1.10: Spektrofotometryczne wyznaczanie stałej równowagi

1. Wyznaczanie krzywej prawa Beera dla Fe(SCN)²⁺

1. Skalibrować widzialny spektrofotometr przy użyciu wody destylowanej jako ślepej próby.
2. Dodaj 1,0 ml roztworu 1,0 × 10^-4 M Fe(NO₃)₃ roztworu do probówki.
3. Do tej samej probówki dodać 5,0 ml 0,50 M roztworu KSCN.
4. Do tej samej probówki dodaj 4,0 ml 0,10 M roztworu HNO₃. Przykryj tubkę palcem w rękawiczce i delikatnie wstrząśnij, aby wymieszać.
5. Za pomocą pipety Pasteura przenieś niewielką ilość roztworu do kuwety. Upewnij się, że poziom cieczy znajduje się powyżej ścieżki wiązki światła w spektrofotometrze.
6. Umieść kuwetę w spektrofotometrze, aby światło przechodziło przez przezroczyste boki.
7. Uzyskaj widmo i zapisz wartość λ_max oraz absorbancję przy λ_max.
8. Aby skonstruować krzywą prawa Beera, należy przygotować i zmierzyć dodatkowe roztwory o znanych stężeniach Fe(SCN)²⁺. Powtórz kroki 2 – 7, używając objętości roztworów Fe(NO₃)₃, KSCN i HNO₃ w Tabela 2. Upewnij się, że używasz tej samej kuwety do wszystkich pomiarów, spłukując 3 razy wodą destylowaną pomiędzy każdą próbką.
9. Wykreślić zmierzoną absorbancję w funkcji stężeń Fe(SCN)²⁺ w każdej probówce i określić linię najlepszego dopasowania dla danych. Nachylenie tej linii to absorpcja molowa, a długość ścieżki wynosi 1 cm.

2. Pomiar K dla układu tiocyjanianu żelaza (III)

1. Przygotuj 4 probówki z pożywką zawierającą wskazane objętości roztworów 0,0025 M Fe(NO₃)₃, 0,0025 M KSCN i 0,10 M HNO₃ roztworów w Tabela 3.
2. Przykryj każdą tubkę palcem i delikatnie potrząśnij, aby wymieszać. Pozwól im stać przez co najmniej 10 minut. Ten okres spoczynku zapewnia, że roztwory są w równowadze chemicznej.
3. Za pomocą pipety Pasteura przenieś niewielką ilość roztworu 6 do kuwety. Upewnij się, że poziom cieczy znajduje się powyżej ścieżki wiązki światła w spektrofotometrze.
4. Zdobądź widmo i zapisz absorbancję przy λ_max.
5. Można badać wiele reakcji z różnymi początkowymi stężeniami reagentów, aby zilustrować, że K nie zależy od stężenia. Aby określić K dla różnych warunków początkowych, powtórz kroki 3 i 4 dla roztworów 7 – 9.

Tabela 2. Odpowiednie objętości roztworów Fe(NO₃)₃, KSCN i HNO₃ roztworów należy umieścić w probówkach 2 - 5.

Tabela 3. Odpowiednie objętości roztworów 0,0025 M Fe(NO₃)₃, 0,0025 M KSCN i 0,10 M HNO₃.

Określenie stałej równowagi reakcji chemicznej może dostarczyć ważnych informacji na temat stopnia, w jakim będzie ona tworzyć produkty w czasie.

Każda reakcja chemiczna jest związana ze stałą równowagi K, która odzwierciedla stosunek stężeń produktów i reagentów, gdy reakcja przestała postępować. Aby zmierzyć K, należy określić te stężenia.

Jeśli reakcja zawiera pojedynczy kolorowy składnik, można zmierzyć jego interakcję ze światłem, aby określić jego stężenie. Stężenia niebarwionych składników można następnie obliczyć pośrednio za pomocą zrównoważonego równania chemicznego. Ten film zilustruje użycie spektrofotometru do empirycznego wyznaczenia stałej równowagi dla reakcji tiocyjanów żelaza.

Większość reakcji chemicznych przebiega zarówno w kierunku do przodu, jak i do tyłu. W miarę postępu reakcji osiąga punkt, w którym reakcje do przodu i do tyłu zachodzą w tym samym tempie. Jest to tak zwana równowaga chemiczna. W tym stanie ustalonym stosunek stężeń produktu do stężeń reagentów, z których każdy jest podniesiony do potęgi swoich współczynników stechiometrycznych, odpowiada stałej równowagi K. Aby zmierzyć K dla systemu będącego przedmiotem zainteresowania, współczynniki powinny być znane, a stężenia muszą być określone, bezpośrednio lub pośrednio. Zgodnie z prawem Beera-Lamberta stężenie kolorowego gatunku jest proporcjonalne do jego absorbancji, czyli ilości energii, jaką pochłania przy określonej długości fali światła. Można to wyrazić matematycznie, gdzie A to absorbancja, epsilon to molowy współczynnik tłumienia, który jest specyficzny dla związku, l to długość drogi przez próbkę, a c to stężenie. Krzywa kalibracyjna jest tworzona przez testowanie wielu roztworów o znanym stężeniu i wykreślanie wynikowych wartości absorbancji. Za pomocą tej krzywej kalibracyjnej można badać roztwory o nieznanym stężeniu. Pomiary absorbancji służą do określenia stężenia gatunków barwnych. Następnie można obliczyć stężenia pozostałych reagentów i produktów. Poniższa procedura pozwoli zbadać reakcję żelaza trzy z tiocyjanianem w celu utworzenia kompleksu tiocyjanianu żelaza.

Po ustaleniu stężeń wartość K można obliczyć za pomocą tabeli równowagi początkowej zmiany (ICE), która zostanie wyjaśniona w dalszej części wyników.

Teraz, gdy rozumiesz, w jaki sposób można wykorzystać metody spektrofotometryczne do wyznaczenia stałej równowagi, jesteś gotowy do rozpoczęcia procedury.

Przed pomiarem próbki należy wygenerować krzywą kalibracyjną.

Na początek wyzeruj spektrofotometr UV-vis, używając wody destylowanej jako ślepej próby, aby wskazać brak absorbancji. Wkładając kuwetę do spektrofotometru, upewnij się, że jest ona zorientowana tak, aby światło przechodziło przez przezroczyste boki i aby poziom cieczy znajdował się powyżej ścieżki wiązki.

Następnie przygotuj 5 probówek zawierających wskazane objętości każdego roztworu reagenta, jak pokazano w protokole tekstowym, co da różne stężenia produktu. Przykryj każdą tubkę palcem w rękawiczce i delikatnie wstrząśnij, aby wymieszać. Pozostaw probówki na 10 minut.

Za pomocą pipety Pasteura przenieś niewielką ilość próbki o średnim stężeniu, roztwór 3, do kuwety i umieść ją w spektrofotometrze. Uzyskaj widmo i zapisz ?max (maksymalna długość fali), lambda max i jego absorbancja. Następnie, zaczynając od najbardziej rozcieńczonego roztworu, zmierz absorbancję wszystkich pozostałych roztworów przy μmax (lambda max). Używaj tej samej kuwety do wszystkich pomiarów, upewniając się, że płukasz 3 razy między każdą próbką. Powtórz ten proces dla rozwiązań 2 ? 5.

Wykres zmierzonej absorbancji w funkcji stężenia tiocyjanianu żelaza dla każdego roztworu. Określ linię najlepszego dopasowania dla danych. Nachylenie tej linii to molowy współczynnik tłumienia.

Teraz, po uzyskaniu danych dla roztworów wzorcowych, przygotuj cztery probówki z pożywką zawierające wskazane objętości roztworów, jak pokazano w protokole tekstowym.

Przykryj każdą tubkę palcem i delikatnie potrząśnij, aby wymieszać. Pozwól im stać przez co najmniej 10 minut. Ten okres spoczynku pozwala roztworom osiągnąć równowagę chemiczną.

Za pomocą pipety Pasteura przenieś niewielką ilość roztworu 6 do kuwety i umieść ją w spektrofotometrze. Uzyskać widmo i zapisać absorbancję zmierzoną przy z góry ustalonym ?max. Powtórz ten proces dla roztworów od 7 do 9.

Po zmierzeniu wszystkich próbek należy podać dane dotyczące molowości i absorbancji roztworów 1 ? 5 można analizować. Użyto dużego nadmiaru tiocyjanianu, aby zapewnić reakcję całego żelaza, co upraszcza analizę.

Dane są wykreślane w celu utworzenia krzywej kalibracyjnej. Długość drogi światła, l, wynosi zwykle 1 cm i można ją uwzględnić w obliczeniach. Nachylenie linii, które obliczono na 7600, jest zatem współczynnikiem tłumienia. Dla roztworów testowych 6 ? 9, ta wartość i absorbancja są wykorzystywane do obliczania stężeń tiocyjanianu żelaza w stanie równowagi. Mając te dane, można było następnie wykorzystać tabelę ICE.

Początkowe stężenia reagentów opierają się na znanych molowych wartościach żelaza i tiocyjanianów dodanych do roztworu oraz całkowitej objętości reakcji. Ponieważ produkt powstaje w wyniku reakcji 1:1 żelaza i tiocyjanianu, stężenie równowagowe każdego z nich zmniejsza się o ilość powstałego produktu. Stężenie równowagowe każdego gatunku jest obecnie znane. Wartości te służą do obliczenia stałej równowagi dla każdego roztworu. Wartości są w przybliżeniu stałe w całym zakresie badanych stężeń.

Pojęcie stałej równowagi jest ważne dla wielu dziedzin nauki. Stała równowagi może być wykorzystana do dostarczenia użytecznych informacji o stopniu, w jakim reakcja będzie tworzyć produkty w czasie. W tym przykładzie zaobserwowano dwie reakcje zawierające fiolet krystaliczny.

Pierwszy roztwór składał się z fioletu krystalicznego i wodorotlenku sodu. Zaobserwowano, że kolor szybko zmienia się z fioletowego na bezbarwny. Ta reakcja ma bardzo dużą wartość K, co wskazuje, że produkty tworzą się prawie całkowicie z czasem.

Fiołek krystaliczny poddano następnie reakcji z octanem sodu. To rozwiązanie pozostało fioletowe w nieskończoność. Ta reakcja ma bardzo niską wartość K, więc nie postępuje do przodu w znacznym stopniu.

Wreszcie stała dysocjacji ? specyficzny rodzaj stałej równowagi ? może być używany do opisu zachowania białek. W tym przykładzie monitorowano zmiany w strukturze RNA w buforach reakcyjnych magnezu.

Oczyszczone RNA zmieszano z roztworem o znanych stężeniach magnezu i pozostawiono do osiągnięcia równowagi. Następnie wykreślono otrzymaną strukturę RNA.

W tym przypadku wyższe stężenia magnezu spowodowały, że reaktywne miejsca na RNA były mniej chronione, wytwarzając Kd o połowę mniejszą.

Właśnie obejrzeliście wprowadzenie JoVE do spektrofotometrycznego wyznaczania stałej równowagi. Powinieneś teraz zrozumieć zależność zdefiniowaną przez prawo Beera-Lamberta, jak określić stężenie na podstawie absorbancji za pomocą spektrofotometru oraz jak obliczyć stałą równowagi za pomocą stężeń równowagowych.

Dzięki za oglądanie!