Wykrywanie bakteriofagów w próbkach środowiskowych

Wirusy to zakaźne cząstki biologiczne, które są odpowiedzialne za wiele chorób, od przeziębienia i grypy, po zapalenie wątroby i HIV.

Wirusy to cząstki biologiczne składające się z genomu DNA lub RNA, owinięte w płaszcz białkowy znany jako kapsyd, czasami z dodatkową otoczką lipidową. Wirusy same w sobie nie mają zdolności metabolicznych ani reprodukcyjnych i muszą atakować żywe komórki i przejmować kontrolę nad ich maszynerią komórkową, aby stworzyć więcej swoich kopii.

Zarówno komórki prokariotyczne, takie jak bakterie, jak i komórki eukariotyczne, takie jak ludzkie, mogą być zakażone przez określone klasy wirusów. W szczególności bakteriofagi to wirusy, które infekują bakterie. Na przykład colifagi to te fagi, które infekują E. coli, powszechną bakterię jelitową, której niektóre szczepy mogą powodować zatrucie pokarmowe i co wskazuje na zanieczyszczenie wody w kale.

Chociaż same fagi nie są ogólnie znane jako chorobotwórcze u ludzi, istnieją dowody na to, że są one wiarygodnymi wskaźnikami zastępczymi dla chorobotwórczych enterowirusów, które są również przenoszone przez kał, ale trudne do oznaczenia. Dostępność stosunkowo szybkich i niedrogich metod oznaczania liczby bakteriofagów sprawia, że są one atrakcyjnym narzędziem do oceny zanieczyszczenia kałem w próbkach środowiskowych.

W tym filmie przedstawimy zasady oznaczania liczby fagów; zademonstrować protokół ilościowego oznaczania fagów, znany jako test płytki nazębnej; I wreszcie, poznaj kilka zastosowań nauki o środowisku do wykrywania i zliczania fagów i innych wirusów.

Bakteriofagi, podobnie jak wszystkie wirusy, muszą pasożytować na żywych komórkach, w tym przypadku na bakteriach, aby się rozmnażać.

Fagi robią to poprzez lądowanie i przyczepianie się do powierzchni komórki bakteryjnej oraz wstrzykiwanie do niej swojego materiału genetycznego. Po wejściu do komórki genom wirusa jest replikowany, a składniki białkowe kapsydu wirusa są wytwarzane, przy użyciu biochemicznej maszynerii komórki gospodarza. Po złożeniu cząstek faga są one uwalniane z bakterii, często poprzez lizę gospodarza i wybucha, zabijając przy tym komórkę gospodarza.

Szeroko stosowana metoda określania stężenia fagów w próbce wykorzystuje tę aktywność lityczną. W tej technice fag z próbki miesza się z bakteriami i miękkim agarem. Mieszaninę tę wylewa się na szalki Petriego ze zwykłym agarem jako substratem, a wierzchnia warstwa tworzy nakładkę.

Bakterie są w tak wysokim stężeniu, że tworzą ciągły trawnik. Bakterie powinny być pozyskiwane z hodowli, która znajduje się w logarytmicznej fazie wzrostu, aby zapewnić, że każda bakteria infekowana przez fagi jest żywa i umożliwia fagowi wytworzenie potomstwa.

Kiedy cząsteczka faga infekuje i ulega lizie bakterii, potomstwo faga rozprzestrzeni się na pobliskie komórki bakteryjne i będzie kontynuować infekcję. Miękki agar ogranicza dyfuzję cząsteczek fagów. W końcu utworzy się obszar oczyszczenia, znany jako tablica.

Jeśli fag zostanie rozcieńczony do wystarczająco niskiego stężenia, na trawniku bakteryjnym można zaobserwować dyskretne, pojedyncze płytki nazębne. Można je policzyć i wykorzystać do obliczenia liczby jednostek tworzących płytki nazębne lub PFU faga na ml oryginalnej próbki.

Teraz, gdy już wiesz, w jaki sposób fagi infekują bakterie i jak tę aktywność można wykorzystać do pomiaru stężenia fagów, przejdźmy do protokołu używania testu płytki nazębnej do zliczania fagów w próbkach wody środowiskowej.

Na dzień przed wykonaniem testu należy zaszczepić kolonię szczepu E. coli ATCC 15597 w 100 ml bulionu sojowego z tryptykazą w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Inkubować go z potrząsaniem w temperaturze 35 ? C z dnia na dzień.

3 godziny przed testem zaszczepić 1 ml nocnej kultury E. coli w świeżych 100 ml bulionu. Umieść tę nową kulturę w trzęsącej kąpieli wodnej o temperaturze od 35 do 37 °C. Gwarantuje to, że bakterie znajdują się w logarytmicznej fazie wzrostu w momencie rozpoczęcia testu.

Aby rozpocząć test płytki nazębnej, należy wykonać 10- i 100-krotne seryjne rozcieńczenia próbki wody, używając 9 ml buforu Tris.

Korzystając z łaźni parowej, rozpuść trzy 5-mililitrowe probówki z 0,7% miękkim agarem, sojowym tryptykazą lub agarem odżywczym. Po stopieniu umieścić w łaźni wodnej w temperaturze od 45 do 48 ? C przez co najmniej 15 minut, aby temperatura agaru spadła do 45 ?C.

Do pierwszej probówki miękkiego agaru dodać 1 ml wcześniej przygotowanej kultury E. coli w fazie logarytmicznej i 1 ml próbki nierozcieńczonej wody. Wyjmij rurkę z łaźni wodnej i delikatnie kołysz się w dłoniach przez 2-3 sekundy, aby wymieszać zawiesinę.

Miękki agar wylać na wcześniej przygotowaną szalkę Petriego z agarem sojowym lub odżywczym. Szybko obróć płytkę, aby rozprowadzić, upewniając się, że pokrywa całą powierzchnię.

Powtórzyć inokulację i posiew dla pozostałych dwóch probówek, używając 1 ml każdej z rozcieńczonych próbek.

Gdy górny agar zastygnie, odwróć szalki i inkubuj je w temperaturze 37 ? C przez 48 godzin.

Po inkubacji policz liczbę plag na każdej płytce. Na podstawie zliczania oblicz stężenie faga w oryginalnej próbce

Na przykład, jeśli z 10-krotnej płytki rozcieńczającej uzyskano 9 płytek, to w oryginalnej próbce wody jest 9 razy 10 podzielone przez 1 ml lub 90 PFU/ml kolifagu.

Teraz, gdy już wiesz, jak przeprowadza się testy płytek fagowych, przyjrzyjmy się, jak testy płytek nazębnych można wykorzystać do wyliczenia fagów i innych typów wirusów z różnych źródeł.

Metody oparte na testach płytki nazębnej można stosować do izolowania bakteriofagów z różnych próbek środowiskowych, takich jak gleba. W tym przykładzie naukowcy najpierw zebrali fagi z gleby za pomocą filtracji. Fag został następnie wykorzystany do zakażenia pospolitej bakterii glebowej Arthrobacter w teście płytki nazębnej. Fagi zostały wybrane z pojedynczych płytek i rozsypane na nowych płytkach agarowych, a następnie pokryte górnym agarem zawierającym bakterie. Stężenie faga zmniejsza się na całej długości smugi, tak że można uzyskać dyskretne blaszki, prawdopodobnie utworzone przez pojedynczy rodzaj faga. Te pojedyncze blaszki można następnie pobrać w celu dalszej analizy znajdujących się w nich fagów.

Oprócz bakteriofagów można również przeprowadzać testy płytki nazębnej w przypadku innych wirusów, w tym tych, takich jak grypa, które infekują ssaki. Aby to zrobić, komórki ssaków są najpierw hodowane jako monowarstwy w naczyniach do hodowli tkankowych. Pożywki zawierające wirusy są następnie dodawane do komórek, aby umożliwić zakażenie, zanim komórki zostaną pokryte pożywką unieruchamiającą, taką jak agaroza przypominająca żel. Po okresie inkubacji, który może trwać do dwóch tygodni, zainfekowane komórki są utrwalane i barwione, aby umożliwić wizualizację i policzenie blaszek.

Wreszcie, oprócz próbek pobranych ze środowiska, testy płytki nazębnej są przydatne do wykrywania i zliczania wirusów w próbkach tkanek od zakażonych osób. Tutaj naukowcy uzyskali i zhomogenizowali tkanki płucne myszy zakażonych gamma-herpeswirusami. Ten homogenat zawierający wirusa został następnie wykorzystany do zakażenia hodowli komórek ssaków. Liczba blaszek miażdżycowych może być następnie policzona, aby oszacować miano wirusa w zakażonych tkankach płucnych.

Właśnie obejrzeliście film JoVE na temat wykrywania bakteriofagów w próbkach środowiskowych. Powinieneś teraz zrozumieć podstawową biologię fagów, jak wykonać test płytki w celu ilościowego określenia fagów w próbce środowiskowej oraz jak testy płytkowe mogą być wykorzystywane do badania fagów i innych wirusów w próbkach środowiskowych lub klinicznych. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!