$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Barwienie metodą Grama pozwala na szybką wizualizację morfologii bakterii i szerokie rozróżnienie komórek na podstawie szerokiej gamy próbek środowiskowych. Aby zabarwić bakterie, jednolity rozmaz nakłada się na szklaną stronę i pozostawia do wyschnięcia. Po utrwaleniu rozmazu na gorąco nakłada się fiolet krystaliczny.
Środek odbarwiający wypłukuje fiolet krystaliczny z komórek Gram-ujemnych, ale nie komórek Gram-dodatnich. Drugi barwnik, zwykle safranina, jest używany jako barwnik tła do wizualizacji komórek Gram-ujemnych. Po wybarwieniu komórki można ocenić pod kątem morfologii, wielkości i ułożenia komórek, takich jak łańcuchy lub klastry.
Ten film pokaże, jak przygotować próbkę środowiskową, wyizolować znajdujące się w niej gatunki bakterii i wykonać barwienie metodą Grama na izolowanych koloniach
Barwienie metodą Grama pozwala na kategoryzację większości bakterii w dwóch szerokich klasach strukturalnych: Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Chociaż obie klasy mają leżącą u podstaw fosfolipidową błonę plazmatyczną, struktura ściany komórkowej jest bardzo zróżnicowana. Ściana komórkowa Gram-dodatnia składa się przede wszystkim z grubej warstwy peptydoglikanu, który jest polimerem składającym się z cukrów i aminokwasów. Ściany komórkowe Gram-ujemne mają cieńszą warstwę peptydoglikanu, umieszczoną między drugą błoną lipidową. Ta zewnętrzna błona zazwyczaj zawiera lipopolisacharydy.
Dodatnio naładowany fiolet krystaliczny słabo wiąże się z ujemnie naładowaną ścianą komórkową bakterii. Jod Grama tworzy nierozpuszczalny kompleks z barwnikiem fioletu krystalicznego, wiążąc go w ten sposób w ścianie komórkowej.
Podczas etapu odbarwiania peptydoglikan w komórkach Gram-dodatnich ulega odwodnieniu, powodując jego kurczenie się i zatrzymywanie kompleksów krystalicznych fioletowo-jodowych. W komórkach Gram-ujemnych środek odbarwiający narusza błonę zewnętrzną, zwiększając jej porowatość. Pozwala to na wypłukanie kompleksów fioletowo-krystalicznych.
Teraz, gdy rozumiesz zasady barwienia bakterii glebowych metodą Grama, zobaczmy proces przeprowadzany na bakteriach glebowych w laboratorium.
Po pobraniu próbki gleby na polu przynieś ją do laboratorium w celu analizy. Rozdrobnić próbkę za pomocą sita i zważyć 10 g przesianej gleby za pomocą wagi analitycznej.
Rozcieńczyć próbkę w 95 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i wymieszać w celu wymieszania. Wykonać dodatkowe 1 do 10 rozcieńczeń, wirując między każdym rozcieńczeniem. Przenieść podwielokrotności co najmniej 3 kolejnych rozcieńczeń na powtórzone płytki agarozowe o niskiej zawartości składników odżywczych.
Po sterylizacji płomieniem etanolowym i schłodzeniu wygiętego pręta szklanego poprzez stukanie w podłoże, należy rozprowadzić próbkę na powierzchni płytek. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przez 3 do 5 dni wybierz najwyższe rozcieńczenie z 30 do 300 dyskretnymi koloniami. Za pomocą sterylnej pętli zaszczepiającej wybierz interesujące nas kolonie do izolacji.
Rozłóż kolonię na jednej części świeżego talerza. Sterylizując pętlę między smugami, wykonaj kolejne smugi w zygzakowaty wzór na każdej sekcji płytki, aby umożliwić późniejszą izolację dyskretnych pojedynczych kolonii. Inkubuj płytki przez 1 do 2 dni w temperaturze pokojowej.
Aby rozpocząć przygotowywanie rozmazów bakteryjnych, przymocuj klips do wstępnie oczyszczonego szkiełka podstawowego, aby ułatwić obsługę. Dla każdego rozmazu bakteryjnego oczyść i wysterylizuj płomieniowo pętlę zaszczepiającą. Umieść 2 pętle sterylnej wody destylowanej na środku szkiełka.
Po ponownym wysterylizowaniu pętli usuń niewielką ilość kultury z izolowanej kolonii i wymieszaj z wodą na szkiełku. Ważne jest, aby schłodzić pętlę przed dotknięciem kultury, kilkakrotnie stukając w niezaszczepioną porcję agaru. Rozmaz powinien przypominać rozcieńczone mleko. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Po wyschnięciu utrwal rozmaz na gorąco, szybko przepuszczając go przez płomień.
Po wyschnięciu odpipetuj krystaliczny fiolet na rozmazz i pozostaw na 2-3 minuty. Ostrożnie opłucz szkiełko wodą destylowaną, kierując bezpośredni strumień w kierunku górnej części szkiełka, pozwalając wodzie delikatnie spłynąć. Nie kieruj strumienia wody bezpośrednio na rozmaz.
Przykryj szkiełko jodem Grama. Po 2 minutach delikatnie spłucz wodą destylowaną. Odbarwij szkiełko 95% etanolem, aż plama przestanie się zmywać. Natychmiast spłucz wodą destylowaną. Ograniczy to nadmierne odbarwianie rozmazu.
Dodaj safraninę jako przeciwbarwnik do rozmazu przez 30 s. Spowoduje to zabarwienie wszystkich obecnych komórek Gram-ujemnych. Delikatnie spłucz wodą destylowaną i osusz chłonnym papierem. Obserwuj powstały szkiełko pod mikroskopem. Najpierw użyj obiektywu o małej mocy, aby dokonać zgrubnych regulacji i znajdź idealną porcję smugi, zanim przejdziesz do mniejszego pola widzenia przy większych powiększeniach.
Po dalszym obrazowaniu i dopasowaniu rozmazu za pomocą obiektywu o średniej mocy, dodaj olejek immersyjny bezpośrednio do rozmazu. Olej jest potrzebny do celów o dużej mocy, które zapewnią najlepsze mikrofotografie. Bakterie Gram-dodatnie będą miały kolor niebieski lub fioletowy, podczas gdy komórki Gram-ujemne będą czerwone lub różowe. Oprócz struktury ściany komórkowej, kształt i układ są wyjaśnione na podstawie uzyskanych mikrofotografii.
Zdolność barwienia metodą Grama do jakościowego badania bakterii jest ważna dla wielu dziedzin nauki.
Gleba jest tylko jednym ze źródeł środowiska, z którego można izolować i analizować bakterie. W przypadku wody pitnej przygotowanie próbki musi zostać zmodyfikowane. Próbki wody z kranu można pobrać z kranu i umieścić na pożywce wzrostowej, która ułatwia wzrost różnorodnych, heterotroficznych kolonii bakteryjnych. Po posiewaniu na podłożu, takim jak R2A, proces jest prawie identyczny z procedurą glebową.
W przypadku niektórych technik identyfikacji bakterii parametry są zależne od rodzaju ściany komórkowej badanych bakterii. W tym przykładzie przebadano krew pacjenta z sepsą i stwierdzono, że jest ona siedliskiem bakterii Gram-dodatnich.
Na podstawie tych informacji wybrano specyficzne dla gatunku peptydowe sondy kwasów nukleinowych, które wiązałyby się z rRNA komórek. Sondy te zostały powiązane z barwnikami fluorescencyjnymi, które zostały użyte do identyfikacji obecnych gatunków.
Ze względu na fundamentalne różnice w strukturze komórkowej Gram-dodatniej i -ujemnej, bakterie mają unikalne reakcje na inne związki poza fioletem krystalicznym. Eksperyment ten miał na celu wyizolowanie Clostridium difficile, bakterii Gram-dodatniej, z próbek kału. Cykloseryna, która hamuje wzrost komórek Gram-ujemnych, została dodana do płytki agarowej. Komórki Gram-dodatnie, które rosły na płytce, zostały następnie wyizolowane innymi metodami.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do barwienia metodą Grama w badaniach środowiskowych. Powinieneś teraz zrozumieć korzyści płynące z tego procesu oraz sposób wykonywania tej techniki i wykorzystywania wyników. Dzięki za oglądanie!
