Why is RT-PCR used to detect RNA viruses in environmental samples?

RT-PCR detects RNA viruses with high sensitivity because many pathogenic viruses like flu, Ebola, and HIV have RNA-based genomes instead of DNA. Most RNA viruses lack culture-based detection methods, making RT-PCR essential for identifying their presence in environmental samples. This technique converts RNA into complementary DNA (cDNA), enabling analysis using standard DNA detection technologies.

What are the two main steps in the RT-PCR procedure?

RT-PCR involves RNA extraction from biological samples, followed by reverse transcription into DNA. RNA extraction uses detergents to lyse cells and mechanical disruption, with proteinases breaking down viral capsids. The isolated RNA is then converted to cDNA using reverse transcriptase enzyme, which synthesizes complementary DNA from a primer sequence designed for specific genes or organisms.

How does RT-PCR help assess microbial gene expression in the environment?

RT-PCR measures messenger RNA (mRNA) levels to indicate which genes microbes are expressing in response to environmental changes. By monitoring alterations in gene expression, researchers can identify which biological pathways organisms use to survive harsh conditions and potentially perform bioremediation. This serves as an ecosystem assessor, revealing microbial activity and adaptation strategies in environmental samples.

What methods are used to purify RNA from environmental samples?

Two main RNA purification methods exist: acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction separates RNA into an aqueous phase through centrifugation, then precipitates it with alcohol. Column-based isolation passes lysate through a negatively charged silica resin where nucleic acids bind via salt bridges, then elutes using low-salt buffers. Single-stranded RNA can be preferentially eluted using specific buffer concentrations.

How are environmental samples collected for RT-PCR analysis?

Soil samples are collected using a hand auger pushed to predetermined depths, then sieved through 2-mm mesh to remove gravel. Water samples are collected in sterile bottles with volume noted and parameters like temperature, pH, and salinity tested immediately. Both sample types are labeled with location, date, time, and collection details, then transferred to the laboratory for microorganism concentration and RNA extraction.

What is reverse transcriptase and why is it essential for RT-PCR?

Reverse transcriptase is an enzyme naturally encoded by retroviruses like HIV that synthesizes complementary DNA (cDNA) from RNA templates using short primer sequences. This enzyme is essential because it converts chemically unstable RNA into stable DNA, enabling standard PCR amplification. The primer can be designed with specific sequences to detect particular genes or organisms of interest in environmental samples.

What are practical applications of RT-PCR in environmental microbiology?

RT-PCR enables ecological health assessment, environmental risk evaluation, and biodiversity conservation by identifying RNA-based microorganisms. It monitors native microbial gene expression in bioremediation projects to understand contaminant breakdown pathways. RT-PCR also supports public health surveillance of viral threats like Avian Influenza in wild birds and characterizes biopesticides targeting agricultural pests through viral load confirmation.

Analiza RNA próbek środowiskowych za pomocą RT-PCR

0 wyświetleń12:04 min

1. Pobieranie próbek: próbka gleby

Znajdź przykładową lokalizację za pomocą GPS, współrzędnych lub wzroku.
W przypadku losowego pobierania próbek wybierz losowe punkty na obszarze, aby uzyskać ogólny spis siedlisk drobnoustrojów. Próbkowanie transektu jest pobierane z punktów wzdłuż linii prostej, e.g., przylegających do koryta strumienia. Próbki siatkowe są systematycznie pobierane z punktów w regularnych odstępach czasu i są przydatne do mapowania społeczności drobnoustrojów na nieznanym lub zmiennym obszarze.
Pobieranie próbek na głębokości 3-6 cali (7,5-15 cm) zapewnia dostęp do najobfitszej aktywności mikrobiologicznej, która występuje w pobliżu, ale nie w ryzosferze (wąskim obszarze gleby bezpośrednio dotkniętym korzeniami roślin i związanymi z nimi mikroorganizmami).
Aby pobrać próbkę gleby, wepchnij i przekręć ręczny świder w ziemię na określoną głębokość.
Podnieś ślimak. Gleba znajduje się w pustej trzpieniu ślimaka.
Zeskrob ziemię z dna ślimaka do worka na glebę. Pamiętaj, aby nie dotykać ani nie zanieczyszczać gleby.
Odpowiednio oznacz torbę lokalizacją, imieniem i nazwiskiem, datą i godziną.
W laboratorium przepuść glebę przez sito o średnicy 2 mm, aby usunąć żwir i skały.
Przeanalizuj część gleby pod kątem wilgotności gleby. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tego kroku, zapoznaj się z filmem JoVE Science Education na temat wilgotności gleby.

2. Pobieranie próbek: próbka wody

Znajdź lokalizację próbki za pomocą GPS, współrzędnych lub wzroku.
Zbierz wodę do butelki do przechowywania. Zapisz objętość zebranej wody; Jeżeli drobnoustroje w próbce są oznaczane ilościowo, stężenie drobnoustrojów można określić na podstawie pobranej objętości.
Natychmiast przetestuj wodę pod kątem wszelkich parametrów wymaganych w eksperymencie (temperatura, pH, przewodność, zasolenie, zawartość azotu i fosforu itp.) za pomocą odpowiednich sond elektronicznych.
Umieść butelkę zawierającą próbkę wody w chłodziarce z lodem. Przenieś chłodziarkę do laboratorium.

3. Ekstrakcja RNA

Aby zebrać i zagęścić mikroorganizmy z próbki środowiskowej, zapoznaj się z filmem JoVE Science Education na temat ekstrakcji kwasów nukleinowych.
Wyodrębnij RNA z wirusów za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji zgodnie z instrukcjami producenta.
Krótko mówiąc, najpierw wymieszaj próbki z buforem do lizy uzupełnionym etanolem, a następnie dodaj próbki do kolumn wirowych.
Odwirować kolumny przy stężeniu około 12 000 x g, odrzucić przepływ. Dodaj bufor do płukania do kolumn i ponownie odwiruj.
Dodaj wodę wolną od RNaz do kolumn i wiruj przez 30 sekund, aby wymyć RNA do sterylnych 1,5 ml probówek do mikrofug o niskiej przyczepności.

4. Odwrotna transkrypcja - PCR

Pobrać następujące odczynniki z zamrażarki w temperaturze -20 °C: dNTP, skoncentrowany (e.g., 10x) bufor do odwrotnej transkrypcji, startery (w tym przykładzie startery losowe). Rozmrozić je na lodzie lub w temperaturze pokojowej w czystym kapturze, a po rozmrożeniu trzymaj na lodzie. Odzyskaj również odwrotną transkryptazę i inhibitor RNazy i trzymaj je na lodzie.
Oblicz objętości odczynników potrzebne do wytworzenia "mieszanki wzorcowej", która łączy wszystkie odczynniki stałe w każdej reakcji (patrz Tabela 1 dla próbki reakcji). Przygotować wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej dla każdej próbki, jak również reakcje kontroli pozytywnej (przy użyciu znanego szablonu transkrypcji) i kontroli negatywnej (e.g., bez odwrotnej transkryptazy, z samą wodą jako matrycą itp.). Uwzględnij dodatkowe 10% objętości.
Zmontuj mieszankę wzorcową w 1,5 ml probówkach do mikrofuge o niskiej przyczepności. Minimalizuje to wiązanie cząsteczek odczynnika z plastikowymi ściankami probówek.
Po rozmrożeniu odczynników dodaj obliczone objętości do probówki do mikrofuge. Delikatnie zwiruj i odwiruj każdą probówkę przed dodaniem. Pamiętaj, aby wymieniać końcówki pipet między dodawaniem każdego odczynnika, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
Po dodaniu wszystkich odczynników należy zwirować i odwirować mieszankę główną, aby zapewnić jednorodną mieszaninę. Umieść odczynniki z powrotem w magazynie w temperaturze -20 °C.
Przygotować i oznaczyć 8-probówkowe paski PCR, wyznaczając jedną probówkę dla każdej próbki lub reakcji kontrolnej.
Do każdej probówki wsypać równą objętość mieszanki wzorcowej. Następnie dodaj składniki specyficzne dla reakcji, takie jak ekstrakty RNA.
Umieść nasadkę paska bezpiecznie na pasku PCR i odwiruj w miniwirówce z adapterem probówki paskowej, aby upewnić się, że cały płyn został zebrany na dnie każdej probówki (Rysunek 2).
Umieść pasek PCR bezpiecznie w termocyklerze. Dociśnij, aby upewnić się, że rurki są zabezpieczone.
Ustaw termocykler tak, aby uruchamiał program odpowiedni dla używanego RT (patrz Tabela 2 dla przykładowego protokołu). Po zakończeniu programu probówki będą zawierały produkty cDNA, które można następnie poddać amplifikacji PCR. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z filmami JoVE Science Education na temat PCR i ilościowego PCR. Przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

Rysunek 2. Zamknięty 8-tubowy pasek zawierający mieszankę wzorcową i ekstrakt.

Odczynnik	Objętość na 1 reakcję (μL)
10x Bufor RT	2.0
25x dNTPs	0.8
10x Losowy Elementarz	2.0
Multiscribe	1.0
Inhibitor rnazy	1.0
Klasa molekularna H₂O	3.2
Całkowita objętość	10