Wykrywanie bakteriofagów w próbkach środowiskowych

1. Pobrać próbkę ścieków lub wody zawierającej colifag.
2. Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:10 i 1:100 za pomocą buforu Tris. W tym celu należy przenieść 1,0 ml kultury do 9 ml buforu Tris, a następnie wykonać drugie 10-krotne rozcieńczenie.
3. Rozpuść trzy probówki miękkiego agaru (0,7% agaru odżywczego lub agaru sojowego z tryptykazą na probówkę o pojemności 3 ml), umieszczając je w łaźni parowej lub autoklawie.
4. Umieść agar w łaźni wodnej o temperaturze 45-48 °C na 15 minut, aby temperatura agaru dostosowała się do 45 °C.
5. Do pierwszej probówki dodać 1 ml bulionowej kultury E. coli¹ w fazie logarytmicznej i 1 ml nierozcieńczonej próbki.
6. Wyjmij rurkę z łaźni wodnej i delikatnie kołysz się w dłoniach, aby mieszać zawiesinę przez 2-3 s.
7. Wytrzyj wodę z probówki ręcznikiem papierowym i wylej agar na wcześniej przygotowaną szalkę Petriego zawierającą agar dolny (zwykły agar odżywczy lub agar sojowy z tryptykazą).
8. Szybko obróć płytkę, aby rozprowadzić górny agar. Upewnij się, że agar pokrywa całą powierzchnię.
9. Powtórz kroki 5-8 z pozostałymi dwiema probówkami miękkiego agaru, używając 1 ml bakterii i 1 ml każdej próbki rozcieńczonej (rysunek 2).
10. Po zestaleniu się agaru odwrócić szalki Petriego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Strząsnąć wilgoć z pokrywki szalki Petriego. Jeśli kropla wilgoci spadnie na płytkę nazębną, spowoduje to rozprzestrzenienie się wirusa po powierzchni agaru.
11. Po inkubacji należy policzyć liczbę blaszek w każdym rozcieńczeniu (rysunek 3) i obliczyć stężenie faga w pierwotnej próbce. Zapisz wszelkie większe różnice w rozmiarze lub wyglądzie tabliczek.

Rysunek 2. Procedura przygotowania trawnika bakteryjnego przy użyciu górnego agaru do oznaczania liczby colibage.

Rysunek 3. Blaszki fagowe na trawniku bakteryjnym.

¹Szczep E. coli ATCC 15597 zazwyczaj wytwarza największą liczbę blaszek z próbek ścieków. Powinien być hodowany przez noc w 250-mililitrowej kolbie Erlenmeyera zawierającej 100 ml składnika odżywczego lub bulionu sojowego z tryptykazy i inkubowany w warunkach wstrząsania w temperaturze 35 °C. 3 godziny przed testem fagowym zaszczepić jeden ml tej kultury w świeżej kolbie zawierającej 100 ml składnika odżywczego lub bulionu sojowego z tryptykazy i umieścić w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 35-37 °C. Zapewni to, że bakterie znajdują się w fazie logarytmicznej wzrostu.