Analiza krzywej wzrostu bakterii i jej zastosowania środowiskowe

1. Zbiór podwielokrotności kultur bakteryjnych

1. Na dzień przed zebraniem punktów czasowych wzrostu zaszczepić 20 ml pożywki bulionu sojowego z tryptykazą (TSB) w kolbie o pojemności 50 ml E. coli.
2. Inkubować przez noc w temperaturze 27 °C. Ten stosunkowo długi okres inkubacji powoduje, że populacja dzikiego typu E. coli wynosi około 10⁹ CFU/ml.
3. Następnego dnia użyj 100 μl przygotowanej kultury do zaszczepienia 250 ml TSB (w kolbie o pojemności 500 ml). Dokładnie wymieszaj. Wyjąć 5 ml porcji i natychmiast wstawić do lodówki w temperaturze 4 °C. Jest to punkt czasowy T = 0 lub T₀ i powinien zawierać około 4 x 10⁵ CFU/ml.
4. Umieścić kolbę z pozostałymi E. coli (245 ml) w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C. Usuwać 5 ml porcji kultury co godzinę, do 8 godzin. Przechowywać każdą podwielokrotność w temperaturze 4 °C. Oznaczyć te podwielokrotności T₁ do T₈.

2. Seryjne rozcieńczanie

1. Wyjmij podwielokrotności E. coli z lodówki i umieść na lodzie do transportu. Trzymaj wszystkie kultury na lodzie do czasu użycia.
2. Ustaw serię probówek rozcieńczających, aby uzyskać różne rozcieńczenia każdej kultury E. coli (Rysunek 3). Rurki do mikrofuge są wygodne do tej funkcji. Każda probówka do rozcieńczania powinna zawierać 900 μl płynu rozcieńczającego (jałowego roztworu soli fizjologicznej). Seria rozcieńczeń jest potrzebna dla każdej kultury E. coli (T₀ do T₈); Oznacz każdą rurkę zgodnie z Tabela 2.
   
   Rysunek 3. Schemat przedstawiający procedurę posiewu E. coli.
3. Rozcieńczanie należy rozpocząć od dodania 100 μl E. coli z probówki oznaczonej T₀ (początkowa hodowla E. coli) do probówki A, która jest 10^-1 rozcieńczeniem T₀. Wiruj rurkę przez 5 s.
4. Następnie dodaj 100 μl probówki A do następnej probówki z solą fizjologiczną, probówki B, która jest 10^-2 rozcieńczeniem T₀. Kontynuować wymaganą serię rozcieńczeń dla każdej podwielokrotności punktu czasowego. Pamiętaj, aby wywirować każdą rurkę przed przeniesieniem. Ważne jest również, aby przy każdym transferze używać nowej końcówki do pipety.

E. coli kultura	Potrzebne rozcieńczenia i rurka #
	A	B	C	D	E	F	G
T0	10-1	10-2
T1	10-1	10-2
T2	10-1	10-2	10-3
T3	10-1	10-2	10-3	10-4
T4	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
T5	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T6	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
T7	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T8	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6

Tabela 2. Seria rozcieńczeń wymagana dla każdej kultury E. coli.

3. Poszycie

1. Trzy rozcieńczenia dla każdej podwielokrotności punktu czasowego E. coli kultura zostaną podane, zgodnie z Tabela 3. Oznacz tabliczki punktem czasowym (T₁ do T₈), współczynnikiem rozcieńczenia i objętością, która ma zostać dodana. Do każdego rozcieńczenia należy użyć trzech płytek.
2. Dodać 100 μl każdego rozcieńczenia do płytki, pipetując ilość do środka płytki agarowej (Rysunek 3). Natychmiast rozprowadź porcję, używając sterylizowanego płomieniowo szklanego pręta w kształcie litery "L". Jeśli podwielokrotność nie zostanie natychmiast rozprzestrzeniona, sorbuje in situ na płytce, powodując przerost bakterii w miejscu początkowej inokulacji.
3. Powtórzyć powlekanie dla każdej serii rozcieńczeń dla punktów czasowych T₁ do T₈. Pamiętaj, aby sterylizować pręt między płytkami, a zwłaszcza między różnymi rozcieńczeniami.
4. Po wyschnięciu płytek przez kilka minut, odwrócić je i umieścić na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Odwrócenie płytek zapobiega spadaniu kondensatu na płytkę agarową. Po całonocnej inkubacji płytki należy przechowywać w lodówce.

E.coli kultura	Rozcieńczenia do platerowania
T0	10-1	10-2	10-3
T1	10-1	10-2	10-3
T2	10-2	10-3	10-4
T3	10-3	10-4	10-5
T4	10-4	10-5	10-6
T5	10-5	10-6	10-7
T6	10-6	10-7	10-8
T7*	10-5	10-6	10-7
T8*	10-4	10-5	10-6

^*Niższe rozcieńczenia uwzględniają niższe populacje z powodu fazy śmierci.

Tabela 3. Protokół posiewu dla kultur E. coli.

4. Liczenie rodzin i obliczanie średniego czasu generacji

1. Zbadaj płytki pod kątem jednorodności kolonii i braku zanieczyszczeń.
2. Dla każdego punktu czasowego (T₀ do T₈) wybierz jedno rozcieńczenie, które zawiera od 30 do 300 kolonii i policz potrójne płytki.
3. Korzystając ze współczynnika rozcieńczenia, przelicz wstecznie liczbę komórek na ml oryginalnej kultury w punktach czasowych od T₀ do T₈. Na przykład, jeśli liczba kolonii wynikająca z rozcieńczenia 10^-4 wynosi 30, 28 i 32:
   Średnia liczba kolonii = 30 kolonii
   Powstały one z 0,1 ml rozcieńczenia 10^-4
   Liczba kolonii na ml = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. Wykres log₁₀ CFU/ml w funkcji czasu (w godzinach).
5. Na wykresie zidentyfikuj wykładniczą fazę wzrostu. Używając 2 punktów czasowych w fazie wzrostu wykładniczego i odpowiadających im numerów komórek za każdym razem, oblicz średni czas wytwarzania.