Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
Źródło: Dr. Paul Bower - Uniwersytet Purdue
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest ważną metodą analityczną powszechnie stosowaną do rozdzi…
1. Faza mobilna
- Przygotować fazę ruchomą, dodając 400 ml acetonitrylu do około 1,5 l oczyszczonej wody demineralizowanej.
- Ostrożnie dodaj 2,4 ml lodowatego kwasu octowego do tego roztworu.
- Rozcieńczyć roztwór do całkowitej objętości 2,0 l w kolbie miarowej oczyszczoną wodą demineralizowaną. Otrzymany roztwór powinien mieć pH od 2,8 do 3,2.
- Dostosuj pH do 4,2, dodając 40% wodorotlenku sodu, kroplami za pomocą skalibrowanego cyfrowego pH-metru. Dodawaj bardzo powoli, gdy pH osiągnie 4,0. Powinno to zająć około 50 kropli.
- Przefiltrować fazę ruchomą przez filtr membranowy Nylon 66 o grubości 0,47 μm w próżni, aby odgazować roztwór i usunąć ciała stałe, które mogłyby zatkać kolumnę chromatograficzną. Ważne jest, aby odgazować fazę ruchomą, aby uniknąć pęcherzyka, który mógłby spowodować pustkę w fazie stacjonarnej na wlocie kolumny lub przedostać się do komórki detektora, powodując niestabilność absorbancji UV.
2. Tworzenie rozwiązań składowych
Trzy składniki, które należy wykonać, to kofeina (0,8 mg/ml), benzoesan potasu (1,4 mg/ml) i aspartam (ester metylowy L-asparatylo-L-fenyloalaniny) (6,0 mg/ml). Stężenia te, po rozcieńczeniu w ten sam sposób, stawiają normy na poziomach znalezionych w próbkach napojów gazowanych.
- Dodać 0,40 g kofeiny do kolby miarowej o pojemności 500 ml, a następnie rozcieńczyć do oznaczenia 500 ml wodą DI.
- Dodać 0,70 g benzoesanu do kolby miarowej o pojemności 500 ml, a następnie rozcieńczyć do oznaczenia 500 ml wodą demineralizowaną.
- Dodać 0,60 g aspartamu do kolby miarowej o pojemności 100 ml, a następnie rozcieńczyć do oznaczenia 100 ml wodą DI. Umieść ten roztwór w lodówce, aby uniknąć rozkładu podczas przechowywania.
3. Tworzenie 7 standardowych rozwiązań
Wszystkie trzy składniki mają różne współczynniki dystrybucji, co wpływa na to, jak każdy z nich oddziałuje z obiema fazami. Im większy współczynnik dystrybucji, tym więcej czasu komponent spędza w fazie stacjonarnej, co skutkuje dłuższymi czasami retencji w dotarciu do detektora.
- Postępując zgodnie z tabelą w Tabeli 1, odpipetuj odpowiednią ilość każdego składnika do kolby miarowej o pojemności 50 ml.
- Rozcieńczyć każdy z roztworów podstawowych do oznaczenia 50 ml na kolbach miarowych fazą ruchomą.
- Wlać każdy roztwór wzorcowy do oznaczonych małymi fiolkami w stojaku na próbki.
- Stojaki z próbkami należy przechowywać w lodówce, wraz z pozostałymi roztworami w kolbach miarowych o pojemności 50 ml.
4. Sprawdzanie początkowych ustawień systemu HPLC
- Upewnij się, że linia kanalizacyjna znajduje się w pojemniku na odpady i nie jest poddawana recyklingowi z powrotem do fazy mobilnej.
- Sprawdź, czy natężenie przepływu fazy ruchomej jest ustawione na 0,5 ml/min. Jest to wystarczająco wysokie, aby wszystkie szczyty mogły wymyć się w ciągu 5 minut i wystarczająco wolne, aby umożliwić uzyskanie dobrej rozdzielczości.
- Sprawdzić, czy minimalne i maksymalne ciśnienie oraz natężenie przepływu są ustawione na prawidłowe wartości na panelu przednim systemu dostarczania rozpuszczalnika (pompy).
- Minimalne ustawienie ciśnienia: 250 psi (ma to na celu wyłączenie pompy w przypadku wystąpienia wycieku).
- Maksymalne ustawienie ciśnienia: 4 000 psi (ma to na celu ochronę pompy przed pęknięciem, jeśli dojdzie do zatkania).
- Naciśnij "zero" na przednim panelu detektora, aby ustawić ślepą fazę (ślepa faza to czysta faza ruchoma).
- Przepłukać strzykawkę o pojemności 100 μl wodą dejonizowaną, a następnie kilkoma objętościami jednego z wzorców roboczych do analizy i napełnić strzykawkę tym roztworem. Zacznij od 3 próbek jednoskładnikowych, co pozwala na zidentyfikowanie piku każdego składnika będącego przedmiotem zainteresowania.
5. Ręczne wstrzykiwanie próbki i zbieranie danych
- Trzymając uchwyt wtryskiwacza w pozycji obciążenia, powoli wstrzyknąć 100 μl roztworu przez port przegrody.
- Sprawdź, czy program do zbierania danych jest ustawiony na zbieranie danych przez 300 sekund, co daje wystarczająco dużo czasu na elucję wszystkich 3 pików przez detektor.
- Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia próby, obróć uchwyt wtryskiwacza do pozycji wstrzykiwania (która wstrzykuje próbkę do fazy mobilnej) i natychmiast kliknij "Rozpocznij próbę" w komputerowym programie do zbierania danych. W przypadku norm 1-3 tylko jeden z trzech kolejnych szczytów pojawia się na ekranie podczas biegu (Rysunek 1).
- Po upływie 300 s zbiór danych wysyła monit o zapisanie pliku danych. Zapisz dane pod odpowiednią nazwą pliku (e.g., STD#1).
- Zanotuj czas w sekundach dla szczytu każdej próby, który jest używany do identyfikacji tego składnika.
- Wyjąć strzykawkę z przegrody i powtórzyć proces dla każdego z pozostałych wzorców roboczych, stosując ten sam czas dla chromatogramu, jaki został ustalony od pierwszego przebiegu.
Rysunek 1. Chromatogram 3 składników. Od lewej do prawej są to kofeina, aspartam i benzoesan.
6. Próbki dietetycznych napojów gazowanych
Diet Coca-Cola, Diet Pepsi i Coca-Cola Zero to "niewiadome". Zostały pozostawione na noc w otwartych pojemnikach, aby pozbyć się nasycenia dwutlenkiem węgla, ponieważ pęcherzyki nie są dobre dla systemu HPLC. W ten sposób w wystarczającym stopniu pozbywa się wszelkich gazów z próbek.
- Pobrać około 2 ml dietetycznego napoju gazowanego do plastikowej strzykawki.
- Przymocuj końcówkę filtra do strzykawki za pomocą Luer-Lok, przekręcając ją na miejscu.
- Przepchnąć płyn ze strzykawki przez filtr do małej szklanej fiolki. W ten sposób pozbywa się niechcianych cząstek, które mogłyby potencjalnie zatkać kolumnę separacyjną.
- Rozcieńczyć każdą próbkę równą ilością wody DI, tak aby miały 50% czystości.
- Wstrzyknąć 100 μl próbki do pętli próbki i przeprowadzić próby z tymi samymi parametrami, co dla wzorców.
7. Obliczenia
- Na podstawie stężeń roztworów składowych obliczyć stężenie wszystkich składników w wzorcach, w oparciu o rozcieńczenia, które zostały wykonane dla 7 próbek.
- Określić powierzchnie pików na chromatogramach dla każdego wzorca i nieznanych próbek metodą trójkątną, która jest równa wysokości piku pomnożonej przez szerokość przy 1/2 wysokości (Rysunek 2). Po ustaleniu, który pik odpowiada każdemu składnikowi na podstawie czasu potrzebnego do pokazania odpowiedniego piku przez każdy składnik, wprowadź te obszary pików do komputerowego arkusza kalkulacyjnego.
- Utwórz krzywe kalibracyjne powierzchni piku w funkcji stężenia (mg/L) w wzorcach dla wszystkich trzech składników.
- Określ dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów dla każdej krzywej kalibracyjnej.
- Obliczyć stężenie każdego składnika w dietetycznych napojach gazowanych na podstawie obszarów pików pokazanych w badaniach HPLC dla próbek. Pamiętaj, że soda dietetyczna została rozcieńczona 2-krotnie przed wstrzyknięciem do systemu HPLC.
- Oblicz ilość w mg / l każdego składnika dietetycznych napojów gazowanych.
- Na podstawie wyników oblicz miligramy każdego składnika znajdującego się w 12-uncjowej puszce napoju gazowanego. Załóżmy, że 12 uncji = 354,9 ml.
Rysunek 2. Podstawowy przykład wysokości i szerokości piku krzywej, które należy pomnożyć (wysokość piku razy szerokość na 1/2 wysokości).
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest bardzo wszechstronną techniką, która oddziela składniki mieszaniny ciekłej na podstawie ich różnych interakcji z fazą stacjonarną.
HPLC jest adaptacją chromatografii kolumnowej. W chromatografii kolumnowej kolumna jest wypełniona kulkami w mikroskali zwanymi fazą stacjonarną. Kulki fazy stacjonarnej są funkcjonalizowane grupami chemicznymi, które indukują interakcję między kulką a składnikami mieszaniny znajdującej się w fazie ciekłej lub ruchomej. Gdy mieszanina przepływa przez kolumnę, składniki inaczej oddziałują z fazą stacjonarną.
W HPLC chromatografia kolumnowa jest wykonywana przy wyższym natężeniu przepływu, a tym samym wyższym ciśnieniu, niż klasyczna chromatografia kolumnowa. Umożliwia to stosowanie mniejszych stacjonarnych kulek fazowych o większym stosunku powierzchni do objętości, co znacznie zwiększa interakcję fazy stacjonarnej i komponentów w fazie ruchomej.
Ten film wprowadzi podstawy działania HPLC, demonstrując separację składników różnych dietetycznych napojów gazowanych.
W laboratorium stosuje się dwa rodzaje HPLC: analityczne i preparatywne. W analitycznej HPLC przyrząd służy do identyfikacji składników o małej objętości, a analizowana próbka jest następnie odrzucana jako odpad. W preparatywnej HPLC przyrząd służy do oczyszczania mieszaniny, a pożądana ilość każdego składnika jest zbierana we frakcjach.
Oprzyrządowanie HPLC składa się z szeregu prostych elementów. Po pierwsze, faza ruchoma, przechowywana w zbiornikach rozpuszczalnika, jest pompowana przez system przez jedną lub więcej pomp ze stałym natężeniem przepływu. Próbka jest wstrzykiwana do strumienia fazy ruchomej przez wtryskiwacz próbki. Próbka, rozcieńczona fazą ruchomą, jest następnie dostarczana do kolumny HPLC, gdzie składniki próbki są rozdzielane. Komponenty są następnie analizowane przez detektor i albo zapisywane we frakcjach do późniejszego wykorzystania, albo przenoszone do butelki na odpady.
Kolumna HPLC jest kluczowym elementem systemu. Składa się z metalowego lub plastikowego cylindra, wypełnionego mikrokulkami fazy stacjonarnej lub żywicą chromatograficzną. Mieszanina próbek przepływa przez wypełnione złoże cząstek ze stałym natężeniem przepływu, a każdy składnik oddziałuje z fazą stacjonarną podczas przepływu.
Związki te w różny sposób oddziałują z fazą stacjonarną, a zatem przemieszczają się w dół kolumny do detektora z różną prędkością. Czas wymagany do wyjścia składnika z kolumny lub elucji jest nazywany czasem przechowywania. Wynikiem jest wykres czasu retencji w funkcji intensywności lub chromatogram. Czas przechowywania służy do identyfikacji komponentu. Wielkość piku, a konkretnie obszar pod pikiem, służy do ilościowego określenia ilości związku w roztworze początkowym.
Wybór fazy stacjonarnej zależy od właściwości składników w mieszaninie próbki. Najczęściej stosowaną fazą stacjonarną są kulki krzemionkowe, ponieważ są one obojętnym materiałem niepolarnym, który tworzy kulki w skali mikro i osiąga wystarczającą gęstość upakowania. Najczęstszym rodzajem HPLC jest chromatografia z odwróconymi fazami, która wykorzystuje hydrofobową fazę stacjonarną, zwykle kulki krzemionkowe z łańcuchami C18 połączonymi z powierzchnią kulek. Składniki są eluowane w kolejności malejącej polaryzacji.
Faza ruchoma stosowana w chromatografii z odwróconymi fazami jest zazwyczaj mieszaniną wody i rozpuszczalnika organicznego, takiego jak acetonitryl. W zależności od próbki, faza ruchoma może pozostawać w stałym stosunku wody i rozpuszczalnika organicznego, znanym jako tryb izokratyczny. Może to jednak prowadzić do szerokich szczytów – w przypadku wysokiej zawartości wody – lub nakładających się szczytów – w przypadku wysokiej zawartości substancji organicznych.
Stosunek fazy ruchomej może być również zmieniany liniowo lub skokowo podczas separacji, aby utworzyć ruchomy gradient fazy. Elucja gradientowa może zapobiec poszerzaniu się pików mniej polarnych składników, poprawiając w ten sposób separację i skracając czas elucji.
Teraz, gdy podstawy HPLC zostały nakreślone, technika HPLC zostanie zademonstrowana w laboratorium. W tym eksperymencie HPLC zostanie wykorzystana do oddzielenia i ilościowego określenia trzech powszechnych składników napojów dietetycznych.
Najpierw, aby przygotować fazę ruchomą, dodaj 400 ml acetonitrylu do 1,5 l oczyszczonej wody dejonizowanej. Następnie ostrożnie dodaj 2,4 ml lodowatego kwasu octowego. Rozcieńczyć roztwór do całkowitej objętości 2 l. Otrzymany roztwór powinien mieć pH od 2,8 do 3,2.
Doprowadzić pH do 4,2, dodając kroplami 40% NaOH do roztworu mieszającego za pomocą skalibrowanego pH-metru.
Przefiltruj fazę ruchomą przez filtr membranowy o grubości 0,47 μm pod próżnią, aby odgazować roztwór i usunąć ciała stałe, które mogłyby zatkać kolumnę. Ważne jest, aby odgazować roztwór, ponieważ pęcherzyki mogą powodować puste przestrzenie w fazie stacjonarnej lub przedostać się do komórki detektora i powodować niestabilność pomiarów.
Przygotuj trzyskładnikowe roztwory kofeiny, benzoesanu i aspartamu, które są trzema typowymi składnikami dietetycznych napojów gazowanych. Te roztwory składowe są następnie wykorzystywane do przygotowania roztworów wzorcowych, które zostaną wykorzystane do wyznaczenia niewiadomych. Przygotuj 500 ml roztworów kofeiny i benzoesanu.
Przygotować 100 ml roztworu składnika aspartamu. Przechowuj roztwór w lodówce, gdy nie jest używany, aby uniknąć rozkładu.
Następnie przygotuj 7 roztworów wzorcowych, każdy o innym stężeniu kofeiny, benzoesanu i aspartamu. Odpipetować odpowiednią ilość każdego składnika do kolby miarowej i rozcieńczyć do oznaczenia 50 ml fazą ruchomą.
Pierwsze 3 rozwiązania zawierają po jednym składniku, aby umożliwić identyfikację pików. Pozostałe 4 roztwory zawierają zakres stężeń wszystkich 3 składników, w celu skorelowania wysokości piku ze stężeniem.
Wlać każdy roztwór wzorcowy do oznaczonej etykietą fiolki w stojaku na próbki. Stojak na próbki z próbkami i pozostałymi roztworami należy przechowywać w lodówce.
Najpierw ustaw fazę mobilną i pojemniki na odpady. Upewnij się, że przewody kanalizacyjne są wprowadzane do pojemnika na odpady i nie są poddawane recyklingowi z powrotem do fazy mobilnej. Upewnij się, że wlotowy przewód fazy ruchomej jest podawany do pojemnika fazy ruchomej.
Sprawdź, czy natężenie przepływu fazy ruchomej jest ustawione na 0,5 ml/min. Takie natężenie przepływu umożliwi elucję wszystkich składników w ciągu 5 minut, ale jest wystarczająco wolne, aby zapewnić rozdzielczość poszczególnych pików.
Następnie sprawdź minimalne i maksymalne ciśnienie w systemie dostarczania rozpuszczalnika. Te ustawienia wyłączają pompę odpowiednio w przypadku wycieku lub zatkania.
Naciśnij "zero" na przednim panelu czujników, aby ustawić puste miejsce. Spłucz 100-? L strzykawka z wodą dejonizowaną, a następnie z kilkoma objętościami 1 z 7 roboczych wzorców. Następnie napełnić strzykawkę tym roztworem. Zacznij od 3 próbek jednoskładnikowych w celu zidentyfikowania piku każdego składnika.
Następnie należy ręcznie wstrzyknąć roztwór, umieszczając uchwyt wtryskiwacza w pozycji obciążenia. Powoli wstrzyknąć 100 ? L roztworu przez port przegrody.
Sprawdź, czy program do zbierania danych jest ustawiony na zbieranie danych przez 300 sekund, co zapewnia wystarczająco dużo czasu, aby wszystkie 3 piki wymywały się przez detektor. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia próby, obróć uchwyt wtryskiwacza do pozycji wstrzykiwania, aby wstrzyknąć próbkę do fazy ruchomej. Natychmiast kliknij "Rozpocznij wersję próbną" w programie do zbierania danych. Po zakończeniu skanowania powtórz proces dla każdego z 7 roztworów wzorcowych. Dla każdego z pierwszych 3 standardów pojawia się tylko jeden z 3 szczytów. Zwróć uwagę na położenie piku, który służy do identyfikacji komponentu.
Wybierz 3 próbki dietetycznych napojów gazowanych i pozostaw je na noc w otwartych pojemnikach, aby usunąć nasycenie dwutlenkiem węgla.
Po nocnym odgazowaniu pobierz około 3 ml każdego napoju dietetycznego do plastikowej strzykawki. Następnie przymocuj końcówkę filtra do strzykawki i przepchnij sodę przez filtr do szklanej fiolki, aby usunąć wszelkie cząstki stałe.
Rozcieńczyć 2 ml każdej próbki 2 ml fazy ruchomej, aby zmniejszyć stężenie sody o połowę.
Narysuj 100 ? L jednej z próbek sody do strzykawki i wstrzyknąć ją do pętli próbki. Uruchom próbę z identycznymi parametrami jak rozwiązania standardowe. Powtórzyć te czynności dla każdej próbki sody.
Po pierwsze, skoreluj obszary pików próbek wzorcowych ze znanymi stężeniami. W tym celu należy określić pola pików na chromatografach dla każdej próbki wzorcowej przy użyciu metody trójkątnej. Oblicz czasy wysokości piku przy szerokości przypadającej na połowę wysokości i użyj tej wartości jako powierzchni szczytu.
Korzystając z powierzchni piku i znanych stężeń, utwórz krzywą kalibracyjną dla każdego składnika i określ dopasowanie najmniejszych kwadratów dla każdej krzywej kalibracyjnej.
Oblicz stężenie każdego składnika w dietetycznych napojach gazowanych z obszarów szczytowych. Należy pamiętać, że wszystkie napoje gazowane zostały rozcieńczone 2-krotnie przed wstrzyknięciem do HPLC. Na podstawie tych wyników oblicz mg każdego składnika w 12-uncjowej puszce napoju gazowanego.
Nic dziwnego, że wszystkie 3 testowane napoje gazowane zawierały mniej więcej taką samą ilość konserwantu benzoesanu. Jednak produkty Coca-Coli zawierały więcej kofeiny. Obliczone wartości dla wszystkich komponentów były dobrze skorelowane z wartościami podawanymi przez producentów.
HPLC jest bardzo wszechstronnym instrumentem, który znajduje zastosowanie w szerokim zakresie analiz.
HPLC jest często stosowany do oczyszczania cząsteczek peptydów. W tym przykładzie przygotowano transbłonowe kompleksy peptydowe, a następnie ustabilizowano je poprzez oksydacyjne sieciowanie białek wiązaniami dwusiarczkowymi.
Białka rozpuszczano następnie w kwasie mrówkowym i oczyszczano za pomocą HPLC z odwróconymi fazami. Próbka została następnie eluowana za pomocą gradientu liniowego dwóch rozpuszczalników, a czystość potwierdzono za pomocą spektrometrii mas.
HPLC może być również stosowany do identyfikacji związków organicznych syntetyzowanych w laboratorium. W eksperymencie Millera-Ureya badano abiotyczną syntezę związków organicznych na pierwotnej ziemi. Pierwotne gazy, takie jak metan i amoniak, zostały wprowadzone do kolby zawierającej wodę, symulując wczesne oceany. Następnie zastosowano wyładowanie elektryczne, imitujące pioruny na pierwotnej ziemi.
Woda została następnie przeanalizowana za pomocą HPLC sprzężonej ze spektrometrią mas i porównana ze znanymi wzorcami aminokwasów. W tym eksperymencie zsyntetyzowano i zidentyfikowano 23 aminokwasy.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do HPLC. Teraz należy zapoznać się z podstawami uruchamiania instrumentu i analizowania danych wynikowych.
Dzięki za oglądanie!
Q1: How does HPLC separate components in a liquid mixture?
HPLC separates components based on their different interactions with a stationary phase. A liquid mobile phase is pumped through a column packed with small beads of stationary phase. Components interact differently with these beads and travel through the column at different rates, causing separation. The time each component takes to exit the column, called retention time, identifies the component.
Q2: What is the difference between analytical and preparative HPLC?
Analytical HPLC identifies components in a small sample volume, which is then discarded as waste. Preparative HPLC purifies a mixture and collects a desired amount of each component in fractions for later use. Both use the same separation principle but differ in their purpose and sample handling after analysis.
Q3: Why is degassing the mobile phase important in HPLC?
Degassing removes dissolved gases from the mobile phase before it enters the column. Bubbles in the mobile phase can create voids in the stationary phase or travel to the detector cell, causing measurement instability. Filtering the mobile phase through a membrane filter under vacuum effectively removes gases and solid particulates that could clog the column.
Q4: What does the chromatogram tell you about separated components?
A chromatogram plots retention time versus signal intensity. The retention time identifies each component, while the peak area quantifies the amount of compound in the original solution. By correlating peak areas to known concentrations using calibration curves principles and applications, you can determine unknown sample concentrations.
Q5: What is reversed-phase chromatography and when is it used?
Reversed-phase chromatography uses a hydrophobic stationary phase, typically silica beads with C18 chains bonded to the surface, paired with a polar mobile phase of water and organic solvent like acetonitrile. Components elute in order of decreasing polarity. This is the most common HPLC mode and works well for water-soluble samples.
Q6: How does gradient elution improve HPLC separation?
Gradient elution changes the mobile phase ratio linearly or stepwise during separation, increasing the organic solvent concentration over time. This prevents peak broadening of less polar components that occurs with constant isocratic conditions, thereby improving separation quality and shortening elution time for complex mixtures.
Q7: Why are smaller stationary phase beads used in HPLC compared to column chromatography?
HPLC operates at higher flow rates and pressures than classical column chromatography, enabling the use of smaller stationary phase beads. These micro-scale beads have a greater surface area to volume ratio, which greatly increases interaction between the stationary phase and sample components, improving separation efficiency and resolution.