Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)

1. Faza mobilna

1. Przygotować fazę ruchomą, dodając 400 ml acetonitrylu do około 1,5 l oczyszczonej wody demineralizowanej.
2. Ostrożnie dodaj 2,4 ml lodowatego kwasu octowego do tego roztworu.
3. Rozcieńczyć roztwór do całkowitej objętości 2,0 l w kolbie miarowej oczyszczoną wodą demineralizowaną. Otrzymany roztwór powinien mieć pH od 2,8 do 3,2.
4. Dostosuj pH do 4,2, dodając 40% wodorotlenku sodu, kroplami za pomocą skalibrowanego cyfrowego pH-metru. Dodawaj bardzo powoli, gdy pH osiągnie 4,0. Powinno to zająć około 50 kropli.
5. Przefiltrować fazę ruchomą przez filtr membranowy Nylon 66 o grubości 0,47 μm w próżni, aby odgazować roztwór i usunąć ciała stałe, które mogłyby zatkać kolumnę chromatograficzną. Ważne jest, aby odgazować fazę ruchomą, aby uniknąć pęcherzyka, który mógłby spowodować pustkę w fazie stacjonarnej na wlocie kolumny lub przedostać się do komórki detektora, powodując niestabilność absorbancji UV.

2. Tworzenie rozwiązań składowych

Trzy składniki, które należy wykonać, to kofeina (0,8 mg/ml), benzoesan potasu (1,4 mg/ml) i aspartam (ester metylowy L-asparatylo-L-fenyloalaniny) (6,0 mg/ml). Stężenia te, po rozcieńczeniu w ten sam sposób, stawiają normy na poziomach znalezionych w próbkach napojów gazowanych.

1. Dodać 0,40 g kofeiny do kolby miarowej o pojemności 500 ml, a następnie rozcieńczyć do oznaczenia 500 ml wodą DI.
2. Dodać 0,70 g benzoesanu do kolby miarowej o pojemności 500 ml, a następnie rozcieńczyć do oznaczenia 500 ml wodą demineralizowaną.
3. Dodać 0,60 g aspartamu do kolby miarowej o pojemności 100 ml, a następnie rozcieńczyć do oznaczenia 100 ml wodą DI. Umieść ten roztwór w lodówce, aby uniknąć rozkładu podczas przechowywania.

3. Tworzenie 7 standardowych rozwiązań

Wszystkie trzy składniki mają różne współczynniki dystrybucji, co wpływa na to, jak każdy z nich oddziałuje z obiema fazami. Im większy współczynnik dystrybucji, tym więcej czasu komponent spędza w fazie stacjonarnej, co skutkuje dłuższymi czasami retencji w dotarciu do detektora.

1. Postępując zgodnie z tabelą w Tabeli 1, odpipetuj odpowiednią ilość każdego składnika do kolby miarowej o pojemności 50 ml.
2. Rozcieńczyć każdy z roztworów podstawowych do oznaczenia 50 ml na kolbach miarowych fazą ruchomą.
3. Wlać każdy roztwór wzorcowy do oznaczonych małymi fiolkami w stojaku na próbki.
4. Stojaki z próbkami należy przechowywać w lodówce, wraz z pozostałymi roztworami w kolbach miarowych o pojemności 50 ml.

4. Sprawdzanie początkowych ustawień systemu HPLC

1. Upewnij się, że linia kanalizacyjna znajduje się w pojemniku na odpady i nie jest poddawana recyklingowi z powrotem do fazy mobilnej.
2. Sprawdź, czy natężenie przepływu fazy ruchomej jest ustawione na 0,5 ml/min. Jest to wystarczająco wysokie, aby wszystkie szczyty mogły wymyć się w ciągu 5 minut i wystarczająco wolne, aby umożliwić uzyskanie dobrej rozdzielczości.
3. Sprawdzić, czy minimalne i maksymalne ciśnienie oraz natężenie przepływu są ustawione na prawidłowe wartości na panelu przednim systemu dostarczania rozpuszczalnika (pompy).
   1. Minimalne ustawienie ciśnienia: 250 psi (ma to na celu wyłączenie pompy w przypadku wystąpienia wycieku).
   2. Maksymalne ustawienie ciśnienia: 4 000 psi (ma to na celu ochronę pompy przed pęknięciem, jeśli dojdzie do zatkania).
4. Naciśnij "zero" na przednim panelu detektora, aby ustawić ślepą fazę (ślepa faza to czysta faza ruchoma).
5. Przepłukać strzykawkę o pojemności 100 μl wodą dejonizowaną, a następnie kilkoma objętościami jednego z wzorców roboczych do analizy i napełnić strzykawkę tym roztworem. Zacznij od 3 próbek jednoskładnikowych, co pozwala na zidentyfikowanie piku każdego składnika będącego przedmiotem zainteresowania.

5. Ręczne wstrzykiwanie próbki i zbieranie danych

1. Trzymając uchwyt wtryskiwacza w pozycji obciążenia, powoli wstrzyknąć 100 μl roztworu przez port przegrody.
2. Sprawdź, czy program do zbierania danych jest ustawiony na zbieranie danych przez 300 sekund, co daje wystarczająco dużo czasu na elucję wszystkich 3 pików przez detektor.
3. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia próby, obróć uchwyt wtryskiwacza do pozycji wstrzykiwania (która wstrzykuje próbkę do fazy mobilnej) i natychmiast kliknij "Rozpocznij próbę" w komputerowym programie do zbierania danych. W przypadku norm 1-3 tylko jeden z trzech kolejnych szczytów pojawia się na ekranie podczas biegu (Rysunek 1).
4. Po upływie 300 s zbiór danych wysyła monit o zapisanie pliku danych. Zapisz dane pod odpowiednią nazwą pliku (e.g., STD#1).
5. Zanotuj czas w sekundach dla szczytu każdej próby, który jest używany do identyfikacji tego składnika.
6. Wyjąć strzykawkę z przegrody i powtórzyć proces dla każdego z pozostałych wzorców roboczych, stosując ten sam czas dla chromatogramu, jaki został ustalony od pierwszego przebiegu.

Rysunek 1. Chromatogram 3 składników. Od lewej do prawej są to kofeina, aspartam i benzoesan.

6. Próbki dietetycznych napojów gazowanych

Diet Coca-Cola, Diet Pepsi i Coca-Cola Zero to "niewiadome". Zostały pozostawione na noc w otwartych pojemnikach, aby pozbyć się nasycenia dwutlenkiem węgla, ponieważ pęcherzyki nie są dobre dla systemu HPLC. W ten sposób w wystarczającym stopniu pozbywa się wszelkich gazów z próbek.

1. Pobrać około 2 ml dietetycznego napoju gazowanego do plastikowej strzykawki.
2. Przymocuj końcówkę filtra do strzykawki za pomocą Luer-Lok, przekręcając ją na miejscu.
3. Przepchnąć płyn ze strzykawki przez filtr do małej szklanej fiolki. W ten sposób pozbywa się niechcianych cząstek, które mogłyby potencjalnie zatkać kolumnę separacyjną.
4. Rozcieńczyć każdą próbkę równą ilością wody DI, tak aby miały 50% czystości.
5. Wstrzyknąć 100 μl próbki do pętli próbki i przeprowadzić próby z tymi samymi parametrami, co dla wzorców.

7. Obliczenia

1. Na podstawie stężeń roztworów składowych obliczyć stężenie wszystkich składników w wzorcach, w oparciu o rozcieńczenia, które zostały wykonane dla 7 próbek.
2. Określić powierzchnie pików na chromatogramach dla każdego wzorca i nieznanych próbek metodą trójkątną, która jest równa wysokości piku pomnożonej przez szerokość przy 1/2 wysokości (Rysunek 2). Po ustaleniu, który pik odpowiada każdemu składnikowi na podstawie czasu potrzebnego do pokazania odpowiedniego piku przez każdy składnik, wprowadź te obszary pików do komputerowego arkusza kalkulacyjnego.
3. Utwórz krzywe kalibracyjne powierzchni piku w funkcji stężenia (mg/L) w wzorcach dla wszystkich trzech składników.
4. Określ dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów dla każdej krzywej kalibracyjnej.
5. Obliczyć stężenie każdego składnika w dietetycznych napojach gazowanych na podstawie obszarów pików pokazanych w badaniach HPLC dla próbek. Pamiętaj, że soda dietetyczna została rozcieńczona 2-krotnie przed wstrzyknięciem do systemu HPLC.
6. Oblicz ilość w mg / l każdego składnika dietetycznych napojów gazowanych.
7. Na podstawie wyników oblicz miligramy każdego składnika znajdującego się w 12-uncjowej puszce napoju gazowanego. Załóżmy, że 12 uncji = 354,9 ml.

Rysunek 2. Podstawowy przykład wysokości i szerokości piku krzywej, które należy pomnożyć (wysokość piku razy szerokość na 1/2 wysokości).