Analiza fizjologicznego toczkowania leukocytów zapśredniczonego przez E-selektynę na śródbłonku mikrokrążenia

Niniejszy film demonstruje analizę z wykorzystaniem komory przepływowej z równoległymi płytkami w celu zbadania czynników wyzwalających toczenie leukocytów na powierzchniach komórek śródbłonka. Monowarstwy komórek śródbłonka są stymulowane prozapalną cytokiną IL-1β w celu zwiększenia ekspresji selektyny S. Następnie komora przepływowa z równoległymi płytkami jest umieszczana nad komórkami śródbłonka, a nad monowarstwę wprowadzane są leukocyty wykazujące pozytywną ekspresję selektyny S.

Oddziaływania komórkowe w komorze są zatem poddawane naprężeniom ścinającym, które są podobne do tych występujących podczas adhezji leukocytów w naczyniach zakapitarnych. Zdarzenia toczenia są rejestrowane i zliczane przy użyciu elementów NIS i testowane pod kątem niezależności od E-selektyny. Dzień dobry, nazywam się George Weis i pracuję w laboratorium dr. Charlesa de Nitro w Departamencie Dermatologii w Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.

Dzisiaj przedstawimy procedurę analizy roli selektyny E oraz ligandów selektyny E w adhezji ludzkich leukocytów do ludzkich komórek śródbłonka szpiku kostnego w fizjologicznych warunkach przepływu krwi. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać rolę cząsteczek powierzchniowych komórek, które inicjują adhezję białych krwinek lub przerzutowych komórek nowotworowych do komórek śródbłonka wyścielających wewnętrzną powierzchnię naczyń krwionośnych. Zjawisko adhezyjne to charakteryzuje się zachowaniem typu toczenia, przypominającym kulę do kręgli toczącą się po torze.

Zacznijmy zatem. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest przygotowanie komórek śródbłonka, które wyścielą komorę przepływową. W tym protokole zastosowano komórki H-B-M-E-C 60 pochodzące z ludzkiego szpiku kostnego.

Szalki do hodowli mikrokrążenia powinny zostać uprzednio pokryte fibronektyną; aby je przygotować, należy inkubować 35 ml szalek do hodowli tkanek w PBS zawierającym 20 µg/ml fibronektyny. Inkubację można prowadzić przez noc w temperaturze 4 °C lub przez trzy godziny w temperaturze 37 °C. Komórki H-B-M-E-C 60 należy zawiesić w medium 1 99 i wysiać w zagęszczeniu 10⁵ komórek na szalkę, a następnie hodować do osiągnięcia ponad 90% konfluencji.

Proces ten zajmie około dwóch dni w celu upregulacji e-selektyny i ekspresji; należy odessać medium wzrostowe i dodać świeże medium zawierające 50 ng/ml IL-1β, a następnie inkubować przez 4–6 godzin. Monowarstwy komórek są teraz gotowe do analizy w komorze przepływowej. Dodatkowe płytki z komórkami HBMEC-60 można stymulować IL-1β i traktować neutralizującym przeciwciałem anty-ludzką e-selektyną w stężeniu 20 µg/ml przez jedną godzinę w temperaturze 37°C.

Służy to jako kontrola funkcjonalnej ekspresji e selectinu. Następnie należy przygotować leukocyty wykazujące pozytywną ekspresję e selectinu. Są to komórki KG-1, ludzkie komórki progenitorowe układu krwiotwórczego.

Komórki te hoduje się w zawiesinie do uzyskania konfluencji lub do stężenia 10⁶ komórek/ml w pożywce RPMI 1640. Komórki KG-1A można pipetować bezpośrednio z hodowli i zliczać przy użyciu cytometru hematologicznego. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 10⁶ komórek/ml w buforze HBSS z 10 mM HEPES lub buforze HH zawierającym 2 mM chlorku wapnia.

Przechowywać komórki w lodzie do czasu przeprowadzenia analizy. Kolejne etapy obejmują przygotowanie mikroskopu, komory przepływowej z równoległymi płytkami oraz pompy strzykawkowej. Przed przystąpieniem do analizy należy włączyć mikroskop i pompę strzykawkową.

Wybierz obiektyw 10x w mikroskopie. Umieść 50 ml probówkę stożkowatą w uchwycie i napełnij ją buforem HH z 2 mM chlorkiem wapnia. Następnie umieść poniżej w uchwycie plastikowe probówki o pojemności 5 ml.

Następnie umieść strzykawkę 60 ml w pompie strzykawkowej. Upewnij się, że zarówno tłok, jak i korpus strzykawki są stabilnie zamocowane. Do końcówki strzykawki 60 ml podłącz kurek trójdrożny, a następnie do kurka trójdrożnego podłącz strzykawkę 5 ml.

Umieść aparat do komory przepływu równoległego na stoliku mikroskopu tak, aby rurka doprowadzająca znajdowała się po prawej stronie, rurka odprowadzająca po lewej, a rurka próżniowa z tyłu. Po podłączeniu przewodów do pompy próżniowej otwórz zawór powietrza, aby aparat z równoległymi płytkami przylgnął do stolika. Pozwoli to sprawdzić, czy uszczelka próżniowa w komorze przepływu jest szczelna.

Po potwierdzeniu szczelności zamknij zawór powietrza. Następnie podłącz linię rurki wyjściowej do kurka trójdrożnego, który jest już połączony ze strzykawką. Aparatura jest teraz gotowa do umieszczenia nad komórkami H-B-M-E-C 60.

Włącz pompę próżniową, ostrożnie opuść aparat z komorą przepływową na płytkę i poczekaj, aż zostanie on zassany. Nie powinno być słychać uciekającego powietrza; w tym momencie może być konieczne przyłożenie nacisku do komory, aby skompresować gumową uszczelkę. Po wytworzeniu próżni umieść rurkę doprowadzającą w probówce stożkowej o pojemności 50 milliliter.

Otwórz trójdrożny kran do strzykawki 60 ml i przełącz pompę w tryb pompowania, aby usunąć powietrze z przewodów bez odrywania komórek od płytki. Użyj pompy strzykawkowej ustawionej na 2 ml na minutę, aby napełnić rurkę doprowadzającą. Następnie szybko zmień ustawienie na 0,5 ml na minutę.

Tuż przed dotarciem cieczy do aparatury, kluczowe jest dokładne odpowietrzenie układu, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, które mogłyby oderwać monowarstwę od płytki. Gdy ciecz wpłynie do strzykawki 60 mil, komora przepływowa i pompa strzykawkowa zostaną odpowietrzone. Następnie należy przymocować komorę przepływową do stolika, zabezpieczając taśmą każdą z linii wlotowej, wylotowej oraz linię próżni.

Zapewnia to stałe pole widzenia podczas wizualizacji i gromadzenia danych. Komora przepływowa jest teraz gotowa do użycia. Kroki te należy powtórzyć dla każdego cyklu wprowadzania komórek oraz dla każdej nowej płytki.

Aby zarejestrować zdarzenia toczenia w miejscu Lucasa, otwórz program NIS elements na pulpicie i naciśnij ikonę odtwarzania, aby uzyskać obraz na żywo. Automatyczna ekspozycja pozwoli na zobaczenie płytki i ustawienie ostrości obrazu. Upewnij się, że mikroskop jest odpowiednio ustawiony na monowarstwę komórek, regulując ostrość ręcznie na mikroskopie.

Po ustawieniu ostrości obrazu zresetuj ekspozycję do jednej klatki na sekundę i dostosuj oświetlenie mikroskopu. Obraz powinien pojawić się na komputerze i nie być już widoczny w okularach mikroskopu. Następnie można dostosować histogram światła. Aby usunąć ekspozycję tła lub poprawić klarowność komórek, kliknij 2x2 bin lub live bin, aby uzyskać obraz idealny do rejestracji filmu.

Kliknij opcję macro na pasku menu, wybierz right to port, zaznacz port com three i kliknij open. Otwiera to port w celu synchronizacji z pompą strzykawkową. Komora przepływowa jest teraz gotowa do infuzji komórek KG1A; pipetuj 1 ml zawiesiny KG1A do probówki o pojemności 5 ml znajdującej się w pobliżu linii rurki doprowadzającej.

Następnie umieść linię wlotową na dnie probówki. W pasku menu kliknij opcję capture, a następnie time lapse acquisition. Wybierz protokół trwający 210 sekund.

Jest to długość programu do badania adhezji toczącej się na komórkach H-B-M-E-C 60. Każda faza jest zaprogramowana tak, aby wykonywać zdjęcie w każdej sekundzie przez cały czas trwania protokołu pompowania. Program jest również skonfigurowany do wysyłania polecenia przez port comm three w celu uruchomienia pompy.

Ustaw pompę strzykawkową w trybie programowania, który umożliwia ręczne zaprogramowanie określonych szybkości przepływu. Pozwoli to na określenie poziomu naprężeń ścinających w komorze i zdefiniuje interakcje komórek KG one A z komórkami H-B-M-E-C 60. Parametry dla tych interakcji wynoszą 4,2 dines per centimeter squared przez 45 seconds.

Wartość 3 dyn/cm² utrzymuje się przez 60 s, a następnie kroki zwiększają ją co 15 s do maksimum 4,2 dyn/cm². Mikroskop i komputer są teraz gotowe do rejestracji zdjęć w odstępach czasu (time lapse). Naciśnij „start run” na komputerze, aby rozpocząć pozyskiwanie danych podczas uruchamiania programu.

Należy dodać pożywkę do probówki zawierającej komórki KG one A, aby utrzymać wypełnienie przewodów wlotowych i wylotowych oraz zapobiec przedostaniu się pęcherzyków powietrza do układu. Jeśli sekwencja time lapse zostanie przerwana, pompa nie zatrzyma się automatycznie i musi zostać zresetowana. Naciśnij przycisk anuluj, aby powrócić do obrazu na żywo.

Niepobudzona monowarstwa komórek śródbłonka służy jako kontrola negatywna w tym eksperymencie. W tym celu wprowadzić leukocyty KG1A do komory przepływowej nad niepoddanymi działaniu czynników komórkami HBMEC-60, aby kontrolować niezależność od E-selektyny; następnie pobudzić monowarstwę komórek śródbłonka za pomocą IL-1β i wprowadzić leukocyty nad te komórki, aby dodatkowo kontrolować niezależność od efektu. Komórki HBMEC-60 traktować IL-1β, a następnie przeciwciałem przeciwko ludzkiej S-selektynie.

Następnie przeanalizuj zdarzenia toczenia leukocytów na tych komórkach. Toczenie komórek jest determinowane nie tylko przez selektynę S, ale także przez pozostałości kwasu sialowego na powierzchni komórki leukocyta. Aby to wykazać, poddaj komórki KG one A trawieniu neuraminidazą w stężeniu 0,1 jednostek na ml przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.

Następnie przeanalizuj zdarzenia toczenia się nad stymulowanymi komórkami H-B-M-E-C 60. Glikoproteiny na powierzchni leukocytów są również istotne dla toczenia się komórek. Można to zademonstrować, traktując komórki KG one A 0,2 units per mil bromelainą przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie wprowadzając je do komory przepływowej.

Po zarejestrowaniu sekwencji czasowej dane są gotowe do analizy. Zapisz dane, przejdź do karty pomiarów (measure) na pasku menu i wybierz zdefiniowany próg (defined threshold). Przesuń suwaki tak, aby pożądane komórki zostały zaznaczone na czerwono, zaznacz wszystkie obrazy, a następnie zatwierdź przyciskiem OK; cała sekwencja time-lapse powinna zostać teraz zmodyfikowana, ukazując widoczne czerwone, toczące się komórki.

Przejdź do sekcji pomiarów i wybierz ograniczenia. Pozwala to użytkownikowi wykluczyć obiekty przekraczające próg, które nie reprezentują toczących się komórek. Są to przede wszystkim obiekty tła utworzone przez monowarstwę H-B-M-E-C 60 w wybranym obszarze; wprowadź wartości minimalne i maksymalne, które są optymalne dla toczących się leukocytów.

Powtórz ten krok dla wydłużenia i kolistości. Wybierz opcję measure, a następnie wybierz create binary using restrictions. Te same wartości ograniczeń, które zostały ustawione w poprzednim kroku, zostaną teraz wykorzystane do optymalizacji oprogramowania NIS elements w celu rozpoznawania toczących się leukocytów na monowarstwie komórek śródbłonka. Wróć do measure, wybierz field data, a następnie wybierz reset data.

Zamknij menu, wróć do pomiaru i wybierz pole skanowania, otwórz dane pola pomiarowego, a następnie wybierz liczbę obiektów. Następnie zaznacz wszystkie pola i wyeksportuj dane do programu Microsoft Excel. Na koniec wybierz opcję wyczyść dane.

Elementy NIS są teraz gotowe do dalszego gromadzenia danych. Te reprezentatywne dane pokazują, jak interakcje między leukocytami a komórkami śródbłonka reagują na fizjologiczne naprężenie ścinające, ze szczególnym uwzględnieniem roli ligandu adhezyjnego E-selektyny.

Intensywne toczenie się leukocytów występuje, gdy komórki śródbłonka zostaną wstępnie stymulowane IL-1β. Porównując ten wynik z niepobudzoną kontrolą, widać wyraźnie, że toczenie się komórek jest zależne od stymulacji cytokinami. Poprzez potraktowanie komórek HBMEC-60 IL-1β, a następnie przeciwciałem przeciwko ludzkiej selektynie E, staje się jasne, że toczenie się komórek zależy konkretnie od selektyny E.

Ten test może być wykorzystany również do badania innych parametrów. Na przykład, gdy stymulowane komórki są wstępnie traktowane siazą lub brolinem, wyniki są mniej wyraźne. Dane te podkreślają znaczenie końcowych reszt kwasu sialowego, jak również glikoprotein powierzchniowych komórek.

W odniesieniu do aktywności ligandu selektyny S, zaprezentowaliśmy właśnie sposób analizy oddziaływań adhezyjnych opartych na selektynie E między leukocytami a komórkami śródbłonka w warunkach imitujących siły występujące w żyłce posutylarnej, czyli obszarze układu krążenia, w którym leukocyty opuszczają krew i przenikają do tkanek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zastosowaniu odpowiedniego przeciwciała blokującego lub kontroli z zastosowaniem enzymów, w celu potwierdzenia niezbędności danej selektyny i jej ligandu w tym systemie testowym. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.