Analiza krzywej wzrostu bakterii i jej zastosowania środowiskowe

Pomiar tempa wzrostu bakterii jest podstawową techniką mikrobiologiczną i ma szerokie zastosowanie w badaniach podstawowych, a także w zastosowaniach rolniczych i przemysłowych.

Bakterie są jednymi z najliczniejszych form życia na Ziemi, są obecne w każdym ekosystemie, w tym w ludzkim ciele. Niektóre gatunki bakterii są również genetycznie wysoce podatne na manipulacje i zostały wykorzystane jako modele badawcze lub do produkcji produktów naturalnych lub syntetycznych na skalę przemysłową. Jednak nie wszystkie gatunki bakterii można hodować w laboratorium. Dla tych, którzy mogą, ważną cechą jest tempo rozmnażania, czyli "kinetyka wzrostu".

Pomiar tempa wzrostu kultur bakteryjnych może dostarczyć naukowcom informacji na temat ich funkcji fizjologicznych i metabolicznych, a także jest przydatny do uzyskania dokładnej liczby komórek bakterii do dalszych zastosowań.

W tym filmie przedstawimy zasady analizy szybkości wzrostu bakterii, zademonstrujemy protokół charakteryzowania tempa wzrostu za pomocą "krzywej wzrostu", a na koniec zbadamy kilka zastosowań nauk o środowisku do pomiaru kinetyki wzrostu bakterii.

Bakterie na ogół rozmnażają się bezpłciowo, rozmnażając się przez proste rozszczepienie binarne, w którym jedna komórka rodzicielska dzieli się na dwie identyczne komórki potomne. W sprzyjających warunkach wzrostu, w których składniki odżywcze są dostępne w obfitości, a parametry środowiskowe, takie jak temperatura, sprzyjają wzrostowi, tempo rozmnażania znacznie przewyższa tempo umierania. Powoduje to wykładniczy wzrost.

Mierząc ilość bakterii w kulturze w funkcji czasu, można uzyskać krzywą wzrostu. Hodowla bakterii w płynnej kulturze w optymalnych warunkach wytwarza krzywą wzrostu o charakterystycznym kształcie, którą można podzielić na różne fazy. Krzywa rozpoczyna się od "fazy opóźnienia", kiedy wzrost jest powolny, podczas gdy bakterie aklimatyzują się do warunków hodowli. Następna jest "logarytm" lub "faza wykładnicza", kiedy bakterie doświadczają wykładniczego wzrostu. Wzrost ostatecznie zatrzymuje się, gdy składniki odżywcze ulegną wyczerpaniu, a produkty przemiany materii nagromadzą się, co powoduje "fazę stacjonarną". Wreszcie, gdy tempo namnażania zostanie wyprzedzone przez tempo śmierci komórki, kultura wchodzi w "fazę śmierci".

Aby skonstruować krzywą wzrostu, liczba bakterii w kolbie z płynną kulturą jest liczona w różnych punktach czasowych w określonym okresie hodowli. Liczbę bakterii można uzyskać wieloma różnymi metodami. Jednym z powszechnych podejść jest pomiar gęstości optycznej - lub "OD" - 600, czyli absorbancji światła przez roztwór bakteryjny o długości fali 600 nm.

Inną metodą jest określenie "CFU", czyli jednostek tworzących kolonię, na mililitr kultury. Ze względu na klonalny charakter wzrostu bakterii, jedna bakteria w kulturze może teoretycznie rozwinąć się w jedną obserwowalną kolonię na płytce agarowej. Poprzez posiew serii rozcieńczeń kultury bakteryjnej w celu osiągnięcia stężenia bakterii, w którym można zaobserwować pojedyncze, dyskretne kolonie, metoda zwana "posiewem z seryjnym rozcieńczeniem", liczbę kolonii można wykorzystać do wstecznego obliczenia stężenia bakterii w postaci jtk na ml.

Teraz, gdy już wiesz, w jaki sposób można analizować wzrost bakterii, przejdźmy do protokołu przeprowadzania analizy krzywej wzrostu na czystych kulturach dobrze znanego modelu bakteryjnego, Escherichia coli, przy użyciu metody posiewu z rozcieńczeniem szeregowym.

Na dzień przed pobraniem punktu czasowego zaszczepij 20 ml wstępnie wysterylizowanego bulionu sojowego z tryptykazy lub TSB w kolbie o pojemności 50 ml pojedynczą kolonią E. coli.

Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 37 ? C z potrząsaniem. W przypadku E. coli skutkowałoby to populacją w fazie stacjonarnej wynoszącą około 109 jtk/ml.

Następnego dnia zaszczepić 100 ? L nocnej hodowli do 250 ml TSB w kolbie o pojemności 500 ml. Dokładnie wymieszaj. W ten sposób powstaje rozcieńczona kultura o wymiarach około 4 x 105 jtk/ml. Przechowywać 5 ml tej rozcieńczonej kultury w probówce hodowlanej. Jest to podwielokrotność od punktu czasowego 0 lub T0. Przechowywać w lodówce natychmiast w temperaturze 4 °C.

Inkubować pozostałą objętość kultury w temperaturze 37 ? C z potrząsaniem. Następnie co godzinę, przez maksymalnie 8 godzin, zbierać 5 ml porcji z kultury. Oznacz te próbki od T1 do T8 i przechowuj je wszystkie w temperaturze 4 ? C do momentu użycia.

W dniu eksperymentu wyjmij z lodówki podwielokrotności punktu czasowego E. coli i trzymaj je na lodzie. Używaj sterylnych probówek do mikrofugowania, każda o pojemności 900 ? L sterylnego roztworu soli fizjologicznej, w celu ustalenia serii rozcieńczeń dla każdej podwielokrotności zgodnie z poniższą tabelą.

Dobrze wymieszaj kulturę T0, delikatnie wirując, a następnie dodaj 100 ? L do probówki A z serii rozcieńczeń, co daje rozcieńczenie 1:10 lub 10-1. Rurkę Vortex A wymieszać i za pomocą świeżej końcówki pipety dodać 100 ? L z probówki A do probówki B, co daje rozcieńczenie 1 do 100 lub 10-2.

Powtórzyć proces dla każdej podwielokrotności kultury i wykonać odpowiednią serię rozcieńczeń zgodnie z tabelą 2. Po wykonaniu serii rozcieńczeń dla wszystkich próbek w punkcie czasowym, należy przygotować odpowiednią liczbę sterylnych płytek agarowych sojowych z tryptykazą do posiewu bakteryjnego.

3 rozcieńczenia każdej kultury punktu czasowego zostaną posiane w trzech egzemplarzach zgodnie z poniższą tabelą. Oznacz odpowiednio talerze. Następnie, pipeta 100 ? L każdej odpowiednio rozcieńczonej kultury na środek odpowiedniej płytki agarowej. Wysterylizuj płomieniowo szklany pręt w kształcie litery "L", ostudź dotykając pałeczki do agaru z dala od inokulum i natychmiast rozprowadź płyn na powierzchni agaru. Należy pamiętać, że opóźnienie w rozprzestrzenianiu się może spowodować przerost bakterii w miejscu szczepienia.

Kontynuuj powlekanie każdej serii rozcieńczeń dla wszystkich 9 kultur w punktach czasowych, sterylizując płomieniowo pręt do rozprowadzania szkła między każdą serią rozcieńczeń.

Po pozostawieniu płytek do wyschnięcia na kilka minut, odwróć je i umieść w 37 ? C inkubator na noc. Po tym okresie wzrostu płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C.

Po całonocnej inkubacji płytek rozcieńczających należy je zbadać pod kątem zanieczyszczenia i jednorodności kolonii. Dla każdej kultury punktu czasowego wybierz rozcieńczenie, dla którego na płytkę przypada od 30 do 300 kolonii. Policz liczbę kolonii na każdej z potrójnych płytek dla tego rozcieńczenia.

Korzystając ze średniej liczby kolonii dla każdego rozcieńczenia i współczynnika rozcieńczenia, obliczyć stężenie bakterii w oryginalnej kulturze w każdym punkcie czasowym w jtk/ml. Na przykład, jeśli z zestawu potrójnych płytek otrzymanych z 0,1 ml rozcieńczenia 10-4 lub 1 do 10 000 znajduje się średnio 30 kolonii, to będzie 30 podzielone przez 0,1 ml pomnożone przez 10 000, czyli 3 miliony CFU/ml.

Korzystając ze stężenia bakterii obliczonego dla każdego punktu czasowego, narysuj wykres logarytmu o podstawie 10 stężeń bakterii, w jtk/ml, w funkcji czasu w godzinach. Na wykresie zidentyfikuj logarytmiczną fazę wzrostu pierwotnej kultury bakteryjnej i wybierz dwa punkty czasowe w fazie logarytmicznej, wyznaczając pierwszy z tych punktów czasowych jako t = 0. Oblicz średni czas generacji za pomocą równania X równa się 2 do potęgi n pomnożonej przez X0, gdzie X to stężenie bakterii w czasie t, X0 to początkowe stężenie przy t = 0, a n to liczba pokoleń, które upłynęły między tymi dwoma punktami czasowymi.

Załóżmy na przykład, że X0 wynosi 1 000 CFU/ml, a przy t = 6 h stężenie wynosi 16 000 CFU/ml. Korzystając z równania, otrzymujemy, że w ciągu 6 godzin wystąpiły 4 pokolenia, co daje czas generacji równy 6 podzielony przez 4 lub 1,5 godziny na pokolenie.

Pomiar kinetyki wzrostu bakterii ma fundamentalne znaczenie dla wielu zastosowań w badaniach, rolnictwie lub bioinżynierii.

Jednym z zastosowań poznania tempa wzrostu bakterii jest umożliwienie uzyskania dokładnej ilości kultury bakteryjnej w celu zaszczepienia innej kultury lub pożywki. Na przykład niektóre rośliny, takie jak rośliny strączkowe, muszą być uprawiane z symbiotycznymi bakteriami znanymi jako rhizobia, które kolonizują korzenie roślin, tworząc guzki i "wiążąc" azot - przekształcając azot atmosferyczny w amoniak, który może być wykorzystany przez roślinę. W zastosowaniach rolniczych znana ilość ryzobii jest dodawana do podłoża węglowego na bazie torfu, które jest następnie wykorzystywane do zaszczepiania nasion roślin strączkowych w celu ustanowienia symbiozy roślinno-bakteryjnej.

Analiza wzrostu może być również wykorzystana do identyfikacji gatunków bakterii, które mogą rozkładać odpady przemysłowe i ewentualnie wytwarzać cenne produkty uboczne. W tym przykładzie naukowcy zbadali, w jaki sposób pożywki wzrostowe uzupełnione ługiem czarnym, produktem odpadowym z roztwarzania drewna i produkcji papieru, wpływają na wzrost środowiskowego izolatu mikrobiologicznego.

Bakterie nie tylko wykazały zwiększony wzrost z ługiem czarnym, ale także wykazały "dyfazyjny" wzorzec wzrostu, wskazujący na obecność więcej niż jednego źródła węgla w ługu czarnym, które bakterie mogą metabolizować. Poszczególne składniki ługu czarnego można następnie wyekstrahować w celu przeprowadzenia bardziej szczegółowej analizy wzrostu.

Wreszcie, pomiary szybkości wzrostu są również przydatne do charakteryzowania bakterii, które zostały zaprojektowane do określonych celów przemysłowych, na przykład do remediacji zanieczyszczeń olejowych. Naukowcy stworzyli genetycznie zmodyfikowane szczepy bakterii, które zawierają enzymy rozkładające węglowodorowe składniki ropy. Przeprowadzono analizę wzrostu, na przykład, w celu sprawdzenia, czy zmodyfikowane bakterie mają szybsze tempo wzrostu niż normalne bakterie w obecności toksycznych węglowodorów, co wskazuje na lepszą tolerancję, która pozwoli zmodyfikowanym bakteriom wykonywać funkcję usuwania zanieczyszczeń.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat analizy tempa wzrostu bakterii za pomocą krzywych wzrostu. Powinieneś teraz zrozumieć różne fazy wzrostu kultur bakteryjnych, jak przeprowadzić eksperyment w celu uzyskania krzywej wzrostu przy użyciu zbierania punktów czasowych i seryjnego rozcieńczania oraz jak można zastosować analizę wzrostu do celów badawczych i przemysłowych. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!