2.14: Analiza krzywej wzrostu bakterii i jej zastosowania środowiskowe

1. Zbiór podwielokrotności kultur bakteryjnych

1. Na dzień przed zebraniem punktów czasowych wzrostu zaszczepić 20 ml pożywki bulionu sojowego z tryptykazą (TSB) w kolbie o pojemności 50 ml E. coli.
2. Inkubować przez noc w temperaturze 27 °C. Ten stosunkowo długi okres inkubacji powoduje, że populacja dzikiego typu E. coli wynosi około 10⁹ CFU/ml.
3. Następnego dnia użyj 100 μl przygotowanej kultury do zaszczepienia 250 ml TSB (w kolbie o pojemności 500 ml). Dokładnie wymieszaj. Wyjąć 5 ml porcji i natychmiast wstawić do lodówki w temperaturze 4 °C. Jest to punkt czasowy T = 0 lub T₀ i powinien zawierać około 4 x 10⁵ CFU/ml.
4. Umieścić kolbę z pozostałymi E. coli (245 ml) w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C. Usuwać 5 ml porcji kultury co godzinę, do 8 godzin. Przechowywać każdą podwielokrotność w temperaturze 4 °C. Oznaczyć te podwielokrotności T₁ do T₈.

2. Seryjne rozcieńczanie

1. Wyjmij podwielokrotności E. coli z lodówki i umieść na lodzie do transportu. Trzymaj wszystkie kultury na lodzie do czasu użycia.
2. Ustaw serię probówek rozcieńczających, aby uzyskać różne rozcieńczenia każdej kultury E. coli (Rysunek 3). Rurki do mikrofuge są wygodne do tej funkcji. Każda probówka do rozcieńczania powinna zawierać 900 μl płynu rozcieńczającego (jałowego roztworu soli fizjologicznej). Seria rozcieńczeń jest potrzebna dla każdej kultury E. coli (T₀ do T₈); Oznacz każdą rurkę zgodnie z Tabela 2.
   
   Rysunek 3. Schemat przedstawiający procedurę posiewu E. coli.
3. Rozcieńczanie należy rozpocząć od dodania 100 μl E. coli z probówki oznaczonej T₀ (początkowa hodowla E. coli) do probówki A, która jest 10^-1 rozcieńczeniem T₀. Wiruj rurkę przez 5 s.
4. Następnie dodaj 100 μl probówki A do następnej probówki z solą fizjologiczną, probówki B, która jest 10^-2 rozcieńczeniem T₀. Kontynuować wymaganą serię rozcieńczeń dla każdej podwielokrotności punktu czasowego. Pamiętaj, aby wywirować każdą rurkę przed przeniesieniem. Ważne jest również, aby przy każdym transferze używać nowej końcówki do pipety.

Tabela 2. Seria rozcieńczeń wymagana dla każdej kultury E. coli.

3. Poszycie

1. Trzy rozcieńczenia dla każdej podwielokrotności punktu czasowego E. coli kultura zostaną podane, zgodnie z Tabela 3. Oznacz tabliczki punktem czasowym (T₁ do T₈), współczynnikiem rozcieńczenia i objętością, która ma zostać dodana. Do każdego rozcieńczenia należy użyć trzech płytek.
2. Dodać 100 μl każdego rozcieńczenia do płytki, pipetując ilość do środka płytki agarowej (Rysunek 3). Natychmiast rozprowadź porcję, używając sterylizowanego płomieniowo szklanego pręta w kształcie litery "L". Jeśli podwielokrotność nie zostanie natychmiast rozprzestrzeniona, sorbuje in situ na płytce, powodując przerost bakterii w miejscu początkowej inokulacji.
3. Powtórzyć powlekanie dla każdej serii rozcieńczeń dla punktów czasowych T₁ do T₈. Pamiętaj, aby sterylizować pręt między płytkami, a zwłaszcza między różnymi rozcieńczeniami.
4. Po wyschnięciu płytek przez kilka minut, odwrócić je i umieścić na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Odwrócenie płytek zapobiega spadaniu kondensatu na płytkę agarową. Po całonocnej inkubacji płytki należy przechowywać w lodówce.

^*Niższe rozcieńczenia uwzględniają niższe populacje z powodu fazy śmierci.

Tabela 3. Protokół posiewu dla kultur E. coli.

4. Liczenie rodzin i obliczanie średniego czasu generacji

1. Zbadaj płytki pod kątem jednorodności kolonii i braku zanieczyszczeń.
2. Dla każdego punktu czasowego (T₀ do T₈) wybierz jedno rozcieńczenie, które zawiera od 30 do 300 kolonii i policz potrójne płytki.
3. Korzystając ze współczynnika rozcieńczenia, przelicz wstecznie liczbę komórek na ml oryginalnej kultury w punktach czasowych od T₀ do T₈. Na przykład, jeśli liczba kolonii wynikająca z rozcieńczenia 10^-4 wynosi 30, 28 i 32:
   Średnia liczba kolonii = 30 kolonii
   Powstały one z 0,1 ml rozcieńczenia 10^-4
   Liczba kolonii na ml = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. Wykres log₁₀ CFU/ml w funkcji czasu (w godzinach).
5. Na wykresie zidentyfikuj wykładniczą fazę wzrostu. Używając 2 punktów czasowych w fazie wzrostu wykładniczego i odpowiadających im numerów komórek za każdym razem, oblicz średni czas wytwarzania.

Pomiar tempa wzrostu bakterii jest podstawową techniką mikrobiologiczną i ma szerokie zastosowanie w badaniach podstawowych, a także w zastosowaniach rolniczych i przemysłowych.

Bakterie są jednymi z najliczniejszych form życia na Ziemi, są obecne w każdym ekosystemie, w tym w ludzkim ciele. Niektóre gatunki bakterii są również genetycznie wysoce podatne na manipulacje i zostały wykorzystane jako modele badawcze lub do produkcji produktów naturalnych lub syntetycznych na skalę przemysłową. Jednak nie wszystkie gatunki bakterii można hodować w laboratorium. Dla tych, którzy mogą, ważną cechą jest tempo rozmnażania, czyli "kinetyka wzrostu".

Pomiar tempa wzrostu kultur bakteryjnych może dostarczyć naukowcom informacji na temat ich funkcji fizjologicznych i metabolicznych, a także jest przydatny do uzyskania dokładnej liczby komórek bakterii do dalszych zastosowań.

W tym filmie przedstawimy zasady analizy szybkości wzrostu bakterii, zademonstrujemy protokół charakteryzowania tempa wzrostu za pomocą "krzywej wzrostu", a na koniec zbadamy kilka zastosowań nauk o środowisku do pomiaru kinetyki wzrostu bakterii.

Bakterie na ogół rozmnażają się bezpłciowo, rozmnażając się przez proste rozszczepienie binarne, w którym jedna komórka rodzicielska dzieli się na dwie identyczne komórki potomne. W sprzyjających warunkach wzrostu, w których składniki odżywcze są dostępne w obfitości, a parametry środowiskowe, takie jak temperatura, sprzyjają wzrostowi, tempo rozmnażania znacznie przewyższa tempo umierania. Powoduje to wykładniczy wzrost.

Mierząc ilość bakterii w kulturze w funkcji czasu, można uzyskać krzywą wzrostu. Hodowla bakterii w płynnej kulturze w optymalnych warunkach wytwarza krzywą wzrostu o charakterystycznym kształcie, którą można podzielić na różne fazy. Krzywa rozpoczyna się od "fazy opóźnienia", kiedy wzrost jest powolny, podczas gdy bakterie aklimatyzują się do warunków hodowli. Następna jest "logarytm" lub "faza wykładnicza", kiedy bakterie doświadczają wykładniczego wzrostu. Wzrost ostatecznie zatrzymuje się, gdy składniki odżywcze ulegną wyczerpaniu, a produkty przemiany materii nagromadzą się, co powoduje "fazę stacjonarną". Wreszcie, gdy tempo namnażania zostanie wyprzedzone przez tempo śmierci komórki, kultura wchodzi w "fazę śmierci".

Aby skonstruować krzywą wzrostu, liczba bakterii w kolbie z płynną kulturą jest liczona w różnych punktach czasowych w określonym okresie hodowli. Liczbę bakterii można uzyskać wieloma różnymi metodami. Jednym z powszechnych podejść jest pomiar gęstości optycznej - lub "OD" - 600, czyli absorbancji światła przez roztwór bakteryjny o długości fali 600 nm.

Inną metodą jest określenie "CFU", czyli jednostek tworzących kolonię, na mililitr kultury. Ze względu na klonalny charakter wzrostu bakterii, jedna bakteria w kulturze może teoretycznie rozwinąć się w jedną obserwowalną kolonię na płytce agarowej. Poprzez posiew serii rozcieńczeń kultury bakteryjnej w celu osiągnięcia stężenia bakterii, w którym można zaobserwować pojedyncze, dyskretne kolonie, metoda zwana "posiewem z seryjnym rozcieńczeniem", liczbę kolonii można wykorzystać do wstecznego obliczenia stężenia bakterii w postaci jtk na ml.

Teraz, gdy już wiesz, w jaki sposób można analizować wzrost bakterii, przejdźmy do protokołu przeprowadzania analizy krzywej wzrostu na czystych kulturach dobrze znanego modelu bakteryjnego, Escherichia coli, przy użyciu metody posiewu z rozcieńczeniem szeregowym.

Na dzień przed pobraniem punktu czasowego zaszczepij 20 ml wstępnie wysterylizowanego bulionu sojowego z tryptykazy lub TSB w kolbie o pojemności 50 ml pojedynczą kolonią E. coli.

Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 37 ? C z potrząsaniem. W przypadku E. coli skutkowałoby to populacją w fazie stacjonarnej wynoszącą około 109 jtk/ml.

Następnego dnia zaszczepić 100 ? L nocnej hodowli do 250 ml TSB w kolbie o pojemności 500 ml. Dokładnie wymieszaj. W ten sposób powstaje rozcieńczona kultura o wymiarach około 4 x 105 jtk/ml. Przechowywać 5 ml tej rozcieńczonej kultury w probówce hodowlanej. Jest to podwielokrotność od punktu czasowego 0 lub T0. Przechowywać w lodówce natychmiast w temperaturze 4 °C.

Inkubować pozostałą objętość kultury w temperaturze 37 ? C z potrząsaniem. Następnie co godzinę, przez maksymalnie 8 godzin, zbierać 5 ml porcji z kultury. Oznacz te próbki od T1 do T8 i przechowuj je wszystkie w temperaturze 4 ? C do momentu użycia.

W dniu eksperymentu wyjmij z lodówki podwielokrotności punktu czasowego E. coli i trzymaj je na lodzie. Używaj sterylnych probówek do mikrofugowania, każda o pojemności 900 ? L sterylnego roztworu soli fizjologicznej, w celu ustalenia serii rozcieńczeń dla każdej podwielokrotności zgodnie z poniższą tabelą.

Dobrze wymieszaj kulturę T0, delikatnie wirując, a następnie dodaj 100 ? L do probówki A z serii rozcieńczeń, co daje rozcieńczenie 1:10 lub 10-1. Rurkę Vortex A wymieszać i za pomocą świeżej końcówki pipety dodać 100 ? L z probówki A do probówki B, co daje rozcieńczenie 1 do 100 lub 10-2.

Powtórzyć proces dla każdej podwielokrotności kultury i wykonać odpowiednią serię rozcieńczeń zgodnie z tabelą 2. Po wykonaniu serii rozcieńczeń dla wszystkich próbek w punkcie czasowym, należy przygotować odpowiednią liczbę sterylnych płytek agarowych sojowych z tryptykazą do posiewu bakteryjnego.

3 rozcieńczenia każdej kultury punktu czasowego zostaną posiane w trzech egzemplarzach zgodnie z poniższą tabelą. Oznacz odpowiednio talerze. Następnie, pipeta 100 ? L każdej odpowiednio rozcieńczonej kultury na środek odpowiedniej płytki agarowej. Wysterylizuj płomieniowo szklany pręt w kształcie litery "L", ostudź dotykając pałeczki do agaru z dala od inokulum i natychmiast rozprowadź płyn na powierzchni agaru. Należy pamiętać, że opóźnienie w rozprzestrzenianiu się może spowodować przerost bakterii w miejscu szczepienia.

Kontynuuj powlekanie każdej serii rozcieńczeń dla wszystkich 9 kultur w punktach czasowych, sterylizując płomieniowo pręt do rozprowadzania szkła między każdą serią rozcieńczeń.

Po pozostawieniu płytek do wyschnięcia na kilka minut, odwróć je i umieść w 37 ? C inkubator na noc. Po tym okresie wzrostu płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C.

Po całonocnej inkubacji płytek rozcieńczających należy je zbadać pod kątem zanieczyszczenia i jednorodności kolonii. Dla każdej kultury punktu czasowego wybierz rozcieńczenie, dla którego na płytkę przypada od 30 do 300 kolonii. Policz liczbę kolonii na każdej z potrójnych płytek dla tego rozcieńczenia.

Korzystając ze średniej liczby kolonii dla każdego rozcieńczenia i współczynnika rozcieńczenia, obliczyć stężenie bakterii w oryginalnej kulturze w każdym punkcie czasowym w jtk/ml. Na przykład, jeśli z zestawu potrójnych płytek otrzymanych z 0,1 ml rozcieńczenia 10-4 lub 1 do 10 000 znajduje się średnio 30 kolonii, to będzie 30 podzielone przez 0,1 ml pomnożone przez 10 000, czyli 3 miliony CFU/ml.

Korzystając ze stężenia bakterii obliczonego dla każdego punktu czasowego, narysuj wykres logarytmu o podstawie 10 stężeń bakterii, w jtk/ml, w funkcji czasu w godzinach. Na wykresie zidentyfikuj logarytmiczną fazę wzrostu pierwotnej kultury bakteryjnej i wybierz dwa punkty czasowe w fazie logarytmicznej, wyznaczając pierwszy z tych punktów czasowych jako t = 0. Oblicz średni czas generacji za pomocą równania X równa się 2 do potęgi n pomnożonej przez X0, gdzie X to stężenie bakterii w czasie t, X0 to początkowe stężenie przy t = 0, a n to liczba pokoleń, które upłynęły między tymi dwoma punktami czasowymi.

Załóżmy na przykład, że X0 wynosi 1 000 CFU/ml, a przy t = 6 h stężenie wynosi 16 000 CFU/ml. Korzystając z równania, otrzymujemy, że w ciągu 6 godzin wystąpiły 4 pokolenia, co daje czas generacji równy 6 podzielony przez 4 lub 1,5 godziny na pokolenie.

Pomiar kinetyki wzrostu bakterii ma fundamentalne znaczenie dla wielu zastosowań w badaniach, rolnictwie lub bioinżynierii.

Jednym z zastosowań poznania tempa wzrostu bakterii jest umożliwienie uzyskania dokładnej ilości kultury bakteryjnej w celu zaszczepienia innej kultury lub pożywki. Na przykład niektóre rośliny, takie jak rośliny strączkowe, muszą być uprawiane z symbiotycznymi bakteriami znanymi jako rhizobia, które kolonizują korzenie roślin, tworząc guzki i "wiążąc" azot - przekształcając azot atmosferyczny w amoniak, który może być wykorzystany przez roślinę. W zastosowaniach rolniczych znana ilość ryzobii jest dodawana do podłoża węglowego na bazie torfu, które jest następnie wykorzystywane do zaszczepiania nasion roślin strączkowych w celu ustanowienia symbiozy roślinno-bakteryjnej.

Analiza wzrostu może być również wykorzystana do identyfikacji gatunków bakterii, które mogą rozkładać odpady przemysłowe i ewentualnie wytwarzać cenne produkty uboczne. W tym przykładzie naukowcy zbadali, w jaki sposób pożywki wzrostowe uzupełnione ługiem czarnym, produktem odpadowym z roztwarzania drewna i produkcji papieru, wpływają na wzrost środowiskowego izolatu mikrobiologicznego.

Bakterie nie tylko wykazały zwiększony wzrost z ługiem czarnym, ale także wykazały "dyfazyjny" wzorzec wzrostu, wskazujący na obecność więcej niż jednego źródła węgla w ługu czarnym, które bakterie mogą metabolizować. Poszczególne składniki ługu czarnego można następnie wyekstrahować w celu przeprowadzenia bardziej szczegółowej analizy wzrostu.

Wreszcie, pomiary szybkości wzrostu są również przydatne do charakteryzowania bakterii, które zostały zaprojektowane do określonych celów przemysłowych, na przykład do remediacji zanieczyszczeń olejowych. Naukowcy stworzyli genetycznie zmodyfikowane szczepy bakterii, które zawierają enzymy rozkładające węglowodorowe składniki ropy. Przeprowadzono analizę wzrostu, na przykład, w celu sprawdzenia, czy zmodyfikowane bakterie mają szybsze tempo wzrostu niż normalne bakterie w obecności toksycznych węglowodorów, co wskazuje na lepszą tolerancję, która pozwoli zmodyfikowanym bakteriom wykonywać funkcję usuwania zanieczyszczeń.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat analizy tempa wzrostu bakterii za pomocą krzywych wzrostu. Powinieneś teraz zrozumieć różne fazy wzrostu kultur bakteryjnych, jak przeprowadzić eksperyment w celu uzyskania krzywej wzrostu przy użyciu zbierania punktów czasowych i seryjnego rozcieńczania oraz jak można zastosować analizę wzrostu do celów badawczych i przemysłowych. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!