas adhezji leukocytów w naczyniach pokapilarnych. Zdarzenia toczenia są rejestrowane i przeliczane przy użyciu elementów NIS w celu oceny niezależności od E-selektyny. Cześć, jestem George Weis z laboratorium dr. Charlesa de Nitro w Departamencie Dermatologii w Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę analizy roli e-selektyny oraz ligandów E-selektyny w adhezji leukocytów ludzkich do komórek śródbłonka szpiku kostnego człowieka w fizjologicznych warunkach przepływu krwi. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania roli cząsteczek powierzchniowych komórek, które inicjują adhezję białych krwinek lub przerzutowych komórek nowotworowych do komórek śródbłonka wyścielających wewnętrzną powierzchnię naczyń krwionośnych. Zdarzenie adhezyjne to charakteryzuje się zachowaniem przypominającym toczenie, podobnym do ruchu kuli w kręglach toczącej się po torze.Zacznijmy zatem. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest przygotowanie komórek śródbłonka, które wyścielą komorę przepływową. W tym protokole zastosowano komórki H-B-M-E-C 60 pochodzące z ludzkiego szpiku kostnego.Naczynia do hodowli mikro naczyniowej powinny zostać uprzednio pokryte fibronektyną; aby je przygotować, należy inkubować naczynia hodowlane o pojemności 35 ml z PBS zawierającym 20 µg/ml fibronektyny. Można je inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub przez trzy godziny w temperaturze 37 °C. Zawiesić komórki H-B-M-E-C 60 w medium 1 99 i wysiać w zagęszczeniu 10⁵ komórek na naczynie, a następnie hodować kultury do uzyskania ponad 90% konfluencji.Proces ten potrwa około dwóch dni w celu upregulacji e-selektyny i ekspresji; należy odessać pożywkę wzrostową i dodać świeżą pożywkę zawierającą 50 ng/ml IL-1β, a następnie inkubować przez cztery do sześciu godzin. Monowarstwy komórek są teraz gotowe do analizy w komorze przepływowej. Dodatkowe płytki z komórkami HBMEC-60 można stymulować IL-1β i traktować neutralizującym przeciwciałem przeciwko ludzkiej e-selektynie w stężeniu 20 µg/ml przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.Będzie to służyć jako kontrola ekspresji funkcjonalnej e-selektyny. Następnie należy przygotować leukocyty pozytywne pod kątem e-selektyny. Są to komórki KG-1a, czyli ludzkie progenitorowe komórki krwiotwórcze.Komórki te hoduje się w zawiesinie do osiągnięcia konfluencji lub zagęszczenia 6 × 10⁶ komórek/ml w pożywce RPMI 1640. Komórki KG-1A można pipetować bezpośrednio z hodowli i zliczać za pomocą hemocytometru. Resuspenduj komórki do stężenia 10⁶ komórek/ml w buforze HBSS z 10 mM HEPES lub buforze HH zawierającym 2 mM chlorku wapnia.Przechowywać komórki w lodzie do czasu przeprowadzenia analizy. Kolejne kroki obejmują przygotowanie mikroskopu, równoległej komory przepływowej oraz pompy strzykawkowej. W celu przeprowadzenia analizy należy włączyć mikroskop i pompę strzykawkową.Wybierz obiektyw 10x w mikroskopie. Umieść probówkę stożkową o pojemności 50 mililitrów w uchwycie i napełnij ją buforem HH z dwumilimolarnym chlorkiem wapnia. Następnie umieść plastikowe probówki testowe o pojemności pięciu mililitrów w uchwycie poniżej.Następnie umieść strzykawkę 60 ml w pompie strzykawkowej. Upewnij się, że zarówno tłok, jak i korpus strzykawki są stabilnie zamocowane. Do końcówki strzykawki 60 ml podłącz kurek trójdrożny, a następnie do kurka trójdrożnego podłącz strzykawkę 5 ml.Umieść aparat z komorą przepływu równoległego na stoliku mikroskopu, tak aby rurka wlotowa znajdowała się po prawej stronie, rurka wylotowa po lewej, a rurka próżniowa z tyłu. Po podłączeniu przewodów do pompy próżniowej otwórz zawór powietrza, aby aparat z płytami równoległymi przyległ do stolika. Pozwoli to sprawdzić, czy uszczelka próżniowa komory przepływu jest szczelna.Po potwierdzeniu szczelności zamknij zawór powietrza. Następnie podłącz linię rurki wyjściowej do trójdrożnego kranu, który jest już połączony ze strzykawką. Aparatura jest teraz gotowa do umieszczenia nad komórkami H-B-M-E-C 60.Włącz pompę próżniową, ostrożnie opuść aparat z komorą przepływową na płytkę i pozwól, aby urządzenie zostało zassane. Nie powinno być słychać uciekającego powietrza; w tym momencie może być konieczne wywarcie nacisku na komorę, aby ścisnąć gumową uszczelkę. Po wytworzeniu próżni umieść rurkę doprowadzającą w sto pięćdziesięciomililitrowej probówce stożkowej.Otwórz trójdrożny kurek stopowy do strzykawki 60 ml i przełącz pompę w tryb pompowania, aby usunąć powietrze z przewodów, nie unosząc komórek na płytce. Użyj pompy strzykawkowej ustawionej na dwie ml na minutę, aby wypełnić rurkę doprowadzającą. Następnie szybko zmień ustawienie na 0,5 ml na minutę.Tuż przed doprowadzeniem cieczy do aparatury kluczowe jest uważne przygotowanie układu (tzw. priming), aby uniknąć pęcherzyków powietrza, które mogłyby oderwać monowarstwę od płytki. Gdy ciecz wpłynie do strzykawki o rozmiarze 60 mil, komora przepływowa oraz pompa strzykawkowa zostaną odpowiednio przygotowane. Następnie należy przymocować komorę przepływową do stolika za pomocą taśmy, zabezpieczając każdą z linii doprowadzającej, odprowadzającej oraz linię próżni.Zapewnia to stałe pole widzenia podczas wizualizacji i zbierania danych. Komora przepływowa jest teraz gotowa do użycia. Kroki te należy powtórzyć dla każdego cyklu wprowadzania komórek oraz dla każdej nowej płytki.Aby zarejestrować zdarzenia toczenia w miejscach Lucas, otwórz program NIS elements na pulpicie i naciśnij ikonę odtwarzania, aby uzyskać obraz na żywo. Automatyczna ekspozycja pozwoli na zobaczenie płytki i ustawienie ostrości obrazu. Upewnij się, że mikroskop jest odpowiednio ustawiony na monowarstwę komórek, regulując ostrość ręcznie na mikroskopie.Po ustawieniu ostrości obrazu, zresetuj ekspozycję do jednej klatki na sekundę i wyreguluj oświetlenie mikroskopu. Obraz powinien pojawić się na komputerze i nie powinien być już widoczny w okularach mikroskopu. Następnie można dostosować histogram światła. Aby usunąć ekspozycję tła lub poprawić wyraźność komórek, kliknij 2x2 bin lub live bin, aby uzyskać obraz idealny do rejestracji filmu.Kliknij pole „macro” na pasku menu i wybierz „right to port”, następnie wybierz port COM3 i zatwierdź „open”. Operacja ta otwiera port w celu synchronizacji z pompą strzykawkową. Komora przepływowa jest teraz gotowa do infuzji komórek KG-1A; pipetuj 1 ml zawiesiny KG-1A do probówki testowej o pojemności 5 ml znajdującej się w pobliżu linii rurki doprowadzającej.Następnie umieść linię doprowadzającą na dnie probówki. Przejdź do paska menu i kliknij funkcję przechwytywania oraz akwizycji poklatkowej. Wybierz protokół trwający 210 sekund.Jest to długość programu dla procesu toczenia na komórkach H-B-M-E-C 60. Każda faza jest zaprogramowana tak, aby wykonywać zdjęcie co sekundę przez cały czas trwania protokołu pompowania. Program jest również skonfigurowany do wysyłania polecenia przez port comm three w celu uruchomienia pompy.Ustaw pompę strzykawkową w trybie programowania, który umożliwia ręczne programowanie konkretnych szybkości przepływu. Określi to poziomy naprężenia ścinającego w komorze i podyktuje interakcje komórek KG one A z komórkami H-B-M-E-C 60. Parametry dla tych interakcji wynoszą 4,2 dines per centimeter squared przez 45 seconds.Wartość 3 dyn/cm² utrzymuje się przez 60 s, a następnie co 15 s następuje wzrost do maksymalnej wartości 4,2 dyn/cm². Mikroskop i komputer są teraz gotowe do rejestracji fotografii poklatkowej. Należy nacisnąć przycisk „Start run” na komputerze, aby rozpocząć pozyskiwanie danych podczas uruchamiania programu.Należy pamiętać o dodaniu pożywki do probówki zawierającej komórki KG one A, aby rurki doprowadzające i odprowadzające pozostały pełne pożywki i zapobiec przedostaniu się pęcherzyków powietrza do systemu. Jeśli sekwencja zdjęć w odstępach czasu (time lapse) zostanie przerwana, pompa nie zatrzyma się automatycznie i musi zostać zresetowana. Naciśnij przycisk anuluj, aby powrócić do obrazu na żywo.Niepobudzana monowarstwa komórek śródbłonka służy jako kontrola negatywna w tym eksperymencie. W tym celu należy wprowadzić leukocyty KG-1A do komory przepływowej nad niepoddane działaniu czynników komórki HBMEC-60 w celu wykluczenia zależności od E-selektyny; następnie należy pobudzić monowarstwę komórek śródbłonka za pomocą IL-1β i wprowadzić leukocyty nad te komórki, aby dodatkowo wykluczyć zależność od E-selektyny. Komórki HBMEC-60 należy poddać działaniu IL-1β, a następnie przeciwciała anty-ludzkiej P-selektyny.Następnie analizuje się zdarzenia toczenia leukocytów na tych komórkach. Toczenie komórek jest determinowane nie tylko przez selektynę S, ale także przez reszty kwasu sialowego na powierzchni komórki leukocytu. Aby to wykazać, poddaje się komórki KG one A trawieniu neuraminidazą w stężeniu 0,1 jednostek na ml przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.Następnie przeanalizuj zdarzenia toczkowania na stymulowanych komórkach H-B-M-E-C 60. Glikoproteiny na powierzchni leukocytów są również istotne dla toczkowania komórek. Można to zademonstrować, traktując komórki KG one A 0,2 j/ml bromelaniny przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie wprowadzając je do komory przepływowej.Po zarejestrowaniu sekwencji czasowej dane są gotowe do analizy. Zapisz dane, przejdź do karty pomiarów (measure) na pasku menu i wybierz zdefiniowany próg (defined threshold). Przesuń suwaki tak, aby pożądane komórki zostały zaznaczone na czerwono, zaznacz wszystkie obrazy, a następnie zatwierdź przyciskiem OK; cała sekwencja time-lapse powinna zostać teraz zmodyfikowana, ukazując widoczne czerwone, toczące się komórki.Przejdź do pomiaru i wybierz ograniczenia. Pozwala to użytkownikowi wykluczyć obiekty przekraczające próg, które nie reprezentują toczących się komórek. Są to głównie elementy tła powstałe w wyniku wyboru obszaru monowarstwy H-B-M-E-C 60; wprowadź wartości minimalne i maksymalne, które są optymalne dla toczących się leukocytów.Powtórz ten krok dla elongacji i kolistości. Wybierz measure, a następnie wybierz create binary using restrictions. Te same wartości restrykcji, które zostały ustawione w poprzednim kroku, zostaną teraz wykorzystane do optymalizacji oprogramowania NIS elements w celu rozpoznawania toczących się leukocytów na monowarstwie komórek śródbłonka. Powróć do measure, wybierz field data, a następnie wybierz reset data.Zamknij menu, powróć do pomiaru i wybierz pole skanowania, otwórz dane pola pomiarowego, a następnie wybierz liczbę obiektów. Następnie zaznacz wszystkie pola i wyeksportuj dane do programu Microsoft Excel. Na koniec wybierz opcję wyczyść dane.Elementy NIS są teraz gotowe do dalszego gromadzenia danych. Te reprezentatywne dane pokazują, w jaki sposób oddziaływania leukocytów z komórkami śródbłonka reagują na fizjologiczny stres ścinający, konkretnie testując rolę liganda adhezyjnego E-selektyny.Intensywne toczenie się leukocytów występuje, gdy komórki śródbłonka zostaną wstępnie pobudzone IL-1β. Porównując ten wynik z niepobudzoną próbą kontrolną, można stwierdzić, że toczenie się komórek zależy od stymulacji cytokinami. Poprzez potraktowanie komórek HBMEC-60 IL-1β, a następnie przeciwciałem przeciwko ludzkiej selektynie E, staje się jasne, że toczenie się komórek zależy konkretnie od selektyny E.Niniejszy test może być również wykorzystany do badania innych parametrów. Na przykład, gdy komórki stymulowane są poddane wstępnej obróbce sase lub brolinem, wyniki są mniej wyraźne. Dane te podkreślają znaczenie terminalnych reszt kwasu sjalowego, jak również glikoprotein powierzchniowych komórek.W przypadku badania aktywności liganda selektyny S, zaprezentowaliśmy właśnie sposób analizy oddziaływań adhezyjnych opartych na e-selektynie pomiędzy leukocytami a komórkami śródbłonka w warunkach naśladujących siły występujące w żyłkach posutylarnych, czyli w regionie układu krwionośnego, w którym leukocyty opuszczają krew i wnikają do tkanek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zastosowaniu odpowiedniego przeciwciała blokującego lub kontroli z użyciem obróbki enzymatycznej w celu potwierdzenia niezbędności danej selektyny oraz jej liganda w tym systemie analizy. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

analysis-physiologic-e-selectin-mediated-leukocyte-rolling-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza fizjologicznego toczenia leukocytów pośredniczonego przez E-Selectiny na mikronaczyniowym śródbłonku

Opisujemy protokół obserwacji i analizy trajektorii toczenia się komórek na podłożach z asymetrycznym wzorem receptorów. Uzyskane dane są przydatne przy projektowaniu podłoży z wzorem receptorów do bezznakowej separacji i analizy komórek.

Badanie trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorów

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

To badanie wykorzystało wielodołkowy system mikroprzepływowy, znacznie zwiększając przepustowość badań toczenia komórek pod fizjologicznie istotnym przepływem ścinającym. Biorąc pod uwagę znaczenie zwijania komórek w wieloetapowej kaskadzie naprowadzania komórek oraz znaczenie naprowadzania komórek po ogólnoustrojowym dostarczeniu egzogennych populacji komórek u pacjentów, system ten oferuje potencjał jako platforma przesiewowa w celu ulepszenia terapii opartej na komórkach.

Systematyczna analiza walcowania komórek in vitro przy użyciu systemu mikroprzepływowego z wielodołkową płytką

Komory przepływowe używane w eksperymentach adhezyjnych zazwyczaj składają się z liniowych ścieżek przepływu i wymagają wielu eksperymentów przy różnych prędkościach przepływu, aby wygenerować mapę adhezji ścinania.  SynVivo-SMN umożliwia generowanie mapy przyczepności przy ścinaniu przy użyciu pojedynczego eksperymentu z wykorzystaniem objętości mikrolitrów, co skutkuje znaczną oszczędnością czasu i materiałów eksploatacyjnych.

Generowanie mapy przyczepności przy ścinaniu przy użyciu syntetycznych sieci mikronaczyniowych SynVivo

Nasz raport opisuje unikalną metodę wizualizacji i analizy interakcji CTC/EC w raku prostaty w warunkach fizjologicznego przepływu.

Metody in vitro Metoda obserwacji interakcji za pośrednictwem selektyny E między krążącymi komórkami nowotworowymi prostaty pochodzącymi od pacjentów a ludzkimi komórkami śródbłonka

Zdolność śródbłonka w stanie zapalnym do rekrutacji leukocytów z przepływu jest regulowana przez mezenchymalne komórki zrębu. Opisujemy dwa modele in vitro obejmujące pierwotne komórki ludzkie, które można wykorzystać do oceny rekrutacji neutrofili na podstawie przepływu i zbadania roli, jaką mezenchymalne komórki zrębu odgrywają w regulacji tego procesu.

Analiza wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów z przepływu

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Śródbłonek naczyniowy ściśle kontroluje rekrutację leukocytów. Niewystarczające wynaczynienie leukocytów przyczynia się do chorób zapalnych u ludzi. Dlatego poszukiwanie nowych elementów regulacyjnych aktywacji śródbłonka jest niezbędne do projektowania ulepszonych terapii zaburzeń zapalnych. W tym miejscu opisujemy kompleksową metodologię charakteryzującą nowe regulatory śródbłonka, które mogą modyfikować transport leukocytów podczas stanu zapalnego.

Testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Poznaj analizę toczących się leukocytów przy użyciu komory przepływowej i selektyny E. Ta metoda pozwala badać interakcje leukocytów z komórkami śródbłonka w warunkach fizjologicznego stresu ścinającego.

Analiza fizjologicznego toczkowania leukocytów zapśredniczonego przez E-selektynę na śródbłonku mikrokrążenia

Przeglądaj więcej filmów